Mikroinjektion Techniken zur Untersuchung Mitose in der Drosophila melanogaster Syncytial Embryo
15. September 2009
Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung von Mikroinjektion und hochauflösende Bildgebung in der Drosophila melanogaster Syncytial Embryo Mitose studieren.
Dieses Verfahren beginnt mit der Entnahme der Embryonen auf frischen Traubensaftplatten von 30 bis 60 Minuten. Nachdem Sie die Platte aus dem Seekäfig genommen haben, nehmen Sie die Embryonen mit einer angefeuchteten Bürste auf und legen Sie sie auf doppeltes Klebeband. Rollen Sie einen Embryo vorsichtig mit einer halben Pinzette über das Klebeband, bis der Korion aufbricht.
Nehmen Sie den Embryo und legen Sie ihn vorsichtig auf die Abdeckung. Schieben Sie eine Schicht Kleber darüber. Wiederholen Sie dies, bis Sie genügend Embryonen haben.
Nach der Dehydrierung sind die Embryonen bereit für die Injektion. Hallo, ich bin Ingrid Bruce Musher aus dem Labor von Dr.Jonathan Sculley in der Abteilung für Molekular- und Zellbiologie an der University of California Davis. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Mikroinjektion von Drosophilas-Synzytial-Embryonen.
Wir verwenden dieses Verfahren, um die Rolle von Mikromotoren und Mitralmotoren bei der Mitose zu untersuchen. Zum Beispiel injizieren wir Antikörper oder andere Inhibitoren bestimmter mitotischer Proteine. Durch die Analyse der inhibitorischen Wirkung auf die Mitose sind wir in der Lage, die Funktion der Zielproteine zu bestimmen.
Also lasst uns loslegen. Um zwei bis drei Tage vor dem Experiment mit den Vorbereitungen zu beginnen, richten Sie den Legekäfig ein, indem Sie zwei kleine Löcher von etwa einem Zentimeter im Quadrat an gegenüberliegenden Seiten einer Plastikflasche schneiden. Füllen Sie die Löcher mit einem Baumwollstück, damit die Luft strömen kann.
Die Fliegen in die Flasche klopfen und dann mit einer Traubensaftplatte abdecken. Halten Sie den Beinkäfig bei Raumtemperatur, da Fliegen mindestens einen Tag vor dem Experiment bis zu 10 Tage lang Eier legen. Ziehen Sie die Nadeln für die Injektion und halten Sie sie bei vier Grad Celsius.
Bereiten Sie am Tag des Experiments die Nadeln vor und laden Sie sie. Nehmen Sie zuerst das etikettierte Tubulin aus dem Gefrierschrank und legen Sie es fünf bis 15 Minuten auf Eis. Verdünnen Sie es anschließend mit GPEM-Puffer und zentrifugieren Sie es dann 10 bis 15 Minuten lang bei 13.000 U/min und vier Grad Celsius.
Zum Schluss legst du ein bis zwei Mikroliter in die Nadel und hältst sie bei vier Grad Celsius. Um temperaturinduzierte Polymerisation in der Nadel zu verhindern. Bevor Sie das Deckglas anbringen, stellen Sie Heptankleber her, indem Sie doppeltes Klebeband einrollen und in eine 100-Milliliter-Flasche legen.
Fügen Sie etwa 50 Milliliter Heptan hinzu, verschließen Sie die Flasche und rocken Sie sie mehrere Tage lang. Bevor Sie die Embryonen vorbereiten, machen Sie eine Dehydrationskammer, in die die Embryonen vor der Injektion gelegt werden. Um dies zu tun, legen Sie einen Teil einer 35-Millimeter-Schale in eine 100-Millimeter-Petrischale, um einen Tischtrockner rechts hinzuzufügen, der mit wasserfreiem Kalziumsulfat umgeben ist, so dass die Höhe des Trockners rechts nicht höher ist als der Tisch und die Abdeckung.
Um mit der Vorbereitung der Embryonen zu beginnen, entnehmen Sie sie zunächst aus dem Seekäfig, indem Sie die Traubensaftplatte stündlich mit Hefe wechseln, die Embryonen sollten etwa zwei Stunden nach Beginn der Entnahme abgebildet werden. Um das Deckglas vorzubereiten, legen Sie es auf eine Seite eines Mikroskops, schieben Sie es und kleben Sie die vier Ecken nach unten, damit es sich nicht bewegt. Tragen Sie mit einem Applikator mit Baumwollspitze eine Schicht Heptankleber in einer Linie auf das Deckglas auf.
Der Kleber sollte nicht zähflüssig sein und in wenigen Sekunden trocknen. Wenn es zu dickflüssig ist, füge mehr Heptan hinzu. Zum Schluss kleben Sie ein Stück doppeltes Klebeband auf die Folie neben der Abdeckung.
Mit einer angefeuchteten Bürste gleiten lassen. Nehmen Sie die Embryonen vorsichtig von der Traubensaftplatte und legen Sie sie auf das doppelte Klebeband auf dem Objektträger. Als nächstes rollst du die Embryonen mit einer halben Pinzette über das doppelte Klebeband, bis die Creme aufbricht.
Nimm den Embryo auf, indem du ihn vorsichtig über den Corian rollst, so dass er an der Pinzette klebt, und lege ihn auf den Heptankleber auf der Abdeckung. Schieben Sie die lange Seite des Embryos parallel zur langen Seite des Deckglases. Setzen Sie 10 bis 20 Embryonen in eine Reihe.
Entfernen Sie den Deckglas und legen Sie ihn für drei bis acht Minuten in die Dörrkammer. Die Zeit hängt von der lokalen Luftfeuchtigkeit und der zu injizierenden Menge ab. Legen Sie anschließend den Deckglas mit Vakuumfett auf eine Metallkammer.
Zum Schluss bedecken Sie die Embryonen mit Halo-Kohlenstofföl, um eine weitere Austrocknung zu vermeiden. Die Embryonen sind nun bereit für die Injektion. Zuerst finden Sie die Embryonen unter einem 16-fachen Objektiv.
Bewegen Sie die Embryonen weg und finden Sie die Nadel, ohne die Brennebene zu bewegen. Zentrieren Sie die Nadel und bewegen Sie sie nach oben, ohne sie in X- oder Y-Richtung zu bewegen. Um die Nadel zu öffnen, legen Sie die Kante des Deckblatts in das Sichtfeld, aber nicht dort, wo sich die Nadel befinden wird.
Und senken Sie die Nadel auf die gleiche Fokusebene ab. Bewegen Sie den Deckglas sehr vorsichtig, bis er auf die Nadel trifft und sie vorsichtig aufbricht. Bewegen Sie die Nadel nach oben.
Bringen Sie nun die Embryonen ins Blickfeld. Senken Sie die Nadel in das Öl und stellen Sie sicher, dass Sie schöne Flüssigkeitstropfen aus der Nadel erhalten. Bewegen Sie den Embryo gleichmäßig in die Nadel, injizieren Sie einen Tropfen in den Embryo und bewegen Sie den Embryo dann weg.
Nachdem alle Embryonen injiziert wurden, sind sie bereit für die Betrachtung an einem konfokalen Mikroskop mit einem 60- oder 100-fach-Objektiv. Ein Kontrollembryo sollte so aussehen wie der in diesem Film. Dies ist ein Embryo, der GFP-Tubulin und RFP-Histon exprimiert, aufgenommen mit einem 100-fachen Objektiv an einem konfokalen Spinning-Disc-Mikroskop.
Die angezeigte Gesamtzeit beträgt acht Minuten. Die Parzellen des Pol-zu-Pol-Abstands sind sehr gut reproduzierbar und ein zuverlässiges Maß für den Erfolg bei Kontrollembryonen. Sie sollten so aussehen wie die hier gezeigten für die Zyklen 11 bis 13.
In diesem Film ist ein weiterer Kontrollembryo zu sehen. Dieser exprimiert KLP 61 FGFP und injiziert r Domine Tubulin. Dies wurde ebenfalls mit einem 100-fach-Objektiv auf einer konfokalen rotierenden Scheibe aufgenommen, und die Gesamtzeit beträgt sieben Minuten.
Dieser Film wurde unmittelbar nach der Mikroinjektion aufgenommen, und der Gradient in der Konzentration von r Domine Tubulin ist zu Beginn des Films deutlich sichtbar. Diese Embryonen können verwendet werden, um die Hemmung von Klp 61 F nach Mikroinjektion von Klp 61 F Antikörpern zu untersuchen. Wir können den Verlust von Klp 61 FGFP aus den Spindeln sehen.
Wir haben Ihnen gerade gezeigt, wie Sie Drosophila-Inzisionsembryonen mikroinjizieren können. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, Kontrollen durchzuführen, zuerst die Injektion von Puffer oder Rutin allein zu üben und sicherzustellen, dass die Mitose normal durch die Zellen verläuft. Sobald alle Ihre Injektionen zuverlässig sind und keinen Schaden anrichten, können Sie einen Inhibitor injizieren und die Wirkung dieser speziellen Hemmung untersuchen.
Das war's also. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.
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Überblick
Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung von Mikroinjektion und hochauflösender Bildgebung im Drosophila melanogaster-Synzytialembryo zur Untersuchung der Mitose. Das Verfahren beinhaltet eine sorgfältige Handhabung von Embryonen, um eine erfolgreiche Bildgebung und Analyse zu gewährleisten.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Neurowissenschaften
- Entwicklungsbiologie
- Zellbiologie
Hintergrund
- Drosophila melanogaster ist ein Modellorganismus, der in der biologischen Forschung weit verbreitet ist.
- Das Verständnis der Mitose ist entscheidend für Erkenntnisse über Zellteilung und Entwicklung.
- Hochauflösende Bildgebungstechniken verbessern die Beobachtung zellulärer Prozesse.
- Die Mikroinjektion ermöglicht eine präzise Manipulation von Embryonen für experimentelle Zwecke.
Zweck der Studie
- Untersuchung der Dynamik der Mitose in Drosophila-Embryonen.
- Nutzung fortschrittlicher Bildgebungstechniken für detaillierte zelluläre Beobachtungen.
- Etablierung eines zuverlässigen Protokolls für zukünftige Studien in der Entwicklungsbiologie.
Verwendete Methoden
- Sammlung von Embryonen auf Traubensaftplatten.
- Mikroinjektion von Embryonen für experimentelle Manipulation.
- Hochauflösende Bildgebung zur Beobachtung mitotischer Prozesse.
- Sorgfältige Handhabung von Embryonen, um Schäden während der Vorbereitung zu vermeiden.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Visualisierung von Mitosephasen in Drosophila-Embryonen.
- Nachweis der Wirksamkeit von Mikroinjektionstechniken.
- Erkenntnisse über das Timing und die Regulierung der Zellteilung.
- Etablierung eines Rahmens für zukünftige Forschung zur embryonalen Entwicklung.
Schlussfolgerungen
- Das Protokoll ist effektiv für die Untersuchung der Mitose in Drosophila-Embryonen.
- Hochauflösende Bildgebung ist entscheidend für das Verständnis zellulärer Dynamiken.
- Diese Studie trägt zum breiteren Bereich der Entwicklungsbiologie bei.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
This protocol enables functional interrogation of mitotic proteins in a rapid, synchronous in vivo system, supporting target validation through phenotypic readouts of protein inhibition. The syncytial Drosophila embryo provides a disease-relevant system for mechanistic de-risking of mitotic targets, allowing assessment of protein function prior to lead identification. Quantitative imaging of spindle dynamics offers predictive confidence in target essentiality and pathway involvement.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables therapeutic hypothesis interrogation by visualizing loss-of-function phenotypes via protein-specific antibody microinjection.
- Operational Value: Supports biological de-risking through gradient-dependent phenotypic series resembling allelic mutants.
- Predictive Value: Facilitates target confidence assessment by correlating inhibition strength with mitotic defect severity.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized, reproducible mitotic readouts (pole-to-pole distance) for compound or inhibitor screening.
- Quantitative Output: Provides measurable, imaging-based endpoints enabling dose-response analysis of protein inhibition.
- Scalability: Allows parallel embryo preparation and imaging for medium-throughput functional validation.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Mitotic machinery conservation supports translational biomarker alignment with human cell division pathways.
- Preclinical Continuity: Enables mechanistic follow-up from genetic hits to functional validation in a living system.
- Risk-Adjusted Decisions: Helps prioritize targets based on phenotypic penetrance and specificity of inhibition.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery to validate mitotic targets before assay development and lead identification stages, leveraging in vivo functionality.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification and functional target validation via direct perturbation of mitotic proteins.
- Screening: Enables assay readiness through standardized, quantifiable mitotic imaging readouts.
- Analytics: Delivers objective, imaging-based measurements (e.g., spindle length) to compare experimental conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical work through conserved mitotic mechanisms and protein function conservation.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for iterative target validation across multiple mitotic regulators.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target function through direct, reversible protein inhibition in vivo.
- Operational Value: Ensures reproducibility via standardized embryo preparation and injection protocols.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by reducing mechanistic ambiguity in target pathways.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted target prioritization using phenotypic severity gradients.
Implementation Considerations
- Requires expertise in embryo handling, microinjection, and live confocal imaging.
- Dependent on microinjection apparatus, antifade oils, and high-resolution imaging systems.
- Necessitates cross-team standardization for embryo staging and injection consistency.
- Adaptation considerations include protein solubility, antibody functionality, and fluorescent tag compatibility.
- Practical limitations include embryo viability post-injection and potential diffusion barriers in larger embryos.
