Ein Multi-Kompartiment-ZNS-Neuron-Glia-Co-Kultur mikrofluidischen Plattform

Herstellung von mikrofluidischen Neuronen-Co-Kulturgeräten mit mehreren Kompartimenten beginnt mit der Definition von Reservoirs auf dem PMMA-Block mit einer Fräsmaschine, gefolgt von der Heißprägung von Mikrokanal-Arrays, die die Kompartimente verbinden. Nach der Vorbereitung der A-P-M-M-A-Form wird der A-P-D-M-S-Formmaster aus der PMMA-Form repliziert und mit Trichlorethylen beschichtet. Das fertige Gerät wird aus dem PDMS-Mold-Master repliziert und auf einer PDL-beschichteten A-Kulturplatte montiert.

Primäre E 16 bis 18 Rattenneuronen werden dann in das Soma-Kompartiment geladen und zwei Wochen lang kultiviert, bevor P ein bis zwei Ratten-Oligodendrozytenzellen auf den Axonschichten innerhalb des Axon-GGL-Kompartiments für die Co-Kultur hinzugefügt werden. Hallo, ich bin J Par vom Nano Bio Systems Laboratory in der Abteilung für Elektro- und Computertechnik an der Texas a and m University. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Herstellung einer mikrofluidischen Neuronen-Co-Kulturplattform mit mehreren Kompartimenten.

Wir verwenden dieses Verfahren in unserem Labor, um die Interaktion zwischen Neuronen und Gliazellen des Zentralnervensystems in vitro zu untersuchen. Also lasst uns loslegen. Um diesen Vorgang zu starten, verwenden Sie eine Mikrofräsmaschine, um 3,5 Millimeter tiefe Kammern herzustellen.

Definieren Sie im A-P-M-M-A-Block ein Soma-Kompartiment und sechs Axon-GGL-Kompartimente. Nachdem Sie die Kammern vorbereitet haben, beschallen Sie Isopropanol 10 Minuten lang, um Schmutz zu entfernen, machen Sie Mikrorippenstrukturen auf dem Objektträger mit herkömmlicher Fotolithographie und Nassätzverfahren und prägen Sie die Mikrorippenmuster aus dem Glas. Schieben Sie zuerst auf den PMMA-Master und richten Sie den PMMA-Formmaster und das Glassubstrat manuell aus.

Erhöhen Sie dann die Temperatur auf einer Heißpresse auf 115 Grad Celsius. Und sobald die Temperatur erreicht ist, tragen Sie fünf Minuten lang 0,5 Tonnen Gewicht auf. Nach fünf Minuten auf 40 Grad Celsius abkühlen und den Druck ablassen.

Beginnen Sie nun mit der Vorbereitung des PDMS-Masters. Mischen Sie das PDMS-Präpolymer mit seinem Härter im Verhältnis 10 zu eins und schneiden Sie den PMMA-Master in 50 Millimeter x 50 Millimeter große Blöcke. Legen Sie es mit einer Biegesäge in einen Behälter und gießen Sie die PDMS-Mischung auf den PMMA-Master. Legen Sie den Behälter 15 Minuten lang in ein Trockenmittel, das mit einer Vakuumpumpe und DGAs verbunden ist.

Zum Entfernen von Blasen, die während des PDMS-Mischprozesses entstehen. Sobald alle Blasen entfernt sind, stellen Sie das Fass für eine Stunde zur Polymerisation in einen auf 85 Grad Celsius geglätteten Ofen. Jetzt, da das PDMS vollständig ausgehärtet ist, ziehen Sie den PDMS-Master vom PMMA-Master-Dampfmantel ab, beschichten Sie den PDMS-Master, indem Sie ihn in ein Trockenmittel mit zwei bis drei Tropfen Trichlorethylen legen und 15 Minuten lang ein Vakuum anwenden.

Die Beschichtung des PDMS-Masters erleichtert die Freisetzung des endgültigen PDMS-Neuronen-Co-Kulturgeräts aus der PDMS-Master-Form. Nach der Beschichtung wird der PDMS-Master kurz mit Isopropylalkohol gespült, um überschüssiges Trichlorethylen zu entfernen, und mit Stickstoffgas getrocknet. Die Herstellung aus dem PDMS-Polymer ähnelt der Vorbereitung der PDMS-Master-Form, die im vorherigen Abschnitt beschrieben wurde. Beginnen Sie damit, das PDMS-Präpolymer mit dem Verdunkelungsmittel in einem Verhältnis von 10 zu eins zu mischen, und gießen Sie die PDMS-Mischung auf den PDMS-Master. Es ist wichtig, nicht zu viel PDMS zu gießen, damit die 3,5 Millimeter hohe PDMS-Struktur auf dem Master nicht vollständig eintaucht.

DGAs in einem Trockenmittel, das 15 Minuten lang mit einer Vakuumpumpe verbunden ist. Wenn alle Blasen entfernt sind, legen Sie das PDMS für eine Stunde zur Polymerisation in einen nivellierten Ofen mit 85 Grad Celsius, nehmen Sie das PDMS aus dem Ofen und lassen Sie es bei Raumtemperatur abkühlen. Ziehen Sie dann die PDMS-Neuronenkulturgeräte vorsichtig vom PDMS-Master ab.

Wickeln Sie die PDMS-Geräte in Paraform ein, um sie vor Staub oder Schmutz zu schützen. Zum Schluss schneiden Sie das mit Paraform umwickelte PDMS mit einer Bohrmaschine in Einzelstücke, die mit einer Klinge ausgestattet ist, und die Neuronen-Co-Kultur-PDMS-Geräte sind fast bereit für den Einsatz in Zellkulturplatten. Bevor Sie das Neuronen-Co-Kultur-PDMS-Gerät in eine Zellkulturplatte setzen, legen Sie das Gerät in den Plasmareiniger und setzen Sie es 90 Sekunden lang Luftplasma aus, um die Oberfläche hydrophil zu machen.

Diese Behandlung erleichtert das Befüllen der Mikrokanäle mit Nährmedien nach dem Zusammenbau auf Poly-de-Lycine-beschichteten Platten. Um das mit Plasma behandelte Gerät zu sterilisieren, tauchen Sie es 30 Minuten lang in 70%iges Ethanol und stellen Sie den Behälter in die sterile Biohaube. Nehmen Sie das Gerät nach 30 Minuten heraus und trocknen Sie es mit Stickstoffgas, das mit einem 0,2-Mikron-Millipore-Filter gefiltert wurde.

Legen Sie dann die getrockneten Geräte auf eine mit Poly-D-Lysin beschichtete Polystyrol-Sechs-Well-Kulturplatte und üben Sie sanften Druck aus, um eine dichte Abdichtung zwischen der Oberfläche der Kulturplatte und dem Geräteeis zu gewährleisten. Füllen Sie nun das Soma-Fach mit Nährmedien. Warten Sie ein oder zwei Minuten, um sicherzustellen, dass keine Blasen in den Mikrokanälen eingeschlossen sind.

Füllen Sie dann die sechs Axon-Glia-Kompartimente. Inkubieren Sie die mit Nährmedien gefüllten Geräte schließlich über Nacht in einem 37 Grad Celsius heißen Inkubator, um mögliche Rückstände oder giftige Rückstände zu entfernen. Nach der Inkubation über Nacht kann die Kultur gestartet werden, um die Zellbeladung in das Gerät vorzubereiten.

Verwenden Sie eine Pipette, um das Nährmedium aus den Soma- und Axon-Kammern zu aspirieren. Laden Sie dann 40 Mikroliter primärer Neuronenzellen des Vorderhirns von Ratten am 16. bis 18. Tag in das Soma-Kompartiment um die Mikrokanaleinlässe mit einer Luftdichte von 500 Zellen pro Quadratmillimeter. Es ist wichtig, das PDMS-Gerät beim Laden der Zellen nicht zu berühren, da dies die Dichtung zwischen dem Gerät und der Zellkulturplatte aufbrechen kann.

Diese mikroskopischen Aufnahmen zeigen Calcium- und gefärbte Neuronenzellen. Im Inneren des Soma-Kompartiments sind die Zellen gleichmäßig geladen und befinden sich in der Nähe der mikrofluidischen Kanäle. Inkubieren Sie die mit den Zellen bestückten Geräte 30 Minuten lang in einem 37 Grad Celsius heißen Inkubator, um die Zelladhäsion auf dem Substrat zu verbessern.

Füllen Sie nach dieser Inkubation alle Fächer mit Nährmedien. Halten Sie die im Gerät wachsenden Zellen bei 37 Grad Celsius in einem befeuchteten 5%CO2-Inkubator und wechseln Sie nur die Hälfte des Nährmediums alle drei oder vier Tage. Innerhalb der Axon-Gliakompartimente sollte ein dichtes axonales Netzwerk gebildet werden.

Nach zweiwöchiger Kultur, nach 14 Tagen Kultivierung, werden die primären Neuronen in vitro CLIA-Zellen hinzugefügt, bevor die Zellen geladen werden. Aspirieren Sie etwa 60 % des Kulturmediums aus den Kompartimenten. Oligodendrozyten wurden postnatal aus den Gehirnhälften von Sprague Dolly-Ratten präpariert. Am ersten bis zweiten Tag fügen Sie jedem Axon-Gliakompartiment fünf Mikroliter Oligodendrozytenzellen mit einer Luftdichte von 1000 Zellen pro Quadrat hinzu. Es muss millimetergenau darauf geachtet werden, das untere Substrat während des Ladens nicht mit der Pipette zu berühren, da es das nach der Zugabe der Oligodendrozyten auf dem Substrat gebildete axonale Netzwerk beschädigen, die Zellen eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius inkubieren und dann die Kompartimente auffüllen kann.

Wenn die Kulturmedien die Neuronen wie vor der Zugabe des CLIA weiter kultivieren, wechseln Sie nur die Hälfte der Kulturmedien alle drei oder vier Tage für zwei weitere Wochen, während Sie das zentrale Nervensystem von Säugetieren untersuchen. Axon-Glia-Wechselwirkung, wenn Experimente richtig durchgeführt werden. Neuronenzellen, die in das Soma-Kompartiment geladen sind, befinden sich in der Nähe von Mikrokanal-Einlässen und eine axonale Schicht beginnt sich innerhalb der Axon-Ggl-Kompartimente zu bilden.

Nach einer Woche Kultur können Anzeichen einer Neuronenzellaggregation im Soma-Kompartiment ein Hinweis darauf sein, dass Zellen nicht gesund sind, wenn sie Oligodendrozyten beladen. Nach zwei Wochen Neuronenkultur sollten die Axon-GGL-Kompartimente mit einer dichten Schicht von Axonen bedeckt und Oligodendrozyten auf die axonale Schicht geladen werden. Wir haben Ihnen gerade gezeigt, wie man eine Multikompartiment-Neurokokulturplattform herstellt und wie man sie zur Untersuchung der ZNS-Neuroglia-Interaktion in vitro verwendet.

Bei diesem Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, die Geräte vor Staub zu schützen und sie nicht zu lange in Ethanol zu sterilisieren, da sie die Bindung nicht verschlechtern können. Das wars. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Glück bei Ihren Experimenten.