Ein Multi-Kompartiment-ZNS-Neuron-Glia-Co-Kultur mikrofluidischen Plattform

Die Herstellung eines mehrkammerigen mikrofluidischen Neuronen-Kokulturgeräts beginnt mit der Definition der Reservoire auf dem PMMA-Block mittels einer Fräsmaschine, gefolgt von der Heißprägung von Mikrokanal-Arrays, die die Kammern verbinden. Sobald die A-P-M-M-A-Form vorbereitet wurde, wird der A-P-D-M-S-Formabdruck von der PMMA-Form abgeleitet und mit Trichlorethylen beschichtet. Das endgültige Gerät wird vom PDMS-Formabdruck abgegossen und auf einer mit PDL beschichteten Kulturschale montiert.

Primäre E 16 bis 18 Rattenneuronen werden anschließend in die Soma-Kammer geladen und zwei Wochen lang kultiviert, bevor P eins bis zwei Rattenoligodendrozytenzellen auf die axonalen Schichten innerhalb der Axon-ggl-Kammer zur Koe-Kultur gegeben werden. Hallo, ich bin J Par vom Nano-Bio-Systemlabor der Abteilung für Elektrotechnik und Informatik an der Texas A&M University. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Herstellung einer mehrkammerigen mikrofluidischen Plattform für die Koe-Kultur von Neuronen.

Wir verwenden dieses Verfahren in unserem Labor, um die Interaktion zwischen Neuronen und Gliazellen des zentralen Nervensystems in vitro zu untersuchen. Beginnen wir also. Um dieses Verfahren zu starten, verwenden Sie eine Mikrofräsmaschine, um 3,5 Millimeter tiefe Kompartimente herzustellen.

Definieren Sie im A-P-M-M-A-Block ein Soma-Kompartiment und sechs axonale ggl-Kompartimente. Nach der Vorbereitung der Kompartimente zentrifugieren Sie 10 Minuten lang und verwenden Sie Isopropanol, um Ablagerungen zu entfernen. Erzeugen Sie Mikrokammernstrukturen auf dem Objektträger mithilfe der konventionellen Fotolithographie und Nassätzverfahren, prägen Sie die Mikokammernmuster von der Glasoberfläche ab. Bringen Sie die Struktur zunächst auf den PMMA-Formkörper auf, richten Sie manuell den PMMA-Formkörper und das Glas-Substrat aus.

Erhöhen Sie dann die Temperatur auf einer Heißpresse auf 115 Grad Celsius. Sobald die Temperatur erreicht ist, tragen Sie fünf Minuten lang ein Gewicht von 0,5 Tonnen auf. Nach fünf Minuten kühlen Sie auf 40 Grad Celsius ab und entlasten den Druck.

Bereiten Sie nun den PDMS-Abdruck vor. Mischen Sie das PDMS-Präpolymer mit seinem Härter im Gewichtsverhältnis 10 zu 1, schneiden Sie den PMMA-Abdruck in Blöcke der Größe 50 Millimeter mal 50 Millimeter. Platzieren Sie diesen mithilfe einer Flexsäge in einem Behälter, gießen Sie die PDMS-Mischung auf den PMMA-Abdruck, stellen Sie den Behälter in einen Exsikkator, der an eine Vakuumpumpe und DGA angeschlossen ist, und belüften Sie ihn 15 Minuten lang.

Um Blasen zu entfernen, die während des Mischvorgangs von PDMS entstehen. Sobald alle Blasen entfernt sind, stellen Sie den Behälter für eine Stunde in einen waagerecht ausgerichteten Ofen bei 85 Grad Celsius, um die Polymerisation durchzuführen. Nachdem das PDMS vollständig ausgehärtet ist, lösen Sie den PDMS-Abdruck vom PMMA-Master ab, dampfen Sie den PDMS-Abdruck an, indem Sie ihn zusammen mit zwei bis drei Tropfen Trichlorethylen in einen Trockenschrank geben und 15 Minuten lang ein Vakuum anlegen.

Beschichten des PDMS-Originals erleichtert die Freisetzung des fertigen PDMS-Neuronen-Kokulturgeräts aus der PDMS-Originalform. Nach dem Beschichten wird das PDMS-Original kurz mit Isopropylalkohol gespült, um überschüssiges Trichlorethylen zu entfernen, und mit Stickstoffgas getrocknet. Die Herstellung des Neuronen-Kokulturgeräts aus dem PDMS-Polymer ist vergleichbar mit der Herstellung der PDMS-Originalform, wie im vorherigen Abschnitt beschrieben. Beginnen Sie damit, das PDMS-Präpolymer mit einem Abdeckmittel im Gewichtsverhältnis von 10 zu 1 zu mischen, und gießen Sie die PDMS-Mischung anschließend auf das PDMS-Original. Es ist wichtig, nicht zu viel PDMS zu gießen, damit die 3,5 Millimeter hohe PDMS-Struktur auf dem Original nicht vollständig eingetaucht wird.

DGAs in einem mit einer Vakuumpumpe verbundenen Exsikkator 15 Minuten lang behandeln. Wenn alle Blasen entfernt sind, das PDMS in einen waagerecht ausgerichteten Ofen bei 85 Grad Celsius zur Polymerisation für eine Stunde geben. Nach Ablauf der Stunde das PDMS aus dem Ofen nehmen und bei Raumtemperatur abkühlen lassen. Anschließend die PDMS-Neuronenkulturvorrichtungen vorsichtig vom PDMS-Abformwerkzeug ablösen.

Verpacken Sie die PDMS-Vorrichtungen mit Parafilm, um sie vor Staub oder Schmutz zu schützen. Schneiden Sie das mit Parafilm umwickelte PDMS anschließend mit einer Bohrmaschine, die mit einer Klinge ausgestattet ist, in einzelne Stücke. Die PDMS-Vorrichtungen für die Neuronen-Kokultur sind danach nahezu bereit für die Verwendung in Zellkulturschalen. Bevor die PDMS-Vorrichtung für die Neuronen-Kokultur in eine Zellkulturschale eingebracht wird, platzieren Sie die Vorrichtung in den Plasma-Reiniger und behandeln Sie sie 90 Sekunden lang mit Luft-Plasma, um die Oberfläche hydrophil zu machen.

Diese Behandlung erleichtert das Befüllen der Mikrokanäle mit Kulturmedien nach der Montage auf mit Poly-D-Lysin beschichteten Platten. Um das plasmabehandelte Gerät zu sterilisieren, tauchen Sie es 30 Minuten lang in 70 %igen Ethanol ein und bringen Sie den Behälter in die sterile Biosicherheitswerkbank. Nach 30 Minuten nehmen Sie das Gerät heraus und trocknen es mit einem über einen 0,2-Mikron-Millipore-Filter gefilterten Stickstoffgasstrom.

Als Nächstes die getrockneten Geräte auf eine mit Poly-D-Lysin beschichtete Polystyrol-Kulturschale mit sechs Vertiefungen legen und vorsichtig andrücken, um eine dichte Verbindung zwischen der Oberfläche der Kulturschale und dem Geräteeis sicherzustellen. Füllen Sie nun das Soma-Kompartiment mit Kulturmedium. Warten Sie eine oder zwei Minuten, um sicherzustellen, dass keine Blasen in den Mikrokanälen eingeschlossen sind.

Dann füllen Sie die sechs Axon-Glia-Kammern. Schließlich inkubieren Sie die mit Kulturmedium gefüllten Geräte über Nacht in einem Inkubator bei 37 Grad Celsius, um eventuelle Rückstände oder toxische Substanzen zu entfernen. Nach der Übernacht-Inkubation kann die Kultur vorbereitet werden, um die Zellen in das Gerät zu laden.

Verwenden Sie eine Pipette, um das Kulturmedium aus den Soma- und Axon-Kompartimenten zu aspirieren. Geben Sie anschließend 40 Mikroliter primäre Vorderhirn-Neuronenzellen von Ratten des embryonalen Tages 16 bis 18 in das Soma-Kompartiment um die Mikrokanal-Einlässe herum mit einer Flächendichte von 500 Zellen pro Quadratmillimeter. Es ist wichtig, das PDMS-Gerät während des Beladens der Zellen nicht zu berühren, da dies die Dichtung zwischen dem Gerät und der Zellkulturplatte beschädigen kann.

Diese mikroskopischen Aufnahmen zeigen mit Calcium gefärbte Neuronenzellen. Innerhalb des Soma-Kompartiments sind die Zellen gleichmäßig im Kompartiment verteilt und befinden sich in unmittelbarer Nähe zu den mikrofluidischen Kanälen. Inkubieren Sie die mit Zellen beladenen Vorrichtungen 30 Minuten lang in einem 37 Grad Celsius warmen Inkubator, um die Zelladhäsion an das Substrat zu verbessern.

Nach dieser Inkubation füllen Sie alle Kompartimente mit Kulturmedium auf. Kultivieren Sie die Zellen im Gerät bei 37 Grad Celsius in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % CO2 und wechseln Sie alle drei bis vier Tage jeweils die Hälfte des Kulturmediums. Innerhalb der Axon-Glia-Kompartimente sollte sich ein dichtes axonales Netzwerk bilden.

Nach zweiwöchiger Kultur, zwei Wochen nach der Kultivierung, werden die primären Neuronen in vitro CLIA-Zellen hinzugefügt, bevor etwa 60 % des Kulturmediums aus den Kompartimenten abgesaugt werden. Oligodendrozyten wurden aus den Großhirnhemisphären von Sprague-Dawley-Ratten postnatal am ersten bis zweiten Tag isoliert. Fügen Sie fünf Mikroliter Oligodendrozyten pro axonalen Glia-Kompartiment mit einer Flächendichte von 1000 Zellen pro Quadratmillimeter hinzu. Achten Sie darauf, beim Beladen mit der Pipette nicht das Bodensubstrat zu berühren, da dies das auf dem Substrat gebildete axonale Netzwerk beschädigen könnte. Nach Zugabe der Oligodendrozyten die Zellen eine Stunde bei 37 Grad Celsius inkubieren und anschließend die Kompartimente auffüllen.

Die Neuronen weiterhin mit Kulturmedium kultivieren, wie zuvor, jedoch alle drei oder vier Tage die Hälfte des Kulturmediums wechseln, und dies über einen Zeitraum von zwei weiteren Wochen hinweg, während das zentrale Nervensystem von Säugetieren untersucht wird. Bei sachgemäßer Durchführung der Experimente kommt es zur Interaktion zwischen Axonen und Gliazellen. Die in das Soma-Kompartiment eingebrachten Neuronenzellen sammeln sich nahe der Mikrokanal-Einlässe an, und eine axonale Schicht beginnt sich in den Axon-Glia-Kompartimenten zu bilden.

Nach einer Woche Kultur können Anzeichen einer Neuronen-Zellaggregation im Soma-Kompartiment darauf hindeuten, dass die Zellen nicht gesund sind, wenn Oligodendrozyten beladen werden. Nach zwei Wochen Neuronenkultur sollten die axonalen Kompartimente mit einer dichten Schicht von Axonen bedeckt sein, und Oligodendrozyten sollten auf der axonalen Schicht aufgebracht werden. Wir haben Ihnen soeben gezeigt, wie man eine mehrkompartimentelle Neuroko-Kulturplattform herstellt und wie man sie zur Untersuchung der Interaktion zwischen ZNS-Neuroglia in vitro verwendet.

Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, die Geräte vor Staub zu schützen und sie nicht zu lange in Ethanol zu sterilisieren, da dies die Bindung beschädigen könnte. Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.