Dissection der Imaginalscheiben vom 3. Instar Drosophila-Larven
February 17th, 2007
Dieses Protokoll zeigt die Dissektionstechnik zur Isolierung Imaginalscheiben von Drosophila-Larven im 3. Larvenstadium Stufe eingesetzt. Verfahren zur Festsetzung des Gewebes nach Worten und dem Entfernen der Flügel-, Bein-und Augen-Scheiben werden direkt auf einem Objektträger für spätere Visualisierung unter Beweis gestellt.
Heute zeige ich Ihnen, wie Sie imaginale Scheiben von Drosophila-Larven im dritten Stadium sezieren können. Larvenscheiben des dritten Stadiums können für eine Reihe von Entwicklungsprozessen verwendet werden. Wir schauen sie uns in unserem Labor an, um den Prozess der Apoptose zu sehen, aber man kann verschiedene Proteine in ihnen exprimieren und sie auf diese Weise untersuchen und alle möglichen Entwicklungsprozesse sehen, die in den Bandscheiben in der richtigen Reihenfolge ablaufen.
Um das zu tun, werde ich einige sehr wichtige Tools verwenden. Der erste ist der Pflückstock, mit dem wir die Larven aus ihren Schalen nehmen. Als nächstes ist die Präparierzange sehr wichtig, die extrem scharf sein muss, damit die Präparierung durchgeführt werden kann.
Dann verwenden wir eine chirurgische Klinge, Nummer 11, um die Bandscheiben vom Kopf zu entfernen. Und dann legen wir die Discs auf eine Folie mit einer Vektorabschirmung als Einhängemedium. Das erste, was wir also tun werden, ist, einige Drittel- und Sternwandernde, Drittel- und Sternlarven zu sammeln.
Ich benutze hier nur meinen Pickstock, um sie von der Seite des Fläschchens zu hebeln. Manchmal hilft es, wenn Ihr Stick ein wenig nass ist und geben Sie sie dann in einen Tropfen PBS. Okay, hier haben wir also unsere dritte Sternlarve.
Da ich Rechtshänder bin, werde ich seinen Kopf nach rechts drehen und wir werden ein paar Orientierungspunkte verwenden, um uns zu zeigen, wo wir ihn greifen sollen. Zuerst ist der Hauptteil der Luftröhre hier und hier. Und dann ist da oben ein kleiner Querschnitt zum Kopf hin.
Zuerst werde ich die Larven etwa zwei Drittel des Weges vom Kopf aus sanft am Körper greifen. Und dann greife ich mit der rechten Hand ein paar Millimeter hinter das Querbalken hier und versuche, etwa die Hälfte der Breite der Larven zu durchdringen. Das ist also ein ziemlich gutes Verständnis.
Sie können sehen, dass ich ungefähr die Hälfte geschafft habe. Dann ziehe ich mit meiner rechten Hand sanft nach vorne, sehe, wie alle Eingeweide da herauskommen. Okay. Der Hauptteil des Körpers kann nun entsorgt werden.
Und hier haben wir den Kopf, der die imaginären Scheiben umfasst, die an den Mundwerkzeugen befestigt sind. Also werde ich ihn an den Mundwerkzeugen packen, damit ich keine der Scheiben zerquetsche und ihn zu einem frischen Punkt PBS bringe. Jetzt haben wir also unseren festen Larvenkopf.
Wir nehmen das überschüssige Gewebe ab und fassen die Larve entweder wie bisher an den Mundstücken oder drücken sie mit der Pinzette gegen die Präparierplatte. Die Mundstücke befinden sich nun auf der linken Seite. Okay, hier haben wir also den Darm, den wir nicht wollen, und da ist eine Speicheldrüse.
Es gibt einen dicken Körper oder einen fetten Körper. Ziehen Sie einfach weiter weg, vor allem Fett, das einige Assays beeinträchtigen und alles färben kann, was Sie nicht möchten. Jetzt haben wir also den gereinigten Larvenkopf.
Jetzt haben wir also unsere Larvenköpfe, die vom Körper wegpräpariert, fixiert und gewaschen wurden, das Fremdgewebe entfernt und sie wurden mit dem behandelt, womit sie behandelt werden müssen, was eine Antikörperfärbung im C-Zwei-Tunnel oder eine andere funktionelle Färbung sein könnte. Und jetzt haben wir sie auf eine Folie gelegt und sind bereit, die eigentlichen Scheiben vom Kopf weg zu sezieren. Die Mundwerkzeuge.
Okay, diesmal sind unsere Mundwerkzeuge hier links. Ich nehme meine Pinzette und drücke sie einfach gegen die Rutsche. An meiner rechten Hand habe ich eine Skalpellklinge mit der Nummer 11, die auch ein etwas feineres Instrument ist, mit dem ich sezieren kann.
Zuerst werde ich also das ZNS und die Sehlappen entfernen. Und sehen Sie, da ist das ZNS, da sind die beiden Sehlappen, und hier sind die Augenantennenscheiben, die daran befestigt sind. Wenn ich also das ZNS entferne, indem ich meine Klinge zwischen die Sehlappen und die Augenscheiben stecke und langsam ziehe, dehnen sich die Augenscheiben dort irgendwie aus.
Okay, da haben wir also das ZNS und die Sehlappen. Jetzt haben wir also die beiden Augenscheiben, die vom ZNS gelöst wurden. Jetzt werde ich sie von den Mundwerkzeugen entfernen, indem ich einfach vorsichtig an der Basis schneide und ziehe.
Okay, es gibt also eine Augenantennenscheibe, die andere Augenscheibe. Okay. Und jetzt können wir sehen, wie hier die Flügelscheibe herausragt. Ich werde wieder vorsichtig den Basisschnitt finden und ziehen.
Da haben wir also eine Flügelscheibe und eine Beinscheibe daran befestigt, zusammen mit ein wenig Luftröhre. Okay, da ist also deine Flügelscheibe mit einer Beinscheibe, und es gibt offensichtlich mehrere Beinscheiben. Wir können also hier herumsuchen und mehr Scheiben finden, indem wir einfach vorsichtig mit der Klinge tasten.
Das sind alle Discs, die wir in diesem Spiel finden werden. Es gibt noch ein paar Beinscheiben.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Überblick
Dieses Protokoll demonstriert die Dissektionstechnik zur Isolierung von Imaginalscheiben aus Drosophila-Larven im 3. Larvenstadium. Methoden zur Fixierung des Gewebes nach Entfernung der Flügel-, Bein- und Augenscheiben werden direkt auf einem Objektträger für die anschließende Visualisierung demonstriert.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Neurowissenschaften
- Entwicklungsbiologie
- Genetik
Hintergrund
- Imaginalscheiben sind entscheidend für die Untersuchung von Entwicklungsprozessen bei Drosophila.
- Larven im 3. Larvenstadium bieten ein Modell zur Untersuchung von Apoptose und Proteinexpression.
- Dissektionstechniken sind wichtig für die Isolierung spezifischer Gewebe zur Analyse.
- Angemessene Werkzeuge und Methoden erhöhen die Genauigkeit von Dissektionen.
Zweck der Studie
- Zur Isolierung von Imaginalscheiben für Entwicklungsstudien.
- Zur Visualisierung und Analyse zellulärer Prozesse innerhalb der Scheiben.
- Zur Bereitstellung eines detaillierten Protokolls für Forscher auf diesem Gebiet.
Verwendete Methoden
- Verwendung eines Pinsels zum Extrahieren von Larven aus Schalen.
- Nutzung scharfer Präparierzangen für Präzision.
- Fixierung von Gewebe auf Objektträgern für die Visualisierung.
- Demonstration von Dissektionstechniken für Flügel-, Bein- und Augenscheiben.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Isolierung von Imaginalscheiben aus Larven.
- Effektive Visualisierung von Entwicklungsprozessen nach der Dissektion.
- Demonstration der Bedeutung der Werkzeugschärfe bei Dissektionen.
- Das Protokoll bietet eine Grundlage für weitere Forschung in der Entwicklungsbiologie.
Schlussfolgerungen
- Die Dissektionstechnik ist effektiv zur Isolierung von Imaginalscheiben.
- Angemessene Methoden verbessern die Untersuchung von Entwicklungsprozessen bei Drosophila.
- Dieses Protokoll dient als wertvolle Ressource für Forscher.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
This protocol provides a foundational method for isolating Drosophila imaginal discs, enabling mechanistic studies of developmental pathways and apoptosis. The technique supports target validation by allowing precise interrogation of gene function in a genetically tractable model system. It enhances predictive confidence in early discovery by facilitating phenotypic screening and pathway analysis relevant to conserved human disease mechanisms.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables functional interrogation of genes and pathways in a living tissue context to support target hypothesis testing.
- Operational Value: Provides a reproducible method for isolating specific tissues to reduce variability in downstream assays.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates isolated disc preparations suitable for protein expression studies and functional staining to assess compound effects.
- Operational Value: Standardizes tissue preparation for consistent readouts in apoptosis and developmental process screening.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports mechanistic de-risking by linking genetic perturbations to observable developmental phenotypes in a disease-relevant system.
- Operational Value: Facilitates continuity from gene discovery to functional validation in a genetically manipulable model.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery workflows where genetic and phenotypic screening inform target selection and lead identification efforts.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing through tissue-specific protein expression and phenotypic analysis in imaginal discs.
- Screening: Delivers standardized tissue samples for quantitative assessment of developmental processes and compound-induced phenotypes.
- Analytics: Produces isolatable tissues compatible with staining, imaging, and molecular readouts for pathway analysis.
- Translational Research: Connects genetic findings to phenotypic outcomes in a conserved developmental system relevant to human biology.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable tissue preparation platform for iterative screening and mechanistic studies across projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases target validation confidence through direct observation of developmental phenotypes in intact tissues.
- Operational Value: Improves assay reproducibility via standardized dissection and tissue mounting procedures.
- Strategic Value: Reduces false positives in target selection by providing functional validation in a physiological context.
- Portfolio Impact: Supports early go/no-go decisions by clarifying mechanism-of-action and phenotypic relevance.
Implementation Considerations
- Requires proficiency in microsurgical techniques and tissue handling to maintain sample integrity.
- Dependent on sharp dissection tools and clean PBS-based workflows to prevent tissue damage or contamination.
- Necessitates standardization across operators to ensure consistent disc isolation and mounting quality.
- Adaptable to various staining and fixation protocols depending on downstream assay requirements.
- Limited by the small tissue size, which may constrain multiplexed analytical approaches.
