Name: Reinigung von Mitochondrien aus Hefezellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-08-24T16:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 39 s
Description: Lernen Sie die Reinigung von Mitochondrien aus Saccharomyces cerevisiae durch Zellwandverdauung, Homogenisierung und Saccharose-Dichtegradienten-Zentrifugation. Diese Methode liefert hochreine, funktionell intakte Mitochondrien für zellbiologische und biochemische Analysen.

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Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus dem CIHR und der NSERC of Canada unterstützt. VIT ist ein CIHR New Investigator und Concordia University Research Chair in Genomics, Cell Biology and Aging.

Material und Methoden Hefestämme und Wachstumsbedingungen Der Wildtypstamm BY4742 (MATα his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0) wurde in den reichen YEPD Medium (1% Hefeextrakt, 2% Pepton, 2% Glucose). Die Zellen wurden bei 30 ° C mit Rotations-Schütteln bei 200 rpm in Erlenmeyer-Kolben bei einer &quot;Flasche Volumen / Medium Volume&quot;-Verhältnis von 5:1 kultiviert. Isolation von Roh-mitochondriale Fraktion <ol><li> Grow 1 L der Wildtypstamm BY4742 Kultur für 48 h </li><li> Gießen Kultur in 500-ml Nalgene Zentrifugenröhrchen. Balance der Last und Ernte Zellen durch Zentrifugation für 5 min bei 3000 xg bei Raumtemperatur. </li><li> Dekantieren Überstand und resuspendieren pelletierten Zellen in 250 ml dH2O. Pellet-Zellen durch Zentrifugation für 5 min bei 3000 xg bei Raumtemperatur. </li><li> Dekantieren Überstand und resuspendieren pelletierten Zellen in 250 ml dH2O. Pellet-Zellen durch Zentrifugation für 5 min bei 3000 xg bei Raumtemperatur. </li><li> Bestimmen Sie Nassgewicht Zellpellet. </li><li> Resuspendieren pelletierten Zellen in DTT-Puffer [2 ml Puffer / g (Feuchtgewicht) Zellen]. </li><li> Übertragen Sie die Zellsuspension auf 50-ml Falcon Rohre aus Kunststoff. </li><li> Drehen Sie das Röhrchen bei 70 rpm in einem Schüttler für 20 min bei 30 ° C. </li><li> Ernten Sie die Zellen durch Zentrifugation für 5 min bei 3000 xg bei Raumtemperatur. </li><li> Resuspendieren pelletierten Zellen in Zymolyase Puffer ohne Zymolyase [7 ml Puffer / g (Feuchtgewicht) Zellen]. </li><li> Pellet-Zellen durch Zentrifugation für 5 min bei 3000 xg bei Raumtemperatur. </li><li> Resuspendieren pelletierten Zellen in Zymolyase Puffer ohne Zymolyase [7 ml Puffer / g (Feuchtgewicht) Zellen]. </li><li> Transfer-Zell-Suspension in einem Glaskolben. </li><li> Fügen Sie die Pulver von Zymolyase-100T [1 mg Zymolyase-100T / g (Feuchtgewicht) Zellen], um die Zell-Suspension. </li><li> Drehen Sie den Kolben mit Zellsuspension bei 70 rpm in einem Schüttler für 30 min bei 30 ° C. </li><li> Transfer Sphäroplasten gebildet durch die Verdauung der Zellwand mit Zymolyase-100T bis 50-ml Kunststoff-Röhrchen. </li><li> Pellet Sphäroplasten durch Zentrifugation für 8 min bei 2200 xg bei 4 ° C. </li></ol> ** Alle weiteren Schritte sollten bei 4 ° C oder auf Eis durchgeführt werden. Suspensionen von Sphäroplasten sollten schonend behandelt, mit Pipetten mit geschnittenen Spitzen zu vermeiden brechen Organellen werden .** <ol start="18"><li> Resuspendieren pelletiert Sphäroplasten in eiskaltem Homogenisierungspuffer [6,5 ml Puffer / g (Feuchtgewicht) Zellen]. </li><li> Pellet Sphäroplasten durch Zentrifugation für 8 min bei 2200 xg bei 4 ° C. </li><li> Resuspendieren pelletiert Sphäroplasten in eiskaltem Homogenisierungspuffer [6,5 ml Puffer / g (Feuchtgewicht) Zellen]. </li><li> Transfer-Zellen zu einer pre-auf Eis gekühlt Glashomogenisator. </li><li> Mit einer engen Pistill Homogenisierung der Zellen, indem sie 15 Schläge von dem Pistill. </li><li> Add 1 Volumen eiskaltem Homogenisierungspuffer. </li><li> Transfer homogenisiert Sphäroplasten bis 50-ml Kunststoff-Röhrchen. </li><li> Pellet ungebrochene Zellen, Kerne und große Trümmer durch Zentrifugation für 5 min bei 1500 xg bei 4 ° C. </li><li> Centrifuge der resultierende Überstand für 5 min bei 3000 xg bei 4 ° C. </li><li> Centrifuge der resultierende Überstand für 15 min bei 12000 xg bei 4 ° C. </li><li> Dekantieren und Pellet in eiskaltem Homogenisierungspuffer [6,5 ml Puffer / g (Feuchtgewicht) Zellen]. </li><li> Zentrifugieren Sie für 5 min bei 3000 xg bei 4 ° C. </li><li> Centrifuge der resultierende Überstand für 15 min bei 12000 xg bei 4 ° C. </li><li> Dekantieren und Pellet in 3 ml eiskaltem SEM-Puffer. </li></ol> ** Obwohl diese Suspension in den Mitochondrien angereichert ist, es enthält auch andere Organellen wie das endoplasmatische Retikulum (Mikrosomen), Golgi und Vakuolen. Um reine Mitochondrien, können diese rohe mitochondriale Fraktion zur weiteren Fraktionierung unterworfen werden, wie unten beschrieben .** Reinigung von Mitochondrien ohne Verunreinigung durch andere Organellen <ol><li> Legen Sie 1,5 ml eiskaltem 60% (w / v) Saccharose in EM-Puffer in ein Beckman Ultra-Clear-Zentrifugenröhrchen. </li><li> Overlay 60% (w / v) Saccharose mit 4 ml 32%, 1,5 ml von 23%, 1,5 ml 15% Saccharose (alle wt / v in EM-Puffer). </li><li> Platz 3 ml des Roh-mitochondriale Fraktion in SEM-Puffer auf 15% (w / v) Saccharose. </li><li> Zentrifuge in einem Beckman SW41 Ti Ausschwingrotor Rotor für 1 h bei 134000 xg (33000 rpm) bei 4 ° C. </li><li> Die intakten Mitochondrien bilden ein braunes Band an der 60% / 32% Saccharose-Schnittstelle. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig Saccharose bis zum Erreichen der mitochondrialen Band. </li><li> Entfernen Sie die mitochondriale Band mit einer Pipette mit einem Cut-Spitze und legen Sie sie in ein Beckman Zentrifugenröhrchen für ein MLS-5 Rotor. </li><li> Füllen Sie das Rohr mit SEM-Puffer. </li><li> Pellet der reinen Mitochondrien durch Zentrifugation in einem MLS-5-Rotor für 30 min bei 10000 xg (31000 rpm) für 30 Minuten bei 4 ° C. </li><li> Dekantieren Überstand miteiner Pipette. </li><li> Verwenden Sie die reine Mitochondrien für die Analyse der mitochondrialen Funktionen, mitochondriale Proteom-und lipidome, und die mitochondriale DNA. </li></ol> Reagenzien <ol><li> DTT-Puffer [100 mM Tris/H2SO4 (pH 9,4), 10 mM Dithiothreitol] (für 15 ml) <ul style="list-style-type:none;"><li> 1,5 ml 1 M Tris/H2SO4 Puffer (pH 9,4) </li><li> 150 ul 1 M DTT </li><li> Volume auf 15 ml </li></ul></li><li> Zymolyase Puffer [20 mM Kaliumphosphat (pH 7,4), 1,2 M Sorbitol] (für 100 ml) <ul style="list-style-type:none;"><li> 2 ml 1 M Kaliumphosphatpuffer (pH 7,4) </li><li> 60 ml 2 M Sorbit </li><li> Volumen auf 100 ml </li></ul></li><li> Homogenisierungspuffer [10 mM Tris / HCl (pH 7,4), 0,6 M Sorbitol, 1 mM EDTA, 0,2% (w / v) BSA] (für 250 ml] <ul style="list-style-type:none;"><li> 2,5 ml 1 M Tris / HCl-Puffer (pH 7,4) </li><li> 75 ml 2 M Sorbit </li><li> 500 ul 500 mM EDTA </li><li> 0,5 g BSA </li><li> Volume auf 250 ml </li></ul></li><li> SEM-Puffer [10 mM MOPS / KOH (pH 7,2), 250 mM Saccharose, 1 mM EDTA] (für 250 ml) <ul style="list-style-type:none;"><li> 2,5 ml 1 M MOPS / KOH-Puffer (pH 7,2) </li><li> 31,25 ml 2 M Saccharose </li><li> 500 ul 500 mM EDTA </li><li> Volume auf 250 ml </li></ul></li><li> EM-Puffer [10 mM MOPS / KOH (pH 7,2), 1 mM EDTA] (für 250 ml) <ul style="list-style-type:none;"><li> 2,5 ml 1 M MOPS / KOH-Puffer (pH 7,2) </li><li> 500 ul 500 mM EDTA </li><li> Volume auf 250 ml </li></ul></li></ol>

<ol><li>Voet, D., Voet, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Biochemistry.</a> , 3rd Edition, John Wiley & Sons, Inc. Hoboken, NJ. (2004).</li>
<li>Suen, D. -F., Norris, K. L., Youle, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dynamics+and+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dynamics and apoptosis.</a> Genes Dev. 22, 1577-1590 (2008).</li>
<li>Cheng, W. C., Berman, S. B., Ivanovska, I., Jonas, E. A., Lee, S. J., Chen, Y., Kaczmarek, L. K., Pineda, F. &amp, Hardwick, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+factors+with+dual+roles+in+death+and+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial factors with dual roles in death and survival.</a> Oncogene. 25, 4697-4705 (2006).</li>
<li>Detmer, S. A., Chan, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functions+and+dysfunctions+of+mitochondrial+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Functions and dysfunctions of mitochondrial dynamics.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8, 870-879 (2007).</li>
<li>McBride, H. M., Neuspiel, M., Wasiak, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria%3A+more+than+just+a+powerhouse%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Mitochondria: more than just a powerhouse.</a> Curr. Biol. 16, R551-R560 (2006).</li>
<li>Balaban, R. S., Nemoto, S., Finkel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria%2C+oxidants%2C+and+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mitochondria, oxidants, and aging.</a> Cell. 120, 483-495 (2005).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Dieses Verfahren ermöglicht die High-Yield-Isolierung reiner Mitochondrien aus Hefezellen. Mitochondrien mit dieser Methode gereinigt sind im Wesentlichen frei von Verunreinigungen durch andere Organellen und behalten ihre strukturelle und funktionelle Integrität nach ihrer Reinigung. Die beschriebene Methode liefert Mitochondrien, die sich für zellfreie Rekonstitution wesentlicher mitochondriale Prozesse sind. Diese hochreinen Mitochondrien können auch für die Analyse der mitochondrialen Struktur und Funktionen, mitoch...

reinigung von mitochondrien aus hefezellen

Purification of Mitochondria from Yeast Cells

Mitochondrien sind die Haupt-Website des ATP-Produktion im aeroben Stoffwechsel in eukaryotischen Zellen nicht-photosynthetischen<sup&gt; 1</sup&gt;. Diese komplexen Organellen spielen auch eine wesentliche Rolle im apoptotischen Zelltod<sup&gt; 2</sup&gt;, Das Überleben der Zelle<sup&gt; 3</sup&gt; Entwicklung von Säugetieren<sup&gt; 4</sup&gt;, Neuronale Entwicklung und Funktion<sup&gt; 4</sup&gt;, Intrazelluläre Signalwege<sup&gt; 5</sup&gt; Und Langlebigkeit Regulierung<sup&gt; 6</sup&gt;. Unser Verständnis dieser komplexen biologischen Prozesse durch Mitochondrien gesteuert setzt auf robuste Methoden zur Beurteilung ihrer Morphologie, ihrem Protein-und Lipid-Zusammensetzung, die Integrität ihrer DNA, und ihre zahlreichen lebenswichtigen Funktionen. Die Bierhefe<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt;, Ist eine genetisch und biochemisch manipulierbar einzelligen Eukaryoten mit annotierten Genom-und Proteom-wohldefinierte, ein wertvolles Modell für die Erforschung der molekularen und zellulären Mechanismen, die die wesentlichen biologischen Funktionen der Mitochondrien. Für diese Arten von Studien, ist es entscheidend, hochreinen Mitochondrien haben. Hier präsentieren wir Ihnen eine detaillierte Beschreibung der eine schnelle und effektive Methode zur Reinigung von Hefe-Mitochondrien. Diese Methode ermöglicht die Isolierung von hochreinem Mitochondrien, die im Wesentlichen frei von Verunreinigungen durch andere Organellen sind und behalten ihre strukturelle und funktionelle Integrität nach ihrer Reinigung. Mitochondrien mit dieser Methode gereinigt werden für die zellfreie Rekonstitution wesentlicher mitochondriale Prozesse geeignet und können für die Analyse der mitochondrialen Struktur und Funktionen, mitochondriale Proteom-und lipidome und mitochondriale DNA verwendet werden.

Wir beschreiben eine schnelle und effektive Methode zur Aufreinigung von Mitochondrien aus der Hefe<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt;. Dieses Verfahren ermöglicht die High-Yield-Isolierung reiner Mitochondrien, die im Wesentlichen frei von Verunreinigungen durch andere Organellen sind und behalten ihre strukturelle und funktionelle Integrität nach ihrer Reinigung.

Reinigung von Mitochondrien aus Hefezellen

Mitochondrien sind der Hauptort der ATP-Produktion während des aeroben Stoffwechsels in eukaryotischen, nicht-photosynthetischen Zellen1. Diese komplexen Organellen spielen zudem eine ...

Dieses Protokoll beginnt mit der Umwandlung von Hefezellen in Sphero-Platten durch Verdauung der Zellwand mit Simul-Lyase. Anschließend werden die Sphero-Platten mithilfe eines Glas-Teflon-Homogenisators homogenisiert. Der erhaltene Homogenat wird zweimal zentrifugiert, um unversehrte Zellen, Kerne und große Partikel abzutrennen. Danach wird das resultierende Überstand für 15 Minuten bei 12.000 Gs zentrifugiert, um die Mitochondrien zu sedimentieren.Schließlich wird die rohe mitochondriale Fraktion, die noch andere Organellen enthält, 60 Minuten lang bei 134.000 G in einem Saccharosedichtegradienten zentrifugiert; reine Mitochondrien, frei von Kontamination durch andere Organellen, werden an der Grenzfläche zwischen 60 % (Gewicht pro Volumen) und 32 % (Gewicht pro Volumen) Saccharoselösung angereichert. Hallo, ich bin Dr. Christopher Greg aus dem Labor von Dr. Vladimir Tko am Fachbereich Biologie der Concordia University. Heute zeige ich Ihnen, wie man Mitochondrien aus der Hefe Saccharomyces cerevisiae isoliert.Wir tun dies, um die Dynamik und die altersbedingten Veränderungen zu untersuchen, die in den Mitochondrien stattfinden. Während die Zellen altern, werden wir Veränderungen im Proteom, im Lipidom und in der DNA der Mitochondrien betrachten. Beginnen wir also.Beginnen Sie dieses Protokoll, indem Sie den Hefestamm in zehn 250-Milliliter-Flaschen kultivieren, wobei jede 50 Milliliter YP-Medium enthält. Inkubieren Sie bei 30 Grad Celsius mit rotatorischem Schütteln für 48 Stunden. Gießen Sie die Kultur anschließend in 500-Milliliter-Nalgene-Zentrifugenröhrchen.Sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation fünf Minuten bei 3000&nbsp;G bei Raumtemperatur, dekantieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellpellets in 250&nbsp;Milliliter destilliertem Wasser. Zentrifugieren Sie die Zellen erneut fünf Minuten bei 3000&nbsp;G bei Raumtemperatur. Wiederholen Sie diesen Schritt: Resuspendieren Sie die Zellpellets in 250&nbsp;Milliliter destilliertem Wasser und zentrifugieren Sie fünf Minuten lang.Bei 3000 G bei Raumtemperatur das resultierende feuchte Zellpellet wiegen, dann die pelletierten Zellen in DTT-Puffer resuspendieren und die Zellsuspension in einen 250-Milliliter-Kolben überführen. Den Kolben 20 Minuten lang bei 70 U/min bei 30 Grad Celsius rotieren lassen. Nach den 20 Minuten die Zellen durch Zentrifugation fünf Minuten lang bei 3000 G bei Raumtemperatur gewinnen, die pelletierten Zellen in Xs-Puffer ohne Xs resuspendieren und fünf Minuten lang zentrifugieren.Bei 3000 Gs bei Raumtemperatur resuspendieren Sie die pelletierten Zellen erneut in Zy-Puffer ohne Xs und überführen die Zellsuspension in einen Glaskolben. Geben Sie das Zy-Liase-100-T-Pulver zur Zellsuspension hinzu und schwenken Sie 30 Minuten lang bei 70 U/min in einem Schüttelinkubator bei 30 Grad Celsius. Während dieser Zeit verdaut das Zy-Liase-100-T die Zellwände, um Sphero-Plats zu bilden. Alle Schritte nach der zuvor gezeigten X-Digestion müssen bei vier Grad Celsius oder auf Eis durchgeführt werden.Suspensionen von Splat sollten vorsichtig mit Pipetten, die abgeschnittene Spitzen haben, behandelt werden, um zu vermeiden, dass Organellen beschädigt werden. Nach Abschluss der 30-minütigen XMO-Verdauung überführen Sie die Sphero-Splats in 50-Milliliter-Kunststoffzentrifugenröhrchen, zentrifugieren acht Minuten bei 2200 × g bei vier Grad Celsius, resuspendieren das pelletierte S-Splat in eiskaltem Homogenisierungspuffer und zentrifugieren das S-Splat erneut acht Minuten bei 2200 × g bei vier Grad Celsius.Suspendieren Sie das pelletierte Sphero-Plast in kaltem Homogenisierungspuffer auf Eis und überführen Sie die Zellen in einen vorgekühlten Glaszerreiber. Homogenisieren Sie die Zellen mit einem eng anliegenden Pistill durch 15 Hubbewegungen des Pistills.Geben Sie ein gleiches Volumen eiskalter Homogenisierungspuffer zu den homogenisierten S-Splats und überführen Sie diese in 50-Milliliter-Kunststoffzentrifugenröhrchen. Zentrifugieren Sie die homogenisierten Splats fünf Minuten bei 1500 ×g und 4 °C, um unbeschädigte Zellen, Zellkerne und große Partikel zu pelletieren. Gießen Sie das resultierende Überstand in neue Röhrchen und zentrifugieren Sie fünf Minuten lang erneut.Bei 3000 × g bei vier Grad Celsius. Anschließend das resultierende Überstand für 15 Minuten bei 12.000 × g bei vier Grad Celsius zentrifugieren, den Überstand dekantieren und das Pellet in kaltem Homogenisierungspuffer auf dem Eis resuspendieren.Zentrifugieren Sie das resuspendierte Pellet fünf Minuten lang bei 3000 G bei vier Grad Celsius. Zentrifugieren Sie schließlich das resultierende Überstand 15 Minuten lang bei 12.000 G bei vier Grad Celsius, gießen Sie den Überstand ab und resuspendieren Sie das Pellet in drei Milliliter eiskaltem.SEM-Puffer. Diese Suspension stellt die rohe mitochondriale Fraktion dar. Obwohl sie an Mitochondrien angereichert ist, enthält sie auch andere Organellen wie das endoplasmatische Retikulum oder Mikrosomen GOGI und VAs, um reine Mitochondrien zu erhalten.Die Suspension wird einer weiteren Fraktionierung unterzogen, wie im nächsten Abschnitt beschrieben. Um mit der Fraktionierung der rohen mitochondrialen Suspension zur Gewinnung reiner Mitochondrien zu beginnen, geben Sie 1,5 Milliliter eiskalte 60-%-Gewicht pro Volumen-Lösung von Saccharose in EM-Puffer in ein Beckman-UltraClear-Zentrifugenröhrchen.Danach vorsichtig 4 ml 32%igen Saccharose, 1,5 ml 23%igen Saccharose und 1,5 ml 15%igen Saccharose (jeweils Gewicht pro Volumen in EM-Puffer) schichtweise über den 60%igen Saccharose geben. 3 ml der rohen mitochondrialen Fraktion im SEM-Puffer auf den 15%igen (Gewicht pro Volumen) Saccharose auftragen. Eine Stunde bei 134.000 × g oder 33.000 U/min bei 4 °C in einem Beckman SW 41 TI-Schwingkorbrotor zentrifugieren.Nach der Zentrifugation bilden die intakten Mitochondrien ein braunes Band an der Grenzfläche zwischen 60 % und 32 % Saccharose. Entfernen Sie vorsichtig die Saccharoselösung, bis sie das mitochondriale Band erreicht, mit einer Pipette mit abgeschnittenem Spitze, heben Sie das mitochondriale Band ab und geben Sie es in ein Beckman-Zentrifugenröhrchen. Füllen Sie bei einem MLS-5-Rotor das Röhrchen mit SEM-Puffer, pelletieren Sie die reinen Mitochondrien durch Zentrifugation im MLS-5-Rotor bei 10.000 × g oder 31.000 U/min für 30 Minuten bei vier Grad Celsius und gießen Sie anschließend das Überstand ab.Diese reinen Mitochondrien können nun für die Analyse mitochondrialer Funktionen, des mitochondrialen Proteoms und der mitochondrialen DNA verwendet werden. Die rohe mitochondriale Fraktion in den linken Bahnen und die durch Zentrifugation in einem Saccharose-Dichtegradienten gereinigten Mitochondrien in den rechten Bahnen wurden einer SDS-Page und Immunschichtanalyse mit Antikörpern gegen Proteinmarker verschiedener Organellen unterzogen. Das Vorhandensein von Mitochondrien in beiden Präparationen wurde durch die Immunreaktivität gegenüber PO1P und COX1P bestätigt. Die Immunschichtanalyse zeigte das Vorhandensein von DPM1P, FO13P und VPS10P, die jeweils für das endoplasmatische Retikulum, Lysosomen und Golgi-Proteine stehen, in der rohen mitochondrialen Fraktion.Im Gegensatz dazu wurden diese Markerproteine in den gereinigten Mitochondrien nicht nachgewiesen, was bestätigt, dass das Protokoll Mitochondrien ergab, die frei von Kontaminationen durch andere Organellen waren. Soeben haben wir Ihnen gezeigt, wie man Mitochondrien aus der Hefe sace visier isoliert. Denken Sie daran, wenn Sie dieses Experiment durchführen, die Zellen nicht länger als eine halbe Stunde in zy lies 100 T inkubieren zu lassen, da Sie sonst das Risiko eingehen, Ihre Membranproteine oder Organellenproteine, die in den Zellen vorhanden sein könnten, zu degradieren.Das könnte auf Proteasen im Reagenz zurückzuführen sein. Außerdem können Sie die Mitochondrien vor der Isolierung und vor der Herstellung des Saccharose-Gradienten bei minus 20 Grad einfrieren und sie auftauen, bevor Sie bereit sind, den Zentrifugationsschritt durchzuführen. Das war's.Viel Erfolg bei Ihren Experimenten.

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Forschung

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Biology

Biologie

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Lernen Sie die Reinigung von Mitochondrien aus Saccharomyces cerevisiae durch Zellwandverdauung, Homogenisierung und Saccharose-Dichtegradienten-Zentrifugation. Diese Methode liefert hochreine, funktionell intakte Mitochondrien für zellbiologische und biochemische Analysen.

Reinigung von Mitochondrien aus Hefezellen

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