Tissue Gezielte Embryonale Chimären: Zebrafisch Gastrula Cell Transplantation

Dieses Verfahren beginnt damit, Einzelzell-Zebrafischembryonen in eine Mikroinjektionsplatte einzusortieren. Injizieren Sie eine fluoreszierende Dextrinlösung in das Eiweiß. Direkt unterhalb der injizierten Embryonen befinden sich Ihre Transplantatspender.

Beschichten Sie Spender- und Wirtsembryonen und bringen Sie zwei mit DEC beschichtete, Dextrin-injizierte Embryonen nebeneinander in ein Loch einer Transplantationsplatte ein, nachdem sie bis zum Schild-Stadium herangewachsen sind. Wiederholen Sie dies unterhalb jedes Spenderpaares. Fügen Sie je Loch einen Wirtsembryo hinzu, um transplantierte Zellen in die zukünftige Diencephalon-Region des Vorderhirns zu lenken; transplantieren Sie Zellen von und zur Mittellinie.

Mitte zwischen dem Animalpol und dem Schild. Transplantiere Zellen vom Spender-Gasa in den Wirt-Gasa. 30 Stunden inkubieren, dann fixieren.

Führen Sie gegebenenfalls eine Immunchemie durch, montieren und bilden Sie ab. Alternativ können Sie den Wirt lebend montieren und eine Zeitrafferaufnahme durchführen. Hallo, mein Name ist Elizabeth De Shane aus dem Labor von Dr. Michael ESI am Department für Biowissenschaften am Smith College in Northampton, Massachusetts.

Und ich bin die leitende Wissenschaftlerin des Labors, Dr. Michael Besi. Heute zeigen wir Ihnen, wie man chimäre Embryonen erzeugt, indem man Zelltransplantationen im Gastrulationsstadium am Zebrafisch-Modellsystem durchführt. In meinem Labor verwenden wir dieses Verfahren, um die Funktion spezifischer Gene bei der Entwicklung der Vorderhirncommissuren sowie den Prozess der Axon-Glia-Interaktionen während der Commissurenbildung zu untersuchen.

Beginnen wir also. Zur Vorbereitung stellen Sie Muldenformen für die Mikroinjektionsplatten her, indem Sie vorsichtig drei einkantige Kapillaren mit einem Durchmesser von einem Millimeter und einer Länge von vier Zoll der Länge nach durchbrechen. Verwenden Sie Sekundenkleber, um zwei der halbierten Kapillaren nebeneinander auf eine flache Oberfläche zu kleben.

Die dritte Kapillare befindet sich oben auf diesen beiden und liegt in der Nut, um eine pyramidenförmige Struktur zu bilden. Lassen Sie die Form mit den drei Kapillaren trocknen. Für jede Injektionsplatte sollten Sie etwa drei bis fünf Formen anfertigen.

Bereiten Sie als Nächstes die Injektionsplatten vor, indem Sie 20 bis 25 Milliliter geschmolzenes 1,5 %iges Aros in Embryomedium in eine 100 Millimeter große Petrischale geben. Stellen Sie sofort drei bis fünf der vorbereiteten Rillenformen auf den Boden der Schale, wobei sichergestellt sein muss, dass die flache Seite der Form den Boden der Petrischale berührt und vollständig von Aros bedeckt ist. Sobald das Aros erstarrt ist, entfernen Sie die Rillenformen, indem Sie ein großes Aros-Quadrat, das sie enthält, herausschneiden.

Lösen Sie vorsichtig das Agar am Rand des ausgeschnittenen Quadrats und entsorgen Sie es. Drehen Sie das quadratische Agarstück um und entfernen Sie mit feinen Pinzetten vollständig die Rillenformen. Gießen Sie geschmolzenes Aros um das Quadrat in die Petrischale, um die neu geformten Vertiefungen an ihrem Platz zu fixieren.

Lassen Sie es aushärten. Die Platten können mit Parafilm verschlossen und wochenlang bei vier Grad Celsius gelagert werden. Sie sollten entsorgt werden, wenn Anzeichen von Wachstum im Agar sichtbar sind.

Schließlich, um die Injektionsnadeln vorzubereiten, verwenden Sie einen Mikropipetten-Kapillarzieher, um die Nadeln aus einköpfigen, vier Zoll langen Glas-Kapillaren mit einem Innendurchmesser von einem Millimeter herzustellen, und zwar nachdem die Mikroinjektionsplatte und die Nadeln vorbereitet wurden. Sehen wir uns nun die Sammlung der Embryonen und die Einrichtung der Mikroinjektionsapparatur an. Befruchtete Eier werden unmittelbar nach dem Ablaichen gesammelt und in einer Petrischale mit Embryomedium aufbewahrt.

Unter Verwendung einer Pipette mit breiter Spitze die Embryonen in die Vertiefungen einer Injektionsplatte mit Raumtemperatur ausblasen, die mit Embryomedien gefüllt ist. Mit geschlossenen stumpfen Pinzettenspitzen die Embryonen vorsichtig in den Boden der Rillen einklemmen; Embryonen, deren Chorion oder Dottersack beschädigt ist, sollten verworfen werden.

Laden Sie als Nächstes die Injektionsnadel mit ein bis zwei Mikrolitern verdünnter fluoreszierender Alexa 594-Dextrinlösung auf. Lassen Sie das Dextrin durch Kapillarwirkung bis zur Spitze der Injektionsnadel wandern. Befestigen Sie die Injektionsnadel am Kapillarhalter eines stereotaktischen Mikromanipulators und stellen Sie zunächst den Druck am Mikroinjektionsgerät ein.

40 bis 50 PSI und eine Pulsdauer von 500 Millisekunden. Verwenden Sie eine Pinzette, um die Spitze der Injektionsnadel vorsichtig zu streifen oder abzuschneiden, um die Versiegelung zu durchbrechen. Ideal sollte der Durchmesser zwischen 0,05 und 0,15 Millimetern liegen.

Um die Nadel zu kalibrieren, verwenden Sie ein Stereomikroskop und geben Sie die Dextrinlösung auf ein Mikrometer, das mit Mineralöl bedeckt ist. Passen Sie die Bolusgröße an, indem Sie die Dauer des Luftdruckimpulses und die Größe der Nadel verändern. Tipp: Während der Injektionen sollte eine Bolusgröße, die einem Volumen von 0,8 bis einem Nanoliter entspricht, beibehalten werden.

Wir können nun die Mikroinjektion von Dextrin unter Verwendung einer etwa 3,2-fachen Vergrößerung am Stereomikroskop beginnen. Beginnen Sie mit der Injektion bei den Embryonen an einem Ende der Rille, indem Sie glatt die Chorion- und Zellmembran der Embryonen durchstechen, um in das Eiweiß einzudringen. Injizieren Sie die Dextrinlösung direkt unter die Zelle.

Stellen Sie sicher, dass Sie die Injektionsnadel mit derselben gleichmäßigen Bewegung wieder herausziehen, mit der Sie in das Embryo eingedrungen sind. Bewegen Sie die Petrischale, um das nächste Embryo in Position zu bringen, und setzen Sie die Injektionen entlang der Rille fort. Überprüfen Sie regelmäßig den Druck und die Bolusgröße.

Verwenden Sie nun eine Pinzette, um die Embryonen vorsichtig aus den Rillen zu schieben. Überführen Sie sie in eine Petrischale, die mit antibiotischem Embryonenmedium gefüllt ist. Inkubieren Sie die Embryonen bei 28,5 Grad Celsius und überwachen Sie sie auf unbefruchtete Eier oder Tod.

Die Embryonen sind nun bereit für zukünftige Transplantationen. Vor Abschluss einer Poli während der Gasration bleiben Teile des Dotters freiliegen. Der Dottersack ist äußerst empfindlich und haftet leicht am Kunststoff der Petrischale, wodurch er leicht einreißt.

Daher müssen Embryonen einen Tag vor der Transplantation auf beschichteten Platten beschichtet werden. Stellen Sie diese Dekorationsplatten her, indem Sie fünf bis 10 Milliliter geschmolzenes Agarose in eine 100 Millimeter große Petrischale geben. Nur eine dünne Schicht Agarose von etwa zwei bis drei Millimetern Dicke ist erforderlich, um die Embryonen während der Dekoration zu puffern.

Lassen Sie die Platten abkühlen. Danach stellen Sie separate Transplantationsplatten her, indem Sie 30 Milliliter einer 1,5%igen Agarose-Lösung in eine 100 Millimeter große Petrischale geben und eine Transplantationsmuldenform einsetzen. Die Form sollte 104 dreieckige Vertiefungen enthalten, wobei jede aus drei Seiten mit 90 Grad und einer Seite mit 45 Grad Winkel besteht.

Die Vertiefungen sind so ausgelegt, dass zwei Embryonen nebeneinander Platz finden. Achten Sie darauf, keine Luftblasen unter der Form einzuschließen, und lassen Sie das Agarose-Hydrogel aushärten. Das Entfernen der Form legt einen versenkten Bereich frei, der die quadratischen Vertiefungen mit einer abgeschrägten Kante enthält.

Um Wirt- und Spenderembryonen für die Transplantation vorzubereiten, muss ihre Entwicklung überwacht werden, um nahezu altersgerechte Paarungen sicherzustellen. Dazu können die Embryonen bei unterschiedlichen Temperaturen zwischen 23 und 31 Grad Celsius kultiviert werden, um die Entwicklung zu verlangsamen oder zu beschleunigen. Sowohl Wirt- als auch Spenderembryonen sollten eine Stunde vor dem gewünschten Entwicklungsstadium manuell auf eine beschichtete Beschichtungsplatte aufgebracht werden.

Im Fall von Transplantationen im Gastrulationsstadium muss dies bis fünf Stunden nach der Befruchtung (HPF) vor dem Schild-Stadium bei 5,5 HPF abgeschlossen sein. Verwenden Sie eine Glaspipette, um Wirt- und Donorembryonen in eine Transplantationsplatte zu laden, die mit antibiotischem Embryomedium gefüllt ist. Dabei ist die erste Reihe mit Donorembryonen befüllt, wobei sich je zwei Embryonen pro Mulde befinden, und die folgenden beiden Reihen enthalten jeweils einen einzelnen Wirtsembryonen pro Mulde.

Für Transplantationen verwenden wir ein fluoreszierendes Stereomikroskop von Zeiss mit Luer-Anschluss, das über eine vollständig automatisierte, joystickgesteuerte Vergrößerung und Fokussierung verfügt. Obwohl dieses automatisierte Mikroskop nicht zwingend erforderlich ist, erhöht es deutlich die Leichtigkeit und Effizienz dieser feinen chirurgischen Transplantationen, insbesondere wenn eine hohe Anzahl an Transplantationen durchgeführt werden soll. Um die Transplantationsapparatur einzurichten, stellen Sie den Einor-Luftwagen auf die mittlere Position seiner Skala ein, verbinden Sie die Luftwagen-Schläuche mit dem Kapillarhalter und befestigen Sie den Halter am Einor-automatisierten Mikromanipulator. Nachdem die Embryonen und die Transplantationsapparatur vorbereitet sind, können wir nun mit den Zelltransplantationen im Gastro-Entwicklungsstadium fortfahren.

Die wichtigste Fähigkeit beim Durchführen von Zelltransplantationen im Gastrulationsstadium ist die Fähigkeit, die zelluläre Anatomie der dorsalen Blastula-APO-Lippe zu erkennen, die auch als Schild beim Zebrafisch bekannt ist. Hier zeigen wir einen Sequenzfilm der Gastrula aus verschiedenen Blickwinkeln und heben hervor, wo sich der Schild in dieser Seitenansicht befindet. Der Schild oder die dorsale Seite liegt rechts entlang der roten Kontur, um Zielzellen für Transplantationen in das Vorderhirn und an die Mittellinie zu bestimmen.

Genau auf halbem Weg zwischen dem Animalpol und dem Schild beginnen wir, das Embryo zuerst in Ihre Richtung zu drehen, um den Animalpol zu betrachten, wobei wir den Schild und die Transplantationsstelle unterwegs hervorheben. Anschließend dreht sich das Embryo um seine Achse, sodass der Schild unten liegt. Der Keimstreif dreht sich nun wieder nach oben und bietet Ihnen eine direkte dorsale Ansicht.

Das Embryo wird nun nacheinander wieder in eine Seitenansicht bei sechs HPF zurückgedreht. Mit Hilfe des Mikromanipulators vorsichtig mit der Kapillarspitze über das Embryo streichen, um es in eine Position für die Zellauslösung zu drehen, bei der seine Mittellinie und sein Schild sichtbar sind und der Kapillarspitze gegenüberliegen. Spenderembryonen lassen sich leicht überprüfen, indem man von Helligkeitsfeldbeleuchtung auf fluoreszierende Beleuchtung umschaltet. Hierbei leuchten die Zellen des Keimkegels rot. Eine kleine Menge an Embryomedium in die Kapillare aufsaugen, um jeglichen Kontakt der Zellen mit der Luft-Wasser-Grenzfläche, die sie beschädigen könnte, auszuschließen.

Stechen Sie vorsichtig in das Ektoderm des Spenderembryos entlang der Mittellinie genau zwischen dem Animalpol und dem Schild. Im gasa befanden sich nur etwa 20 Mikrometer Zellen zwischen dem oberflächlichen Ektoderm und dem darunterliegenden Dotter. Achten Sie daher darauf, den Dotter nicht zu verletzen, da dies häufig innerhalb weniger Stunden zum Tod führt.

Aspirieren Sie die Zellen mit der Luftpipette langsam in die Kapillare. Achten Sie stets darauf, dass die Wasserlinie sichtbar bleibt, und bewegen Sie die Spitze leicht, um die Zellen zu lösen. Dies hilft im Spender, die Zell-Zell-Kontakte aufzulösen.

Es sollten etwa 10 bis 50 Zellen aus dem Donorembryo gewonnen werden. Entfernen Sie danach die Kapillare vom Spender. Richten Sie den Wirt entsprechend aus und durchstoßen Sie diesen, um die Zellen an exakt derselben Stelle in ein Wirtsembryo zu injizieren. Der Wechsel von Hellfeld- auf Fluoreszenzbeleuchtung zeigt die Bewegung der mit Dextrin markierten Zellen in der Kapillarnadel in das Wirtsembryo hinein.

Entfernen Sie abschließend nach der Transplantation die Spender- und Wirtsembryonen aus den Vertiefungen. Trennen Sie sie und platzieren Sie sie vorsichtig auf einer mit A beschichteten Petrischale, die mit antibiotischem Embryonenmedium gefüllt ist. Inkubieren Sie die Embryonen bei 28,5 Grad Celsius, bis die Transplantation abgeschlossen ist.

Beginnen wir mit der Visualisierung und Bildgebung. Die Embryonen werden zunächst in einem immunohistochemisch überprüften Konservierungsmittel im geeigneten Entwicklungsstadium fixiert. In unserem Fall erfolgt dies in 4 % Formaldehyd für zwei Stunden bei Raumtemperatur oder über Nacht bei vier Grad Celsius unter Rühren.

Anschließend die fixierten Embryonen zwei Mal spülen und dann drei bis fünf Minuten lang waschen in 0,1 molarer PB. Führen Sie gegebenenfalls eine geeignete Immunfärbung durch.

Bringen Sie die Embryonen in 75 % Glycerin, lassen Sie sie bei Raumtemperatur absinken und lagern Sie sie bei vier Grad Celsius. Bereiten Sie einen Objektträger vor, um zwei Embryonen zu montieren, indem Sie zwei quadratische Umrisse aus Paraffinöl auf einem Objektträger anfertigen, die dem Innendurchmesser eines Quadrats entsprechen. Decken Sie als Nächstes jeden Embryo mit einem Deckglas ab und führen Sie alle erforderlichen Dissektionen durch, um eine frontale Ansicht des Vorderhirns zu erhalten.

Lösen Sie das Vorderhirn ab, indem Sie quer zum Mittelhirn schneiden. Platzieren Sie dieses Gewebe mit einer geringen Menge Glycerin in das Petroleum. Richten Sie das Gewebe in die geeignete Position aus und legen Sie einen Deckgläser über die Probe.

Alternativ können lebende Embryonen in einer 0,75 %igen Agarose-Lösung auf einen Glasobjektträger aufgebracht werden. Bevor die Agarose erstarrt, den Embryo in eine geeignete Position für die Bildgebung mit einer Wolframenadel ausrichten. Sowohl fixierte als auch lebende Proben werden abgebildet.

Unter Verwendung des Leica SP Fünflaser-Scanning-Konfokalmikroskops werden ZS-Stapel aufgenommen, und die dreidimensionale oder vierdimensionale Bildverarbeitung erfolgt mithilfe der Velocity-Software, um chimäre Embryonen zu erzeugen, bei denen ein Teil der Astrogliazellpopulation im Embryo hinsichtlich Genotyp oder Phänotyp unterschiedlich ist. Wir verwendeten einen vielseitigen Ansatz, der die Kombination von GFP-transgenen Embryonen, die Astroglia markieren, mit der gastrostadienabhängigen Zelltransplantation verbindet, um unsere Klone gezielt auf den Cephalon auszurichten. Wir nutzten die gastrale Fate-Map des Zebrafisches, um selektiv Zellen entlang der Mittellinie, äquidistant zum Animalpol und zum Shield, zu isolieren.

Diese extrahierten Zellen wurden anschließend an dieselbe Stelle in einen Wildtyp-Wirtsgasa transplantiert, der dann bis zu 30 HPF aufgezogen und immunmarkiert wurde, wobei alle Axone als Referenzmarkierungen für die Vorderhirnanatomie dienten. In dem hier gezeigten Beispiel zeigt die konfokale Bildgebung eines Wirtsembryos isolierte, GFP-positive Zellen im gesamten Cephalon. Die vollständige Morphologie dieser GFP-positiven Zellen kann in diesem klonalen Assay beobachtet werden, wobei sich zeigt, dass die meisten dieser Zellen die charakteristische radiale gliale Morphologie annehmen, bei der sich das Soma benachbart zur ventrikulären Zone befindet und ein großes Endfußende einen radialen Fortsatz an der Oberflächenschicht abschließt.

Darstellung in drei Dimensionen der Zack aus diesen gesammelten optischen Schnitten zeigt deutlich die Position dieser Zellen in Bezug auf die markierten Axone. Ein weiterer Ansatz, der häufig zur Visualisierung transplantierten Zellen verwendet wird, besteht darin, zunächst einen fluoreszierenden Zelllinienfarbstoff in das Eiweiß eines Ein-Zellen-stadierten Wildtyp- oder GFP-transgenen Embryos einzuspritzen. In diesem Beispiel injizierten wir Alexa 594-Dextrin in Wildtyp-Embryonen.

Im Einzellstadium ließen wir sie bis zum Schildstadium gasa entwickeln und führten anschließend vier gezielte Transplantationen in das Gehirn wie oben beschrieben durch. Stattdessen transplantierten wir jedoch in transgene Wirtsgastrula, wobei die Bildgebung des dorsalen Cephalon durch Laserscanning erfolgte. Die konfokale Mikroskopie zeigte fluoreszierende rote Zellkluster des Spenders, die sich unter den GFP-positiven Kernen im Vorderhirn befanden.

Wir analysierten diesen Wirt weiter, indem wir über einen Zeitraum von zwei Stunden alle drei Minuten mit dem laserbasierten konfokalen Mikroskop Z-Aufnahmen sammelten. Die vierdimensionale Darstellung dieser Zeitrafferaufnahme mithilfe der Geschwindigkeits-Software von IMP Provision zeigt dynamische zelluläre Bewegungen der Stabdomänen-Zellmembranen und der GFP-positiven Kerne. Soeben haben wir Ihnen gezeigt, wie man sämtliche notwendigen Geräte und Reagenzien für Zelltransplantationen in Zebrafischembryonen vorbereitet.

Speziell haben wir die Technik im Gastrula-Stadium demonstriert. Sie ist jedoch auch auf Transplantationen im Blastula-Stadium anwendbar. Bei Anwendung dieses Verfahrens ist es wichtig, die endgültige gewünschte Position der transplantierten Zellen genau mit der früheren Fate-Map-Position dieser Zellen im Gastrula-Stadium abzugleichen. Konsultieren Sie zu weiteren Anleitungen die detaillierte Studie von Dr. Scott Frazier aus dem Jahr 1995 mit dem Titel Fate Maps of the Zebrafish Embryo.

Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.