Tissue Gezielte Embryonale Chimären: Zebrafisch Gastrula Cell Transplantation

Dieses Verfahren beginnt damit, Einzelzell-Zebrafischembryonen in eine Mikroinjektionsplatte einzusortieren. Injizieren Sie eine fluoreszierende Dextrinlösung in das Eiweiß. Direkt unterhalb der injizierten Embryonen befinden sich Ihre Transplantatspender.

Beschichten Sie Spender- und Wirtsembryonen und bringen Sie zwei mit DEC beschichtete, Dextrin-injizierte Embryonen nebeneinander in ein Loch einer Transplantationsplatte ein, nachdem sie bis zum Schild-Stadium gezüchtet wurden. Wiederholen Sie dies unterhalb jedes Spenderpaares. Fügen Sie pro Loch einen Wirtsembryo hinzu, um transplantierte Zellen in das zukünftige Diencephalon des Vorderhirns zu lenken; transplantieren Sie die Zellen von und zur Mittellinie.

Mitte zwischen dem Animalpol und dem Schild. Transplantiere Zellen vom Spender-Gasa in den Wirt-Gasa. 30 Stunden inkubieren, dann fixieren.

Führen Sie gegebenenfalls eine Immunchemie durch, präparieren und bilden Sie ab. Alternativ können Sie den Wirt lebend präparieren und eine Zeitrafferaufnahme durchführen. Hallo, mein Name ist Elizabeth De Shane aus dem Labor von Dr. Michael ESI in der Abteilung für Biologische Wissenschaften am Smith College in Northampton, Massachusetts.

Und ich bin die leitende Wissenschaftlerin des Labors, Dr. Michael Besi. Heute zeigen wir Ihnen, wie man chimäre Embryonen erzeugt, indem man Zelltransplantationen im Gastrulationsstadium am Zebrafisch-Modellsystem durchführt. In meinem Labor verwenden wir dieses Verfahren, um die Funktion spezifischer Gene bei der Entwicklung der Vorderhirncommissuren sowie den Prozess der Axon-Glia-Interaktionen während der Commissurenbildung zu untersuchen.

Beginnen wir also. Zur Vorbereitung stellen Sie Muldenformen für die Mikroinjektionsplatten her, indem Sie vorsichtig drei einkilometerlange, vier Zoll lange, nicht filamentöse Kapillaren der Länge nach halbieren. Verwenden Sie Sekundenkleber, um zwei der Kapillarhälften nebeneinander auf eine flache Oberfläche zu kleben.

Die dritte Kapillare oben auf diesen beiden lag in der Nut und bildete eine pyramidenförmige Struktur. Lassen Sie die Form mit den drei Kapillaren trocknen. Für jede Injektionsplatte sollten Sie etwa drei bis fünf Formen anfertigen.

Bereiten Sie als Nächstes die Injektionsplatten vor, indem Sie 20 bis 25 Milliliter geschmolzenes 1,5 %iges Aros in Embryomedium in eine 100 Millimeter große Petrischale geben. Stellen Sie sofort drei bis fünf der vorbereiteten Rillenformen auf den Boden der Schale, wobei sichergestellt sein muss, dass die flache Seite der Form den Boden der Petrischale berührt und vollständig von Aros bedeckt ist. Sobald das Aros erstarrt ist, entfernen Sie die Rillenformen, indem Sie ein großes Aros-Quadrat, das sie enthält, herausschneiden.

Lösen Sie vorsichtig das Agar am Rand des ausgeschnittenen Quadrats und entsorgen Sie es. Drehen Sie das quadratische Agarstück um und entfernen Sie mit feinen Pinzetten vollständig die Rillenformen. Gießen Sie geschmolzenes Aros um das Quadrat in die Petrischale, um die neu geformten Vertiefungen an ihrem Platz zu fixieren.

Lassen Sie es aushärten. Die Platten können mit Parafilm verschlossen und wochenlang bei vier Grad Celsius gelagert werden. Sie sollten entsorgt werden, wenn Anzeichen von Wachstum im Agar sichtbar sind.

Schließlich, um die Injektionsnadeln vorzubereiten, verwenden Sie einen Mikropipetten-Kapillarzieher, um die Nadeln aus einkilometerlangen vierzölligen Glas-Kapillaren mit internen Filamenten herzustellen, nachdem die Mikroinjektionsplatte und die Nadeln vorbereitet wurden. Sehen wir uns nun die Sammlung der Embryonen und den Aufbau der Mikroinjektionsapparatur an. Befruchtete Eier werden unmittelbar nach dem Ablaichen gesammelt und in einer Petrischale mit Embryomedium aufbewahrt.

Embryonen mit einer Glaspipette mit breiter Spitze in die Vertiefungen einer Injektionsplatte mit Zimmertemperatur geben, die mit Embryonenmedium gefüllt ist. Mit geschlossenen stumpfen Pinzetten die Embryonen vorsichtig in den Boden der Rillen einklemmen; Embryonen, deren Chorion oder Dott geschädigt ist, sollten verworfen werden.

Laden Sie als Nächstes die Injektionsnadel mit ein bis zwei Mikroliter verdünnter fluoreszierender Alexa 594-Dextrinlösung auf. Lassen Sie das Dextrin durch Kapillarwirkung bis zur Spitze der Injektionsnadel wandern. Befestigen Sie die Injektionsnadel am Kapillarhalter eines stereotaktischen Mikromanipulators und stellen Sie zunächst den Druck am Mikroinjektionsgerät ein.

40 bis 50 PSI und einer Impulsdauer von 500 Millisekunden. Verwenden Sie eine Pinzette, um die Spitze der Injektionsnadel vorsichtig zu streifen oder abzuschneiden, um die Dichtung zu durchbrechen. Ideal sollte der Durchmesser 0,05 bis 0,15 Millimeter betragen.

Um die Nadel zu kalibrieren, verwenden Sie ein Stereomikroskop und geben Sie die Dextrinlösung auf ein Mikrometer, das mit Mineralöl bedeckt ist. Passen Sie die Bolusgröße an, indem Sie die Dauer des Luftdruckimpulses und die Größe der Nadel verändern. Tipp: Während der Injektionen sollte eine Bolusgröße, die einem Volumen von 0,8 bis einem Nanoliter entspricht, beibehalten werden.

Jetzt können wir die Mikroinjektion von Dextrin mit einer Vergrößerung von etwa 3,2× am Stereomikroskop beginnen. Beginnen Sie die Embryo-Injektionen an einem Ende der Rille, indem Sie die Chorion- und Zellmembran der Embryonen sanft durchstoßen, um in das Eiweiß vorzudringen. Injizieren Sie die Dextrin-Lösung direkt unter die Zelle.

Stellen Sie sicher, dass Sie die Injektionsnadel mit der gleichen gleichmäßigen Bewegung wieder herausziehen, mit der Sie in das Embryo eingedrungen sind. Bewegen Sie die Petrischale, um das nächste Embryo in Position zu bringen, und setzen Sie die Injektionen entlang der Rille fort. Überprüfen Sie regelmäßig den Druck und die Bolusgröße.

Verwenden Sie nun eine Pinzette, um die Embryonen vorsichtig aus den Rillen zu schieben. Überführen Sie sie in eine Petrischale, die mit antibiotischem Embryonenmedium gefüllt ist. Inkubieren Sie die Embryonen bei 28,5 Grad Celsius und überwachen Sie sie auf unbefruchtete Eier oder Tod.

Die Embryonen sind nun bereit für zukünftige Transplantationen. Vor Abschluss einer Poli während der Gasration bleiben Teile des Dotters freiliegen. Der Dottersack ist äußerst empfindlich und haftet leicht am Kunststoff der Petrischale, wodurch er leicht einreißen kann.

Daher müssen Embryonen einen Tag vor der Transplantation auf beschichteten Platten beschichtet werden. Stellen Sie diese Dekorationsplatten her, indem Sie fünf bis 10 Milliliter geschmolzenes Agar in eine 100 Millimeter große Petrischale geben. Nur eine dünne Agarschicht von etwa zwei bis drei Millimetern Dicke ist erforderlich, um die Embryonen während der Dekoration zu puffern.

Lassen Sie die Platten abkühlen. Danach stellen Sie separate Transplantationsplatten her, indem Sie 30 Milliliter einer 1,5%igen Agarose-Lösung in eine 100 Millimeter große Petrischale geben und eine Transplantationsmuldenform einsetzen. Die Form sollte 104 dreieckige Vertiefungen enthalten, wobei jede aus drei Seiten mit 90 Grad und einer Seite mit 45 Grad Winkel besteht.

Die Vertiefungen sind so ausgelegt, dass zwei Embryonen nebeneinander Platz finden. Achten Sie darauf, keine Luftblasen unter der Form einzuschließen, und lassen Sie das Agarose-Gerinnungsmittel aushärten. Das Entfernen der Form enthüllt einen versenkten Bereich, der die quadratischen Vertiefungen mit einer abgeschrägten Kante enthält.

Um Wirt- und Spender-Embryonen für die Transplantation vorzubereiten, muss ihre Entwicklung überwacht werden, um nahezu altersgerechte Paarungen beizubehalten. Dazu können die Embryonen bei unterschiedlichen Temperaturen zwischen 23 und 31 Grad Celsius gezüchtet werden, um die Entwicklung zu verlangsamen oder zu beschleunigen. Sowohl Wirt- als auch Spender-Embryonen sollten eine Stunde vor dem gewünschten Entwicklungsstadium manuell auf einer beschichteten Beschichtungsplatte beschichtet werden.

Im Fall von Transplantationen im Gastro-Entwicklungsstadium muss dies bis fünf Stunden nach der Befruchtung (HPF) abgeschlossen sein, vor dem Schild-Stadium bei 5,5 HPF. Laden Sie die Wirtsembrionen und die Donorembrionen mithilfe einer Glaspipette in eine Transplantationsplatte, die mit antibiotischem Embryonenmedium gefüllt ist. Dabei wird die erste Reihe mit Donorembrionen besetzt, wobei sich je zwei Embryonen pro Mulde befinden, und die folgenden beiden Reihen werden jeweils mit einem einzelnen Wirtsembrion pro Mulde befüllt.

Für Transplantationen verwenden wir ein fluoreszierendes Stereomikroskop von Zeiss mit Luer-Anschluss, das über eine vollständig automatisierte, joystickgesteuerte Zoom- und Fokussierungsfunktion verfügt. Obwohl dieses automatisierte Mikroskop nicht zwingend erforderlich ist, erhöht es dennoch erheblich die Leichtigkeit und Effizienz dieser feinen chirurgischen Transplantationen, insbesondere wenn eine hohe Anzahl an Transplantationen durchgeführt werden soll. Um die Transplantationsapparatur einzurichten, stellen Sie den Einor-Lufttropf auf die mittlere Position seiner Skala ein, verbinden Sie die Schläuche des Lufttropfs mit dem Kapillarhalter und befestigen Sie den Halter am Einor-automatisierten Mikromanipulator. Nachdem die Embryonen und die Transplantationsapparatur vorbereitet sind, können wir nun mit den Zelltransplantationen im Gastro-Entwicklungsstadium fortfahren.

Die wichtigste Fähigkeit beim Durchführen von Zelltransplantationen im Gastrulationsstadium ist die Fähigkeit, die zelluläre Anatomie der dorsalen Blastoporuslippe, auch bekannt als Schild beim Zebrafisch, zu erkennen. Hier zeigen wir einen Sequenzfilm der Gastrula aus verschiedenen Blickwinkeln und markieren die Lage des Schildes in dieser Seitenansicht. Der Schild bzw. die dorsale Seite befindet sich rechts entlang der roten Umrandung, um Zielzellen für Transplantationen in das Vorderhirn und entlang der Mittellinie zu identifizieren.

Genau auf halbem Weg zwischen dem Animalpol und dem Schild beginnen wir, das Embryo zuerst in Ihre Richtung zu drehen, um den Animalpol zu betrachten, wobei wir den Schild und die Transplantationsstelle unterwegs hervorheben. Anschließend dreht sich das Embryo um seine Achse, sodass der Schild unten liegt. Der Keimstreif dreht sich nun wieder nach oben und bietet Ihnen eine direkte dorsale Ansicht.

Das Embryo wird nun nacheinander bis zu einem Zeitpunkt von sechs HPF wieder in eine Seitenansicht zurückgedreht. Mit Hilfe des Mikromanipulators vorsichtig mit der Kapillarspitze das Embryo streifen, um es in eine Position für die Zellauslösung zu drehen, bei der die Mittellinie und der Schild sichtbar sind und der Kapillarspitze gegenüberliegen. Spenderembryonen lassen sich leicht überprüfen, indem man von Helligkeitsfeldbeleuchtung auf fluoreszierende Beleuchtung umschaltet. Hierbei leuchten die Zellen des Keimkegels rot. Eine kleine Menge an Embryomedium in die Kapillare aufsaugen, um jeglichen Kontakt der Zellen mit der Luft-Wasser-Grenzfläche, die sie beschädigen könnte, auszuschließen.

Stechen Sie vorsichtig in das Ektoderm des Spenderembryos entlang der Mittellinie genau zwischen dem Animapolar- und dem Schildbereich. Im gasa befanden sich nur etwa 20 Mikrometer Zellen zwischen dem oberflächlichen Ektoderm und dem darunterliegenden Dottersack. Achten Sie daher darauf, den Dottersack nicht zu verletzen, da dies häufig innerhalb weniger Stunden zum Tod führt.

Aspirieren Sie die Zellen mit der Luftpipette langsam in die Kapillare. Achten Sie stets darauf, dass die Wasserlinie sichtbar bleibt, und bewegen Sie die Spitze leicht, um die Zellen zu lösen. Dies hilft im Spender, die Zell-Zell-Kontakte aufzulösen.

Es sollten etwa 10 bis 50 Zellen aus dem Donorembryo entnommen werden. Entfernen Sie danach die Kapillare vom Spender. Richten Sie den Wirt entsprechend aus und durchstoßen Sie diesen, um die Zellen an exakt derselben Stelle in ein Wirtsembryo zu injizieren. Der Wechsel von Hellfeld- auf Fluoreszenzbeleuchtung zeigt die Bewegung der mit Dextrin markierten Zellen in der Kapillarnadel in das Wirtsembryo hinein.

Entfernen Sie abschließend nach der Transplantation die Spender- und Wirtsembryonen aus den Vertiefungen. Trennen Sie sie voneinander und platzieren Sie sie vorsichtig auf einer mit A beschichteten Petrischale, die mit antibiotischem Embryonenmedium gefüllt ist. Inkubieren Sie die Embryonen bei 28,5 Grad Celsius, nachdem die Transplantation abgeschlossen ist.

Beginnen wir mit der Visualisierung und Bildgebung. Die Embryonen werden zunächst in einem immunohistochemisch überprüften Konservierungsmittel zum geeigneten Zeitpunkt für die Bildgebung fixiert. In unserem Fall erfolgt dies in 4 % Formaldehyd für zwei Stunden bei Raumtemperatur oder über Nacht bei vier Grad Celsius unter Rotorbetrieb.

Anschließend die fixierten Embryonen zwei Mal spülen und dann drei bis fünf Minuten lang in 0,1 molarer PB waschen. Führen Sie gegebenenfalls eine geeignete Immunfärbung durch.

Legen Sie die Embryonen in 75 % Glycerin, versenken Sie sie bei Raumtemperatur und lagern Sie sie bei vier Grad Celsius. Bereiten Sie einen Objektträger vor, um zwei Embryonen zu montieren, indem Sie zwei quadratische Umrisse aus Paraffinöl auf einem Objektträger erstellen, die dem Innendurchmesser eines Quadrats entsprechen. Decken Sie als Nächstes jeden Embryo mit einem Deckglas ab und führen Sie alle erforderlichen Dissektionen durch, um eine frontale Ansicht des Vorderhirns zu erhalten.

Trennen Sie das Vorderhirn ab, indem Sie quer zum Mittelhirn schneiden. Legen Sie dieses Gewebe mit einer geringen Menge Glycerin in das Petroleum. Orientieren Sie das Gewebe korrekt aus und legen Sie einen Deckglaser über die Probe.

Alternativ können lebende Embryonen in einer 0,75 %igen Agarose-Lösung auf einen Glasobjektträger aufgebracht werden. Bevor die Agarose erstarrt, das Kulturgefäß mit dem Embryo auf den Boden stellen und mit einer Wolframenadel den Embryo in die richtige Position für die Bildaufnahme bringen. Sowohl fixierte als auch lebende Organismen werden abgebildet.

Unter Verwendung des Leica SP Fünf-Laser-Scanning-Konfokalmikroskops werden ZS-Stapel aufgenommen, und die dreidimensionale oder vierdimensionale Bildverarbeitung erfolgt mithilfe der Velocity-Software, um chimäre Embryonen zu erzeugen, bei denen ein Teil der Astrogliazellpopulation im Embryo hinsichtlich Genotyp oder Phänotyp unterschiedlich ist. Wir verwendeten einen vielseitigen Ansatz, der die Kombination von GFP-transgenen Embryonen, die Astroglia markieren, mit der gastrostadienabhängigen Zelltransplantation verbindet, um unsere Klone gezielt auf das Cephalon auszurichten. Wir nutzten die gastrale Fate-Map des Zebrafisches, um selektiv Zellen entlang der Mittellinie, äquidistant zum Animalpol und zum Shield, zu isolieren.

Diese extrahierten Zellen wurden anschließend an dieselbe Stelle in einen Wildtyp-Wirt gasa transplantiert, der dann bis zu 30 HPF aufgezogen und immunmarkiert wurde, wobei alle Axone als Referenzlandmarken für die Vorderhirnanatomie dienten. In dem hier gezeigten Beispiel zeigt die konfokale Bildgebung eines Wirtsembryos isolierte, GFP-positive Zellen im gesamten Cephalon und Cephalon. Die vollständige Morphologie dieser GFP-positiven Zellen kann in diesem klonalen Assay beobachtet werden, wobei sich zeigt, dass die meisten dieser Zellen die charakteristische radiale gliale Morphologie annehmen, bei der sich das Soma benachbart zur ventrikulären Zone befindet und ein großes Endfußende einen radialen Fortsatz an der Oberflächenhaut abschließt.

Darstellung in drei Dimensionen der Zack dieser gesammelten optischen Schnitte zeigt deutlich die Position dieser Zellen in Bezug auf die markierten Axone. Ein weiterer Ansatz, der häufig zur Visualisierung transplantierten Zellen verwendet wird, besteht darin, zunächst einen fluoreszierenden Zelllinienfarbstoff in das Eiweiß eines Ein-Zell-stadiums befindlichen Wildtyp- oder GFP-transgenen Embryos einzuspritzen. In diesem Beispiel injizierten wir Alexa 594-Dextrin in Wildtyp-Embryos.

Im Ein-Zell-Stadium ließen wir sie bis zum Schild-Stadium gasa entwickeln und führten anschließend vier gehirnspezifische Transplantationen wie oben beschrieben durch. Stattdessen transplantierten wir jedoch in transgene Wirtsgastrula-Bilder des dorsalen Cephalons mittels Laserscanning. Die konfokale Mikroskopie zeigte fluoreszierende rote Zellkluster der Spenderzellen unter GFP-positiven Kernen im Vorderhirn.

Wir analysierten diesen Wirt weiter, indem wir mit dem laserbasierten konfokalen Mikroskop über einen Zeitraum von zwei Stunden alle drei Minuten Z-Aufnahmen sammelten. Die vierdimensionale Darstellung dieser Zeitrafferaufnahme mithilfe der Velocity-Software von IMP Provision zeigt dynamische zelluläre Bewegungen der Stabdomänen-Zellmembranen und der GFP-positiven Kerne. Soeben haben wir Ihnen gezeigt, wie man alle notwendigen Geräte und Reagenzien für Zelltransplantationen in Zebrafischembryonen vorbereitet.

Speziell haben wir die Technik im Gastrula-Stadium demonstriert. Sie ist jedoch auch auf Transplantationen im Blastula-Stadium anwendbar. Bei Anwendung dieses Verfahrens ist es wichtig, die endgültige gewünschte Position der transplantierten Zellen genau mit der früheren Fate-Map-Position dieser Zellen im Gastrula-Stadium zu korrelieren. Konsultieren Sie für weitere Anleitungen Dr. Scott Fraziers detaillierte Studie zu Fate Maps des Zebrafisch-Embryos aus dem Jahr 1995 mit dem Titel Fate Maps of the Zebrafish Embryo.

Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.