Schnell und feinfühlig Kolloidale Coomassie G-250 Färbung für Proteine ​​in Polyacrylamidgelen

In diesem Video demonstrieren wir die Leistungsfähigkeit eines modifizierten Kumasi-Färbeprotokolls zum Nachweis mehrerer Nanogramm Protein in Polyacrylamidgelen. Am Beispiel der zweidimensionalen Gelelektrophorese vor der Trennung der ersten Dimension werden Immobilized-pH-Gradient-Streifen unter denaturierenden Pufferbedingungen rehydriert.

Nach dem erneuten Quellen der Streifen über Nacht werden die Proteinproben über das anodische Cup-Loading aufgetragen. Während des Fokussierungsprozesses werden die Proteine entsprechend ihren isoelektrischen Punkten getrennt. Die Trennung in der zweiten Dimension erfolgt mittels SDS-Page.

Das Gel wird anschließend in eine Färbeschale überführt und die Proteine durch Färbung mit kolloidalem Kumasi sichtbar gemacht. Hallo, ich bin Nadine de Bala aus dem Labor von Sabina Meka im biomedizinischen Forschungszentrum der Universität Olor. Heute möchte ich Ihre Aufmerksamkeit auf ein weitgehend unbekanntes Verfahren nach Kangan und Kollegen lenken: Cy Brilliant Blue ist ein Farbstoff, der üblicherweise zur Sichtbarmachung von Proteinen nach elektrophoretischen Trennungen verwendet wird, wird aber oft als weniger geeignet für die vergleichende Proteomik angesehen.

Allerdings bietet die Coomassie-Kolloidalfärbung im Vergleich zu anderen Methoden überlegene Eigenschaften hinsichtlich Empfindlichkeit, Kosten und Praktikabilität. In unserem Labor verwenden wir die K-Färbeprotokoll für nahezu alle gelfesten Anwendungen, insbesondere jedoch in der analytischen Proteomik, um Veränderungen der myokardialen Proteinausprägung zu bestimmen. Ich werde die Anwendung dieser Methode zur Detektion myokardialer Proteine im alkalischen pH-Bereich zweidimensionaler Elektrophoresegel demonstrieren.

Beginnen wir also. Die erste Dimension der zweidimensionalen Gelelektrophorese ist die isoelektrische Fokussierung oder IEF, und für diese Analyse werden Immobilized-pH-Gradient-Streifen oder IPG-Streifen verwendet.

Vor der IEF werden vier IPG-Streifen einzeln in 125 Mikrolitern Rehydratisierungslösung unter Verwendung der IM Mobilly Dry-Strip-Schwellwanne für mindestens 10 Stunden rehydriert, wodurch die IPG-Streifen rehydriert und bereit für die Applikation der Proteinprobe sind. Mit TCA präzipitierte Proteinproben aus vier verschiedenen Herzpräparationen werden in Pufferpuffer für die IEF bis zu einer Konzentration von 100 Mikrogramm Protein pro 100 Mikroliter gelöst. Die Solubilisierung der Proteinproben benötigt mindestens 30 Minuten bei Raumtemperatur auf einem Vortex.

Unterdessen bereiten Sie die zusätzlichen Komponenten des IM Molene Dry-Strip-Kits vor, um die IEF im Multi-Four-Elektrophoresegerät durchzuführen. Stellen Sie zunächst die Temperatur der Kühlvorrichtung auf 20 Grad Celsius ein, pipettieren Sie drei bis vier Milliliter Abdeckflüssigkeit auf die Kühlplatte und positionieren Sie die Immobilien-Dry-Strip-Schale darauf, wobei die rote Elektrodenverbindung zur Anode zeigt. Gießen Sie etwa 10 Milliliter Abdecköl in die Immobilien-Dry-Strip-Schale und setzen Sie den Immobilien-Dry-Strip-Ausrichter mit der Nutseite nach oben auf die mit Öl bedeckte Schale.

Entfernen Sie anschließend den rehydrierten Streifen aus der Quellwanne und überführen Sie ihn mit der Gel-Seite nach oben in die Rillen des Ausrichters. Das saure Ende des Streifens muss zur Anode zeigen. Am Ende sollten alle Streifen mit ihren anodischen Kanten ausgerichtet sein.

Platzieren Sie seitlich mit destilliertem Wasser gesättigte Elektrodenstreifen an den Enden der Gelstreifen, wobei sichergestellt werden muss, dass die Elektrodenstreifen zumindest teilweise die Geloberfläche berühren. Bringen Sie abschließend die Elektroden auf den Elektrodenstreifen so an, dass die farbliche Markierung in Richtung des entsprechenden elektrischen Kontakts weist. Positionieren Sie die Probenkupferleiste in der Nähe der Anode auf der Immobilien-Dry-Strip-Schale und setzen Sie einen Probenbehälter über jeden IPG-Streifen.

Drücken Sie die Probenkappen vorsichtig nach unten, um einen guten Kontakt mit dem IPG-Streifen sicherzustellen. Gießen Sie 70 bis 80 Milliliter Abdecköl in die Wanne, um die IPG-Streifen zu bedecken. Es sollte kein Öl in die Probenkappen eindringen.

Wenn Öl in die Küvetten austritt, entfernen Sie es mit einer Pipette und stellen Sie die Küvetten erneut ein. Geben Sie abschließend etwa 150 Milliliter Abdecköl hinzu, um die Probenküvetten vollständig zu bedecken. Geben Sie nun die Proteinproben mithilfe einer Pipette unter die Oberfläche der Abdeckflüssigkeit in die Probenküvetten.

Das Volumen der Kappe beträgt 100 Mikroliter. Sobald alle Proteinproben aufgetragen wurden, verbinden Sie alle Kabel. Schließen Sie das Multi-Four-Gerät an die Stromversorgung an und führen Sie die isoelektrische Fokussierung für 11,1 Kilovoltstunden im Gradientenmodus durch. Nach der IEF werden die IPG-Streifen mit der Gel-Seite nach oben in eine Schale gelegt und während der Äquilibrierung einer Reduktion und Alkylierung unterzogen.

Verwenden Sie für die Reduktion 2,5 Milliliter der 1 %igen DTT-Drei-Äquilibrierungslösung pro Streifen. Danach 15 Minuten schütteln und anschließend die DTT-Lösung vollständig ersetzen und die Streifen in 2,5 %iger Iodoacetamid-Äquilibrierungslösung unter Schütteln weitere 15 Minuten alkylieren. Spülen Sie die äquilibrierten Streifen einmal in einem mit Wasser gefüllten Becher und tupfen Sie sie auf Filterpapier, um überschüssige Äquilibrierpufferlösung zu entfernen.

Als Nächstes überführen Sie die Streifen in einen XSDS-Laufpuffer. Die Proteine in den Streifen sind nun bereit für die zweite Dimension der zweidimensionalen Gelelektrophorese. Die zweite Dimension wird mittels SDS-Page an einem vertikalen Elektrophorese-System durchgeführt.

Eine geeignete Anzahl von ein Millimeter dicken 12 %igen Acrylamid-Gelen wird einen Tag vor der Verwendung gegossen und mit nassem Papier abgedeckt aufbewahrt. Bei Raumtemperatur werden die äquilibrierten IPG-Streifen auf die Oberseite der Trenngelen aufgelegt und mit warmer Agarose-Lösung fixiert. Die Proteine werden 2,5 Stunden lang getrennt, wobei mit 80 Volt für 15 Minuten begonnen wird, gefolgt von 120 Volt, bis die Farbstofffront das untere Ende der Gelenkassette erreicht hat.

Während die Proteine durch SDS-Page getrennt werden, bereiten Sie die Lösungen für die kolloidale Kumasisierung im Gel vor. Bei der Herstellung der Färbelösung ist es sehr wichtig, die sequenzielle Zugabe der Komponenten in der folgenden Reihenfolge einzuhalten. Lösen Sie zunächst 100 Gramm Aluminiumsulfat und etwa 1,5 Liter Milli-Q-Wasser in einem Becher und rühren Sie um. Nachdem das Aluminiumsulfat gelöst ist, mischen Sie 200 Milliliter Ethanol unter und geben 0,4 Gramm CBG 250 zur Lösung hinzu.

Sobald das CBB G 250 vollständig gelöst ist, fügen Sie 47 Milliliter ortho-Phosphorsäure hinzu. Dieser Schritt ermöglicht es den Kamasi-Molekülen, in ihren kolloidalen Zustand zu aggregieren. Schließlich geben Sie Milli-Q-Wasser hinzu, bis ein Endvolumen von zwei Litern erreicht ist.

Die endgültige Stehende Lösung enthält schwimmende Partikel. Diese Lösung nicht filtrieren. Die Färbelösung kann auch im Voraus hergestellt und bis zur Verwendung dunkel gelagert werden.

Wenn das SDS-Gel fertig ist, das Gel vorsichtig von den Glasplatten entfernen und in eine Färbeschale überführen, die mit Milli-Q-Wasser gefüllt ist. Die Schale mit dem Gel auf einen horizontalen Schüttler stellen und 10 Minuten lang schütteln.

Wiederholen Sie den Waschschritt noch zweimal für jeweils etwa fünf bis 10 Minuten. Mit frischem Milli-Q-Wasser ist es wichtig, das Gel gründlich zu waschen, da verbliebene SDS im Gel die Bindung des Farbstoffs an das Protein stören und eine geringe Empfindlichkeit verursachen können. Gießen Sie am Ende des dritten Waschschritts das Wasser aus der Schale ab.

Das Gel ist nun bereit zum Färben. Schütteln Sie zunächst die Kumasi-Lösung, um die kolloidalen Partikel gleichmäßig zu verteilen. Geben Sie dann ausreichend Lösung hinzu, um das Gel vollständig zu bedecken.

Die Schale mit der Kumasi-Lösung abgedeckt stellen. Auf einem Schüttler gelieren und zwei bis zwölf Stunden lang schütteln. Nach 10 Minuten erscheinen die ersten Proteinflecken.

80 bis 100 Prozent der Färbung können innerhalb von zwei Stunden Inkubation erreicht werden. Wir empfehlen jedoch eine Übernacht-Inkubation, um eine Färbung nahezu 100 % zu erzielen. Sobald die Färbung abgeschlossen ist, entfernen Sie die Kamasi-Lösung und waschen das Gel zweimal mit Milli-Q-Wasser.

Nach dem Spülen des Gels entfernen Sie mit einem fusselfreien Papiertuch die anhaftenden Farbpartikel aus der Färbeschale. Geben Sie die Entfärbungslösung zum Gel hinzu und lassen Sie sie 10 bis 60 Minuten lang auf dem Schüttler einwirken. Spülen Sie das Gel abschließend zweimal mit Milli-Q-Wasser.

Das Gel nimmt seine ursprüngliche Dicke wieder an, und die Farbintensität der Kumasi-Färbung wird ebenfalls verstärkt. Wenn Sie dieses Protokoll befolgen, sollten Ihre 2D-Gels deutlich aufgelöst sein und gut mit dunkelblauen Proteinflecken gefärbt sein. Das Ergebnis unserer Kumasi-Färbung von 2D-Gels ist vergleichbar mit dem der Silberfärbung.

Entsprechend dem Protokoll von Chef Chenko et al., das sich durch hohe Empfindlichkeit und Verträglichkeit mit der Massenspektrometrie auszeichnet. Am Beispiel der zweidimensionalen Gelelektrophorese haben wir Ihnen soeben gezeigt, wie schnell, einfach und empfindlich kangs cooma sustaining ist. Der Nachweis von Proteinen in po-Acrylamidgelen mittels sustaining kann innerhalb von zwei Stunden abgeschlossen werden.

Das Verfahren selbst erfordert wenig Arbeitsaufwand. Und nicht zuletzt können Sie möglicherweise bereits bis zu einem Nanogramm Protein nachweisen. Dieses Protokoll ist daher auf jeden Fall eine gute Alternative zu den markierungsfreien Methoden der gelfesten Proteomik.

Bei Verwendung des Konservierungsverfahrens ist es wichtig, analytisch gereinigte Chemikalien und Wasser von höchster Reinheit zu verwenden. Darüber hinaus ist die schrittweise Zugabe der Komponenten zur Färbelösung ein entscheidender Schritt bei der Herstellung. Schließlich sollten Sie nicht vergessen, die Gelen nach der elektrophoretischen Trennung gründlich von restlichem SDES zu waschen.

Andernfalls werden Sie nichts auf Ihren Gele sehen. Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.