Schnell und feinfühlig Kolloidale Coomassie G-250 Färbung für Proteine ​​in Polyacrylamidgelen

In diesem Video demonstrieren wir die Leistungsfähigkeit eines modifizierten Kumasi-Färbeprotokolls für den Nachweis von mehreren Nanogramm Protein in Polyacrylamid-Gelen. Am Beispiel der zweidimensionalen Gelelektrophorese vor der First-Dimension-Trennung. Immobilisierte pH-Gradientenstreifen werden unter denaturierenden Pufferbedingungen rehydriert.

Nach dem erneuten Aufquellen der Streifen über Nacht werden die Proteinproben mittels anodischer Becherbeladung appliziert. Bei der Fokussierung werden die Proteine nach ihren isoelektrischen Punkten getrennt. Die Trennung der zweiten Dimension erfolgt über die SDB-Seite.

Das Gel wird dann in eine Färbeschale überführt und die Proteine werden durch Färben mit kolloidalem Kumasi nachgewiesen. Hallo, ich bin Nadine de Bala vom Labor von Sabina Meka im biologisch-medizinischen Forschungszentrum an der Universität Olor. Heute möchte ich Ihre Aufmerksamkeit auf ein weithin unbekanntes Verfahren lenken, das laut Kangan-Kollegen weitgehend unbekannt ist: Cy Brilliant Blue ist ein Deich, der häufig für die Visualisierung von Proteinen nach elektrophoretischen Trennungen verwendet wird, aber oft als weniger geeignet für die vergleichende Proteomik angesehen wird.

Die kolloidale cos-Färbung bietet jedoch überlegene Eigenschaften in Bezug auf Empfindlichkeit, Kosten und Praktikabilität. Wir verwenden das K-Färbeprotokoll in unserem Labor für nahezu durchschnittliche gelbasierte Anwendungen, insbesondere aber in der analytischen Proteomik, um Veränderungen der Myokardproteinexpression zu bestimmen. Ich werde die Verwendung dieser Methode zum Nachweis von Myokardproteinen im alkalischen pH-Bereich von zweidimensionalen Elektrophorese-Gelen demonstrieren.

Also lasst uns loslegen. Ich hab es. Die erste Dimension der 2D-Gelelektrophorese ist die isoelektrische Fokussierung oder IEF, und für diese Analyse werden immobilisierte pH-Gradientenstreifen oder IPG-Streifen verwendet.

Vor der IEF werden vier IPG-Streifen einzeln in 125 Mikrolitern Rehydrationslösung mit dem IM Mobilly Dry Strip Squering Tray für mindestens 10 Stunden rehydriert, wenn die IPG-Streifen rehydriert und bereit für die Proteinprobenapplikation sind. TCA-präzipitierte Proteinproben aus vier verschiedenen Herzpräparaten werden in IEF-Probenpuffer auf eine Konzentration von 100 Mikrogramm Protein pro 100 Mikroliter gelöst. Die Solubilisierung der Proteinproben dauert mindestens 30 Minuten bei Raumtemperatur auf einem Wirbel.

Bereiten Sie in der Zwischenzeit die zusätzlichen Komponenten des IM Molene Trockenband-Kits vor, um IEF in der Multi-Four-Elektrophoreseeinheit durchzuführen. Stellen Sie zunächst die Temperatur des Kühlaggregats auf 20 Grad Celsius ein, pipettieren Sie drei bis vier Milliliter Deckflüssigkeit auf die Kühlplatte und positionieren Sie darauf die Immobilien Trockenbandwanne mit dem roten Elektrodenanschluss in Richtung Anode. Gießen Sie ca. 10 Milliliter Abdecköl in die Immobilien Trockenbandwanne und legen Sie den Immobilien Trockenstreifenausrichter mit der Rillenseite nach oben auf die ölbedeckte Schale.

Als nächstes nimmst du den rehydrierten Streifen aus der Quellschiene und überträgst ihn mit der Gelseite nach oben in die Rillen des Aligners. Das saure Ende des Streifens sollte zur Anode zeigen. Am Ende sollten alle Streifen mit ihren anodischen Kanten ausgerichtet werden.

Legen Sie mit destilliertem Wasser getränkte Elektrodenstreifen seitlich über die Enden der Gelstreifen und stellen Sie sicher, dass die Elektrodenstreifen die Geloberfläche zumindest teilweise berühren. Positionieren Sie abschließend die Elektroden so auf den Elektrodenstreifen, dass die farbige Markierung auf den entsprechenden elektronischen Kontakt gerichtet ist. Positionieren Sie die Probenbecherstange in der Nähe der Anode an der immobilien dry strip Schale und platzieren Sie einen Probenbecher über jedem IPG-Streifen.

Drücken Sie die Probenbecher vorsichtig nach unten, um einen guten Kontakt mit dem IPG-Streifen zu gewährleisten. Gießen Sie 70 bis 80 Milliliter Abdecköl in die Schale, um die IPG-Streifen abzudecken. Es sollte kein Öl in die Probenbecher gelangen.

Wenn Öl in den Becher austritt, entfernen Sie es mit einer Pipette und stellen Sie die Becher wieder ein. Zum Schluss fügen Sie etwa 150 Milliliter Abdecköl hinzu, um die Probenbecher vollständig zu bedecken. Geben Sie nun die Proteinproben in die Probenbecher, indem Sie unter die Oberfläche der Deckflüssigkeit pipettieren.

Das Volumen des Bechers beträgt 100 Mikroliter. Sobald alle Proteinproben appliziert wurden, verbinden Sie alle Elektroden. Schließen Sie das Multi-Four-Gerät an das Stromnetz an und führen Sie eine isoelektrische Fokussierung für 11,1 Kilovoltstunden im Gradientenmodus nach IEF durch. Die IPG-Streifen werden mit der Gelseite nach oben in ein Tablett gelegt und während der Äquilibrierung einer Reduktion und Alkylierung unterzogen.

Zur Reduktion verwenden Sie 2,5 Milliliter 1%ige DI drei et all Äquilibrierungslösung pro Streifen. Danach 15 Minuten lang schütteln und dann die DTT-Lösung vollständig ersetzen und die Streifen in 2,5%I Oto Acetamid-Gleichgewichtslösung alkylieren, wobei weitere 15 Minuten geschüttelt werden. Spülen Sie die Äquilibrierstreifen einmal in einem mit Wasser gefüllten Becherglas ab und tupfen Sie sie auf Filterpapier ab, um überschüssigen Äquilibrierungspuffer zu entfernen.

Übertragen Sie als Nächstes die Strips in einen XSDS-Ausführungspuffer. Die Proteine in den Streifen sind nun bereit für die zweite Dimension der 2D-Gelelektrophorese. Die zweite Dimension wird von der SDS-Seite auf einem vertikalen Elektrophoresesystem durchgeführt.

Eine angemessene Anzahl von einem Millimeter Dicke. 12%ige Acrylamidgele werden einen Tag vor Gebrauch gegossen und mit nassem Papier bedeckt aufbewahrt. Bei Raumtemperatur werden die äquilibrierten IPG-Streifen auf die Trenngele gelegt und mit heißer Agrolösung pro Proteine für 2,5 Stunden getrennt, beginnend bei 80 Volt für 15 Minuten, gefolgt von 120 Volt, bis die Farbstofffront den Boden der Gelkassette erreicht.

Während die Proteine mit der SDS-Seite getrennt werden, bereiten Sie die Lösungen für die kolloidale Kumasi-Färbung am Gel vor. Bei der Herstellung der Färbelösung ist es sehr wichtig, die sequentielle Zugabe der Komponenten in der folgenden Reihenfolge beizubehalten. Zuerst 100 Gramm Aluminiumsulfat und ca. 1,5 Liter Millikubikmeter Wasser in einem Becherglas auflösen und umrühren. Nachdem das Aluminiumsulfat aufgelöst ist, 200 Milliliter Ethanol untermischen und 0,4 Gramm CBG zwei 50 zur Lösung geben.

Sobald das CBB G two 50 vollständig aufgelöst ist, geben Sie 47 Milliliter Orthophosphorsäure hinzu. Dieser Schritt ermöglicht es den Kamasi-Molekülen, sich in ihren kolloidalen Zustand zu aggregieren. Zum Schluss fügen Sie milli Q Wasser bis zu einem Endvolumen von zwei Litern hinzu.

Bei der endgültigen Lösung schwimmen Partikel herum. Filtern Sie diese Lösung nicht. Die Färbelösung kann auch im Voraus vorbereitet und bis zur Verwendung im Dunkeln gelagert werden.

Wenn das SDS-Gel fertig ist. Entfernen Sie das Gel vorsichtig von den Glasplatten und geben Sie es in eine mit Milli Q Wasser gefüllte Färbeschale. Stellen Sie die Schale mit dem Gel auf einen horizontalen Shaker und schütteln Sie sie 10 Minuten lang.

Wiederholen Sie die Wäsche noch zwei Mal für etwa fünf bis 10 Minuten. Mit frischem Milliwürfelwasser ist es wichtig, das Gel gut zu waschen, da verbleibende SDS auf dem Gel die Bindung des Farbstoffs an das Protein stören und zu einer schlechten Empfindlichkeit führen können. Gießen Sie am Ende des dritten Waschgangs das Wasser aus der Schüssel aus.

Das Gel ist nun bereit, gefärbt zu werden. Schütteln Sie zuerst die Kumasi-Lösung, um die kolloidalen Partikel gleichmäßig zu verteilen. Fügen Sie dann so viel Lösung hinzu, dass das Gel bedeckt ist.

Stellen Sie die Schüssel mit der Kumasi-Lösung bedeckt auf. Gel auf einen Shaker geben und zwei bis 12 Stunden lang rühren. Nach 10 Minuten siehst du die ersten Proteinflecken.

80 bis hundert Prozent der Färbung können innerhalb von zwei Stunden nach der Inkubation erreicht werden. Wir empfehlen jedoch eine Inkubation über Nacht, um eine Färbung von nahezu 100 % zu erreichen. Wenn die Färbung abgeschlossen ist, entfernen Sie die Kamasi-Lösung und spülen Sie das Gel zweimal mit Milli Q Wasser ab.

Entfernen Sie nach dem Spülen des Gels anhaftende Farbstoffpartikel mit einem fusselfreien Papiertuch aus der Fleckenschale. Geben Sie die Färbelösung in das Gel und lassen Sie es 10 bis 60 Minuten auf dem Shaker ruhen. Zum Schluss spülen Sie das Gel zweimal mit Milli Q Wasser ab.

Das Gel erhält seine ursprüngliche Dicke zurück und die Farbintensität des Kumasi-Flecks wird ebenfalls erhöht. Wenn Sie dieses Protokoll befolgen, sollte Ihr 2D-Gel deutlich aufgelöst und gut mit dunkelblauen Proteinflecken gefärbt sein. Das Ergebnis unserer Kumasi-Färbung von 2D-Gelen ist vergleichbar mit dem der Silberfärbung.

Gemäß dem Protokoll von Chef Chenko et al., von dem berichtet wird, dass es von hoher Empfindlichkeit und Kompatibilität mit der Massenspektrometrie ist. Am Beispiel der zweidimensionalen Gelelektrophorese haben wir Ihnen gerade gezeigt, wie schnell, einfach und sensibel kangs cooma sustaining ist. Der Nachweis von Proteinen in Po-Acrylamid-Gelen kann innerhalb von zwei Stunden abgeschlossen werden.

Das Verfahren selbst erfordert wenig Arbeit. Und zu guter Letzt können Sie möglicherweise nur ein Nanogramm Protein nachweisen. Dieses Protokoll ist also definitiv eine gute Alternative zu den Unlabeling-Methoden der gefängnisbasierten Proteomik.

Wenn Sie ein Erhaltungsverfahren anwenden, ist es wichtig, daran zu denken, Chemikalien und Wasser von höchster Reinheit zu verwenden. Darüber hinaus ist die sequentielle Zugabe der Komponenten zur Färbelösung ein kritischer Schritt in der Vorbereitung. Vergessen Sie schließlich nicht, die restlichen SDES nach der elektrophoretischen Trennung effizient von den Gelen zu waschen.

Andernfalls siehst du nichts auf deinen Gels. Das war's also. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.