Name: Die Kombination QD-FRET-und Mikrofluidik, um DNA Nanocomplex Self-Assembly in Real-Time Monitor (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-08-26T16:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 36 s
Description: Erfahren Sie die Echtzeitüberwachung von DNA-Nanokomplex-Selbstassemblierung mittels QD-FRET und Mikrofluidik. Diese Methode ermöglicht präzise Kontrolle bei der Synthese von Polyelektrolyt-Polyplexen für Gentherapieanwendungen.

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A. Biotinylierung von DNA Plasmid-DNA wurden kovalent mit Guanin-spezifischen Biotin-Markierungen, wie vom Hersteller (Mirus Bio, Madison, WI) beschrieben, aber skaliert auf ~ 1-2 Biotin Etiketten pro DNA haben biotinyliert. Plasmid-DNA (pEGFP-C1, 4,9 kb, Clontech, Mountain View, CA) wurde in diesem Protokoll bezeichnet. <ol><li> Lösen Sie gewünschte Menge pDNA in TE-Puffer von DNase-frei und RNase-frei (Molekularbiologie-Qualität) Wasser zu einem 1μg/μL DNA-Lösung zu machen. </li><li> Conduct der Kennzeichnung Reaktion unter Verwendung des folgenden Reaktionsmischungen. Fügen Sie die Label IT dauern. </li></ol> Für 100 &amp;mgr; g DNA Reaktion: <table border="1"><tbody><tr><td> DNase-frei und RNase-freies Wasser </td><td> 75 &amp;mgr; l </td></tr><tr><td> 10X Labeling Puffer A </td><td> 20 ul </td></tr><tr><td> 1μg/μL DNA </td><td> 100 ul </td></tr><tr><td> Label IT </td><td> 5 ul </td></tr><tr><td> Gesamtvolumen </td><td> 200 ul </td></tr></tbody></table><ol start="3"><li> Inkubieren Sie die Reaktion bei 37 ° C für 1 Stunde. </li><li> Purify der markierten Probe mit Ethanol oder Isopropanol-Fällung nach Standardprotokollen. </li></ol> Hinweis: Die Gelfiltration auf Spalten zu hohen UV-Absorption oder Fluoreszenz-Hintergrund, die die DNA-Quantifizierung oder Fluoreszenz Charakterisierung beeinträchtigen können. Hinweis: Die Höhe der Biotinylierung kann HABA-Tests ermittelt werden. B. Kennzeichnung der Cy5-kationisches Polymer Chitosan (390 kDa, 83,5% deacetylierte, Vanson, Redmond, WA) wurde als Modell kationischen Polymer in dieser Studie verwendet. Die freie primäre Amine auf das Chitosan Polymerrückgrat wurden mit Cy5-NHS (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) gekennzeichnet. <ol><li> Zur Erleichterung der vollständigen Konjugation von Cy5-Farbstoff, berechnen die erforderliche Menge von Cy5-NHS, dass das molare Verhältnis von Cy5: 200: primäre Amine 1 ist. </li><li> Der pH-Wert der Chitosan-Lösung (in 25 mM Acetatpuffer) bis ~ 6,5 durch Zugabe von NaOH. Beachten Sie, dass der NHS Reaktion effizienter ist bei basischen pH-Wert, aber die Löslichkeit von Chitosan hier Grenzen der Arbeits-pH-Bereich. </li><li> Unter Rühren langsam das berechnete Menge an Cy5-NHS (1 mg / ml DMSO), um die Chitosan-Lösung in einem Drop-by-drop Weise. </li><li> Man schüttelt die Mischung im Dunkeln bei Raumtemperatur über Nacht. </li><li> Zur Reinigung mit 10k MWCO Slide-a-Lyzer (Pierce) für 2 h dialysiert gegen 1% Acetatpuffer bei Raumtemperatur im Dunkeln. </li><li> Ersetzen Puffer und dialysieren weitere 2 Stunden bei Raumtemperatur im Dunkeln. </li><li> Ersetzen Puffer und dialysieren über Nacht bei 4 ° C im Dunkeln. </li><li> Shop gereinigtes markiertes Polymer bei -20 ° C. </li></ol> Hinweis: In dieser Studie wurde ein Standard-Kurve wird durch die Messung der Emissionsintensität Cy5-NHS-Ester bei 670 nm hergestellt. Charakterisieren Sie die Kennzeichnung Dichte durch Messung der erhaltenen Emission bei 670 nm aus Cy5-markierte Chitosan in der Standardkurve. Die Absorption kann auch verwendet werden, um die Kennzeichnung Effizienz zu bestimmen, wurde aber hier nicht durchgeführt. C. Herstellung von QD-markierte DNA-und Cy5-Polymer Das Molverhältnis von pDNA zu QD wurde im Überschuß gehalten (pDNA: QD ≈ 1: 2) zum vollständigen Konjugation von QDs zu pDNA zu gewährleisten. Die Zahl der QDs auf jeden pDNA gekennzeichnet durch TEM-Aufnahmen oder andere gleichwertige Einrichtungen geschätzt werden. In unserer Studie ist die Zahl der QDs pro pDNA schätzungsweise ~ 1-3 von TEM und Einzelmolekül-Spektroskopie. 1 Verwenden Millipore Milli-Q Gradient Wasser (&gt; 18,0 MW, 0.2um gefiltert) während der Vorbereitung. <ol><li> Berechnen Sie die erforderliche Menge von Chitosan für 10 ug pDNA nach gewünschten N / P-Verhältnis, das theoretische Verhältnis von protonierten Aminen in der Chitosan-Lösung, um die negativen Phosphate in die DNA-Lösung. </li><li> Add Streptavidin-funktionalisierten 605QDs (Qdot 605 ITK, Invitrogen, Carlsbad, CA) in den biotinylierten pDNA Lösung. </li><li> Inkubieren Sie die Lösung bei Raumtemperatur im Dunkeln für 15 min. </li><li> Fügen Sie die QD-markierte DNA in 50 mM Natrium-Sulfat-Lösung auf das Endvolumen 200 ul zu machen. </li><li> Verdünnen Cy5-Chitosan, je nach gewünschter N / P-Verhältnis, mit Milli-Q-Wasser auf das Endvolumen 200 ul zu machen. </li></ol> Hinweis: Halten Sie die Reaktion im Dunkeln, um mögliche Ausbleichen zu verhindern. Wichtig: Seien Sie vorsichtig, um die Qdot 605 ITK ™ Streptavidin-Konjugat (die ITK-Serie), wie Quantenpunkte in diesem Katalog für die Zwecke der FRET ausgelegt sind. Die regelmäßige Qdot Serie konjugiert sind mit einer PEG-Schicht, um die unspezifische Bindung zu verhindern, vor allem für die zelluläre Markierung. Allerdings vergrößert sich diese zusätzliche Beschichtung der Donor-Akzeptor-Abstand, was zu reduced Energieübertragungseffizienz. D. Herstellung der SU-8 Masters Verwendung von Standard-Photolithographie <ol><li> Si-Wafer ist Piranha gereinigt und gebacken bei 200 ° C für 5 min. </li><li> Für die ausgewiesenen Meister Dicke von 25 um, Spin Mantel der negativen Photoresist (SU-8 2025 Microchem, Newton, MA) auf Si-Wafer bei 2000 rpm für 30 sek. </li><li> Softbake der Wafer auf einer Heizplatte mit einer Rampe von 65 ° C / h bis 95 ° C. </li><li> Expose mit UV-Licht (365nm) für 250mJ/cm 2 durch eine Maske Film (CAD / Art Services, Bandon, OR) mit dem Design von Mikrokanälen. </li><li> Post-Exposure Bake der Wafer auf einer Heizplatte mit einer Rampe von 65 ° C / h bis 95 ° C. </li><li> Entwickeln Sie die Wafer mit SU-8 Fotolack-Entwickler. </li><li> Die strukturierten Wafer ist hart auf einer Heizplatte mit einer Rampe von 65 ° C gebacken / h bis 200 ° C. Pflegen Sie die Wafer bei 200 ° C für mindestens 5 Stunden, dann allmählich kühler der Wafer auf Raumtemperatur. </li></ol> Wichtig: Schrittweise Rampe während des SU-8 Master Backprozess ist notwendig, da sonst die SU-8-Struktur kann aus dem Silizium-Wafer oder Risse an löste die SU-8-Struktur kann durch Stress-release induziert werden. E. Replica Molding von PDMS von den Meistern und Bonding, um das Deckglas <ol><li> Die SU-8-Master ist in eine Abwägung Boot gelegt. </li><li> Mix Silikon-Elastomer und Härter (Poly (dimethylsiloxan), PDMS, Sylgard 184, Dow Corning, Midland, MI) in einem 10: 1-Verhältnis. </li><li> Gießen Sie die PDMS-Mischung auf die SU-8-Master und lassen Sie das Gewicht von Boot in einem Vakuum-Exsikkator, um Luftblasen zu entfernen. </li><li> Cure die PDMS bei 65 ° C für 1-2 Stunden. </li><li> Schälen Sie die PDMS Streifen aus dem Si Master-Form. </li><li> Punch-Kanal Ein-und Auslässe der fluidischen Gerät. </li><li> Reinigen Sie die PDMS-Streifen und Deckglas mit Ethanol und anschließend an der Luft trocknen. </li><li> Behandeln Sie den gereinigten PDMS-Streifen und Deckglas mit Sauerstoff-Plasma (20W für 1min). </li><li> Unmittelbar Bindung der PDMS-Streifen mit Deckglas. </li><li> Lassen Sie die verklebten Mikrofluidik-Chip in den Ofen bei 95 ° C über Nacht. </li></ol> Wichtig: Plasma-Behandlung und Übernachtung Backen sind unerlässlich, um verbesserte Haftfestigkeit. F. Überwachung der Bildung von DNA Nanokomplexen In der Mikrofluidikvorrichtung <ol><li> Füllen Sie den mikrofluidischen Kanal mit Wasser (um sicherzustellen, gibt es keine Blasen innerhalb der mikrofluidischen Kanal), vor dem Laden der Reagenzien reibungslosen Ablauf während des Experiments zu gewährleisten. </li><li> Laden Sie die QD-markierte DNA-und Cy5-markierte Chitosan-Lösungen in zwei einzelnen Glasspritzen, durch den Schlauch in das Video beschrieben. </li><li> Schließen Sie den Schlauch mit den beiden Eingängen der mikrofluidischen Bauteilen. Seien Sie vorsichtig, nicht, um die Luft während des Prozesses vorstellen. Stellen Sie den Durchfluss bei 20nL/min (PHD-2000 Spritzenpumpe Holliston, MA), unter Laminar-Flow-Bedingungen. </li><li> Überprüfen Sie die Mikrokanäle unter dem Mikroskop. </li><li> Wenn die Strömung stabil (~ 15 bis 20 Minuten), FRET QD-vermittelte sollte in der Mitte des Kanals beobachtet werden. </li><li> Nehmen Fluoreszenz Bilder (gekühlte CCD, Qimaging, BC, Canada) an verschiedenen Orten entlang des Kanals. </li><li> Analysieren Sie die Fluoreszenzbilder mit ImageJ und OriginLab. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1432/1432fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. QD-FRET bietet ein empfindlicher Indikator für das Auftreten von DNA Nanokomplexen self-assembly <ol style="list-style-type:lower-alpha;"><li> Quantum dot-vermittelte Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer (QD-FRET) kann ein quantitativer und hochempfindlicher Angabe Polyplex Stabilität in entweder extra-oder intrazellulären Umgebungen zu schaffen, der für eine eindeutige Erkennung des Beginns der Wechselwirkungen zwischen DNA und das Gen Träger. Die FRET-Paar, 605QD und Cy5, wurde basierend auf der Maximierung spektrale Überlappung zwischen den Donor-und Akzeptor und zur Minimierung potentieller cross-talk gewählt. Für dieses Paar ist der Förster Distanz 69.4Å. 3 </li><li> Self-Assembly der QD-FRET DNA Nanokomplexen. Anionische Plasmid-DNA (pDNA) und dem kationischen Gen Träger wurden mit QD (Energie-Donor) und Cy5 (Energie-Akzeptor) markiert jeweils. QD-FRET Nanokomplexen wurden durch elektrostatische Komplexkoazervation gebildet. Nach Anregung bei 488 nm, angegeben QD-FRET-vermittelte Cy5-Emission Bildung einer kompakten und intakte nanocomplex. Die Verweilzeit (t R) kann je nach der Entfernung (x), welche, von wo aus die beiden Ströme, um die Position der Reaktion untersucht, und die mittlere Strömungsgeschwindigkeit (v) treffen Maßnahmen berechnet werden. Aufgrund der Beschaffenheit der laminaren Strömung, Vermischung erfolgt nur an der Schnittstelle (Mitte jedes Bild), die eine genaue Berechnung der Stofftransport in Abhängigkeit von t R. Zeitliche Auflösung kann durch Variation der applie eingestellt werdend Flussraten. (Inset) FRET-vermittelten Signaltransduktion wurde sofort an der Schnittstelle, wenn die beiden Ströme trafen beobachtet, was darauf hinweist, dass die Bindung war schnell, innerhalb von wenigen Millisekunden nach dem angewandten Flussraten. Maßstab: 100 um. </li></ol>

<ol><li>Ho, Y. P., Chen, H. H., Leong, K. W., Wang, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+the+intracellular+stability+and+unpacking+of+DNA+nanocomplexes+by+quantum+dots-FRET%5BTitle%5D)+AND+%22J+Control+Release%22%5BJournal%5D)">Evaluating the intracellular stability and unpacking of DNA nanocomplexes by quantum dots-FRET.</a> J Control Release. 116, 83-89 (2006).</li>
<li>Chen, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+comparison+of+intracellular+unpacking+kinetics+of+polyplexes+by+a+model+constructed+from+quantum+dot-FRET%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Quantitative comparison of intracellular unpacking kinetics of polyplexes by a model constructed from quantum dot-FRET.</a> Mol. Ther. 16, 324-332 (2008).</li>
<li>Zhang, C. Y., Yeh, H. C., Kuroki, M., Wang, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Quantum-Dot-Based+DNA+Nanosensor%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Mat%22%5BJournal%5D)">Single-Quantum-Dot-Based DNA Nanosensor.</a> Nat Mat. 4, 826-831 (2005).</li>
</ol>

Die Autoren haben keine Offenlegungen vorzunehmen.

<ul><li> Die Bedeutung unserer Arbeit: <ol><li> Dies ist der erste Versuch, polymeren DNA nanocomplex self-assembly-Kinetik in Echtzeit (Millisekunden-Auflösung) durch QD-FRET Antworten Monitor in einem einfachen Mikrofluidik-Chip. </li><li> QD-vermittelte FRET bietet eine hoch empfindliche und quantitative Angabe der Beginn der molekularen Wechselwirkungen und in der self-assembly-Prozess, während Mikrofluidik bietet eine gut kontrollierte Mikroumgebung räumlichen Analyse der Prozess während der DNA-Synthese nanocomplex. </li><li> Die Integration von Mikrofluidik und Nanophotonik schlägt einen neuen und interessanten Ansatz, um jede Art von Komplexierung Reaktionen zu untersuchen. </li><li> Die daraus resultierende QD-FRET polymeren DNA Nanokomplexen konnte leicht für die Errichtung Struktur-Funktions-Beziehungen angewendet werden. 1,2 </li></ol></li></ul>

<table><tbody><tr><td>SU-8</td><td>MicroChem Corp.</td><td>SU-8 2025</td><td></td></tr><tr><td>PDMS</td><td>Dow Corning</td><td>Sylgard 184</td><td></td></tr><tr><td>Plasmid-DNA</td><td>Clontech Laboratories</td><td>pEGFP-C1</td><td>4,9 kb, MW = 3,3 × 10&lt;sup&gt;6&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Label&lt;/em&gt;IT Biotin-Markierungskit</td><td>Mirus Bio LLC</td><td>MIR 3400</td><td>Der Standardprotokoll ergibt eine Markierungseffizienz von etwa einer Markierung pro 20–60 bp doppelsträngiger DNA; die Markierungsdichte wurde in dieser Arbeit angepasst.</td></tr><tr><td>Streptavidin 605QD</td><td>Invitrogen</td><td>Qdot&amp;#174; 605 ITK&amp;#174; Streptavidin-Konjugat</td><td></td></tr><tr><td>Cy5-NHS-Ester</td><td>Amersham</td><td>PA15101</td><td></td></tr><tr><td>Chitosan</td><td>Vanson</td><td>390 kDa</td><td>83,5 % deazetyliert</td></tr><tr><td>Deckglas</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545C</td><td>No. 1; Größe: 40 × 22 mm</td></tr><tr><td>Gasdichter Glasspritze</td><td>Hamilton Co</td><td>TLL-Serie</td><td>50&amp;#x03BC;L bis 500&amp;#x03BC;L, abhängig vom Probenvolumen</td></tr><tr><td>Tygon-Schlauch</td><td>Small Parts, Inc.</td><td>0,02 ID, 100 ft</td><td>Tygon-Mikroschläuche, 0,02 Innendurchmesser, 100 ft</td></tr><tr><td>Verbinder</td><td>Small Parts, Inc.</td><td>HTX-23R</td><td>Angepasst in der Länge auf 0,750&quot;</td></tr><tr><td>Spritzenpumpe</td><td>Harvard Apparatus</td><td>PHD-2000</td><td></td></tr><tr><td>CCD</td><td>QImaging</td><td>Intensified Retiga gekühlt</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Olympus Corporation</td><td>BX-51</td><td>100-W-Quecksilberbogenlampe</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>National Institutes of Health</td><td>v1.36b</td><td>http://rsb.info.nih.gov/ij</td></tr><tr><td>Origin Pro8</td><td>OriginLab</td><td>Studentenversion</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop-Filter-Sets</td><td>Omega Optical</td><td>475AF40</td><td>Anregungsfilter in beiden Kanälen</td></tr><tr><td>Mikroskop-Filter-Sets</td><td>Omega Optical</td><td>595AF60</td><td>Emissionsfilter im 605QD-Kanal</td></tr><tr><td>Mikroskop-Filter-Sets</td><td>Omega Optical</td><td>670DF40</td><td>Emissionsfilter im QD-FRET-Kanal</td></tr><tr><td>Mikroskop-Filter-Sets</td><td>Omega Optical</td><td>500 DRLP</td><td>Durchlassfilter mit langer Wellenlänge (Dichroik) im 605QD-Kanal</td></tr><tr><td>Mikroskop-Filter-Sets</td><td>Omega Optical</td><td>595DRLP</td><td>Durchlassfilter mit langer Wellenlänge (Dichroik) im QD-FRET-Kanal</td></tr></tbody></table>

die kombination qd-fret-und mikrofluidik, um dna nanocomplex self-assembly in real-time monitor

Combining QD-FRET and Microfluidics to Monitor DNA Nanocomplex Self-Assembly in Real-Time

Advances in Genomik weiterhin die Entwicklung von Therapeutika, die Pathogenese auf zellulärer und molekularer Ebene Ziel-Kraftstoff. In der Regel funktionale innerhalb der Zelle, benötigen Nukleinsäure-basierten Therapeutika eine effiziente intrazelluläre Delivery-System. Ein weit verbreiteter Ansatz besteht darin, komplexe DNA mit einem Gen Träger Nanokomplexen über elektrostatische Selbstorganisation bilden, erleichtert die zelluläre Aufnahme von DNA und schützt es vor dem Abbau. Die Herausforderung liegt darin das rationale Design von effizienten Gen-Trägern, da vorzeitige Dissoziation oder übermäßig stabile Bindung würde sich nachteilig auf die zelluläre Aufnahme und therapeutische Wirksamkeit. Nanokomplexen durch Masse mischen synthetisiert zeigte ein breites Spektrum von intrazellulären Auspacken und Menschenhandel Verhalten, das der Heterogenität in Größe und Stabilität der Nanokomplexen zugeschrieben wurde. Solche Heterogenität erschwert die genaue Beurteilung der self-assembly Kinetik und fügt zu der Schwierigkeit bei der Korrelation von ihren physikalischen Eigenschaften Transfektionseffizienz oder Bioaktivitäten. Wir präsentieren ein neuartiges Konvergenz der Nanophotonik (dh QD-FRET) und Mikrofluidik, um die Echtzeit-Kinetik der nanocomplex self-assembly unter Laminar Flow zu charakterisieren. QD-FRET bietet einen hochempfindlichen Hinweis auf das Auftreten von molekularen Wechselwirkungen und quantitative Messung während der Synthese, während Mikrofluidik bietet eine gut kontrollierte Mikroumgebung räumlich analysieren den Prozess mit hoher zeitlicher Auflösung (~ Millisekunden). Für das Modellsystem der polymeren Nanokomplexen, wurden zwei unterschiedliche Phasen in den Self-Assembly-Prozess durch diese analytische Plattform erfasst. Die kinetische Aspekt der Selbstorganisation auf der Mikroebene erhalten würden als besonders wertvoll für Mikroreaktor-basierte Reaktionen, die für viele Mikro-und Nano-Anwendungen sind. Ferner kann Nanokomplexen durch richtige Gestaltung der microfludic Geräte angepasst werden, und die daraus resultierenden QD-FRET polymeren DNA Nanokomplexen leicht könnte für die Errichtung Struktur-Funktions-Beziehungen angewendet werden.

Wir präsentieren ein neuartiges und leistungsfähige Integration der Nanophotonik (QD-FRET) und Mikrofluidik, um die Bildung von Polyelektrolyt Polyplexe, die voraussichtlich zu einer besseren Kontrolle und die Synthese von einheitlichen und anpassbare Polyplexe für zukünftige Nukleinsäure-basierten Therapeutika bieten ist zu untersuchen.

Die Kombination QD-FRET-und Mikrofluidik, um DNA Nanocomplex Self-Assembly in Real-Time Monitor

Fortschritte in der Genomik treiben kontinuierlich die Entwicklung von Therapeutika voran, die die Pathogenese auf zellulärer und molekularer Ebene gezielt adressieren können. Typischerweise ...

Dieses Verfahren beginnt mit der Markierung der DNA und des Polymers, um einen Quantenpunkt- oder QD-FRET-Pear-Plasma-DNA-Konjugat herzustellen, das mit Quantenpunkten versehen ist – dem Energiedonator – und das Polymer mit einem organischen Farbstoff, Flora Four Sci Fünf, dem Energieakzeptor, markiert wird.Beim Mischen von QD-FRET entstehen nano-komplexe durch elektrostatische Selbstorganisation, und das QD-vermittelte FRET-Signal kann dann verfolgt werden, während die Wechselwirkung stattfindet. Dieses QD-FRET-System wird in einen mikrofluidischen Kanal eingeführt, in dem die Komponenten ausschließlich über Diffusion an der Mischgrenzfläche interagieren. Die Selbstorganisation der DNA-Nanokomplexe kann anschließend durch die Kombination von QD-FRET und Mikrofluidik überwacht werden.Hallo, ich bin Megan Ho aus dem Labor für Bios und Einzelmoleküldynamik der Abteilung für Maschinenbau an der Johns Hopkins University. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren, mit dem Quantenpunkte und Mikrofluidik kombiniert werden, um die Selbstorganisation von DNA-Nageln in Echtzeit zu überwachen. In unserem Labor verwenden wir dieses Verfahren, um DNNL-Komplexe für die Lokalisation der Gentherapie zu untersuchen.Beginnen wir also. Ein Biotin-Markierungs-Kit von MIRIs bio wird verwendet, um plasmatische DNA kovalent mit guaninspezifischen Biotin-Markern zu markieren, wobei die Skalierung so gewählt ist, dass etwa ein bis zwei Biotin-Marker pro DNA-Molekül vorliegen. Zunächst wird die gewünschte Menge an plasmatischer DNA in TE-Puffer gelöst, um eine DNA-Lösung mit einer Konzentration von einem Mikrogramm pro Mikroliter herzustellen.Richten Sie die Markierungsreaktion durch Mischen von plasmafreier DNA-, RNA-freier Wasser, 10× Markierungspuffer A und dem Label-it-Reagenz ein. Das Label-it-Reagenz wird zuletzt hinzugefügt. Inkubieren Sie die Reaktion eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius.Nach der einstündigen Inkubation die markierte Probe durch Ethanolpräzipitation reinigen. Gemäß Standardprotokollen. Die markierte DNA bis zur Verwendung bei minus 20 Grad Celsius lagern.Der nächste Schritt besteht darin, das ionische Polymer zu markieren. In dieser Demonstration verwenden wir Chitosan als Modell für ein ionisches Polymer und markieren die freien primären Amine am Chitosan-Polymergerüst mit Sci-Fi-NHS. Berechnen Sie zunächst die erforderliche Menge an Sci-Fi-NHS, sodass das molare Verhältnis von Sci-Fi zu primären Aminen 1 zu 200 beträgt. Dies ermöglicht eine vollständige Konjugation des Sci-Fi-Farbstoffs.Fügen Sie Natronlauge zu der Chitosan-Lösung in 25 Millimolar Acetatpuffer hinzu, um den pH-Wert unter langsamer Rühration auf etwa 6,5 einzustellen. Geben Sie die berechnete Menge an sci-fi NHS tropfenweise zur Chitosan-Lösung hinzu. Verschließen Sie das Gefäß mit Aluminiumfolie, um die Mischung im Dunkeln zu halten, und schütteln Sie sie über Nacht bei Raumtemperatur. Am nächsten Tag reinigen Sie die Mischung durch Dialyse mit einer 10 K-M-W-C-O-Schleife von Pierce gegen 1 %igen Acetatpuffer, die zwei Stunden bei Raumtemperatur im Dunkeln dialysiert wird.Nach zwei Stunden den 1 %igen Acetatpuffer ersetzen und weitere zwei Stunden dialysieren. Bei Raumtemperatur im Dunkeln den Puffer erneut wechseln und über Nacht bei vier Grad Celsius im Dunkeln dialysieren. Am nächsten Tag das gereinigte markierte Polymer aus der Dialyseschachtel entnehmen.Das mit SCI fünfmarkierte Chitosan wird dann in einem Mikrozentrifugenröhrchen gesammelt und bei minus 20 Grad Celsius gelagert. Geben Sie die mit Streptavidin funktionalisierten 6 0 5 Dots in die biotinylierte Plasma-DNA-Lösung. Stellen Sie sicher, dass Sie die ITK-Serie der Q-Dots verwenden, die zum Konjugat vorbereitet sind, anstelle der regulären Q-Dot-Serie, da die Quantenpunkte der ITK-Serie für den Einsatz in FRET vorgesehen sind.Die Lösung 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Die QD-Markierungsreaktion im Dunkeln aufbewahren, um eine mögliche Photobleichung zu verhindern. Nach 15 Minuten die mit QD markierte DNA zu einer 50 Millimolar Natriumsulfatlösung hinzufügen, um ein Endvolumen von 200 Mikrolitern zu erreichen.Um das Sci-Fi-Polymer vorzubereiten, berechnen Sie die erforderliche Menge an Chitosan für 10 Mikrogramm Plasmadna gemäß dem gewünschten NP-Verhältnis, das das theoretische Verhältnis protonierter Aminogruppen in der Chitosanlösung zu den negativen Phosphatgruppen in der DNA-Lösung angibt. Verdünnen Sie das Sci-Fi-Chitosan gemäß dem gewünschten NP-Verhältnis mit Milli-Q-Wasser, um ein Endvolumen von 200 Mikrolitern zu erhalten. Die mit QD markierte DNA- und die Sci-Fi-Chitosanlösung sind nun bereit, in die mikrofluidische Vorrichtung geladen zu werden, wie in Abschnitt sechs gezeigt wird. Der Silikonwafer wird vorab durch Piranha-Reinigung und Einbacken vorbereitet, um Feuchtigkeit auf dem Wafer zu entfernen, für die vorgesehene Masterdicke von 25 Mikrometern. Bestreichen Sie den negativen Fotolack auf dem Silikonwafer bei 2000 U/min für 30 Sekunden. Die Wafer auf einer Heizplatte mit einer Aufheizrate von 65 Grad Celsius pro Stunde auf 95 Grad Celsius weich aushärten. Dadurch verdunstet das Lösungsmittel im SU-8-Photoresist und härtet sich vor der Bestrahlung mit UV-Licht aus.Nach dem weichen Backen eine Maskenfolie mit dem Design der Mikrokanäle auf dem Siliziumwafer aufbringen und diesem UV-Licht mit einer Wellenlänge von 365 Nanometern bei einer Dosis von 250 Millijoule pro Quadratzentimeter aussetzen. Den Wafer danach auf einer Heizplatte mit einer Aufheizrate von 65 Grad Celsius pro Stunde auf 95 Grad Celsius backen. Den Wafer mit SU-8-Photoresistentwickler entwickeln, um eine vollständige Entwicklung zu überprüfen.Tauchen Sie das Wafer in Isopropanol. Das Isopropanol sollte nicht trüb werden. Schließlich, um die SU-8-Struktur zu verstärken, das strukturierte Wafer auf einer Heizplatte mit einer Aufheizrate von 65 Grad Celsius pro Stunde auf 200 Grad Celsius aushärten.Halten Sie das Wafer bei 200 Grad Celsius mindestens fünf Stunden lang auf. Kühlen Sie das Wafer anschließend schrittweise auf Raumtemperatur ab. Stellen Sie den SU-acht-Master in ein Wiegeschälchen.Mischen Sie das Silikonelastomer und das Härtungsmittel Polydimethylsiloxan oder PDMS im Verhältnis 10 zu 1. Gießen Sie die PDMS-Mischung auf die SU-8-Masterform und lassen Sie das Wägeboot im Vakuumtrockner, um Blasen zu entfernen. Härten Sie das PDMS bei 65 Grad Celsius für eine bis zwei Stunden aus.Nachdem das PDMS ausgehärtet ist, die PDMS-Streifen mithilfe eines Vollstanzgeräts von der Silikonform abziehen, wobei zwei Kanalzuführungen und eine Kanalabführung für die fluidische Vorrichtung entstehen. Den PDMS-Streifen und das Deckglas mit Ethanol reinigen und anschließend lufttrocknen. Den gereinigten PDMS-Streifen und das Deckglas mit Sauerstoffplasma bei 20 Watt behandeln.Verbinden Sie den PDMS-Streifen sofort mit dem Deckglas. Lassen Sie den verbundenen mikrofluidischen Chip über Nacht im Ofen bei 95 Grad Celsius. Eine Plasmabehandlung und das Backen über Nacht sind entscheidend, um die Bindungsstärke zu erhöhen.Bevor die Reagenzien geladen werden, füllen Sie den mikrofluidischen Kanal mit Wasser, um sicherzustellen, dass sich keine Blasen im Inneren befinden. Dies gewährleistet einen gleichmäßigen Fluss. Laden Sie während des Experiments die zuvor hergestellten Lösungen mit QD-markierter DNA und sci-fi-markiertem Chitosan in zwei separate Glasspritzen über die Schläuche ein.Verbinden Sie den Schlauch mit den beiden Einlässen des mikrofluidischen Geräts. Achten Sie darauf, während des Vorgangs keine Luft einzuschleusen. Stellen Sie die Flussrate unter laminarer Strömung auf 20 Nanoliter pro Minute ein.Überprüfen Sie die Mikrokanäle unter dem Mikroskop, wenn der Durchfluss stabil ist, etwa 15 bis 20 Minuten nach Beginn. Der durch QD vermittelte FRET sollte in der Kanalmitte beobachtet werden. Nehmen Sie fluoreszierende Bilder an verschiedenen Stellen entlang des Kanals mit einer gekühlten CCD-Kamera auf.Analysieren Sie diese Bilder mit ImageJ und OriginLab. Das FRET-vermittelte Signal wird an verschiedenen axialen Positionen entlang des Kanals überwacht. Die Verweilzeit wird anhand der applizierten Flussrate anhand dieser Formel berechnet, wobei TISA quer die Verweilzeit ist.Die Zeit X ist der Abstand vom Punkt, an dem die beiden Ströme zusammentreffen, bis zur Position der untersuchten Reaktion. Und V ist die mittlere Fließgeschwindigkeit. Die intensitätsbasierten Querschnittsprofile der FRET-vermittelten Sci-Fi-Signale können dann in unserem System analysiert werden.Die experimentell gemessenen Profile weisen eine Gauß-Verteilung auf. Wir haben Ihnen gerade gezeigt, wie man DNA-Nagel-Komplexe über einen quantenvermittelten Faden in einem einfachen Mikrofluidkanal überwacht. Bei der Durchführung dieser Verfahren ist es wichtig, einen Markierungspunkt in Ihrem Mikrofluidkanal zu entwerfen, damit die Verweilzeit direkt anhand der angelegten Flussrate und der Kanalgeometrie bestimmt werden kann.Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg mit Ihrem Experiment.

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Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Droplet-based mikrofluidischen Plattformen sind vielversprechende Kandidaten für einen hohen Durchsatz Experimente, da sie in der Lage, Picoliter, Selbst-compartmentalized Schiffe kostengünstig erzeugen bei kHz Preise sind. Durch die Integration mit schnellen, empfindlichen und hoch aufgelöste Fluoreszenz-spektroskopischen Methoden kann die große Mengen von Informationen in diesen Systemen erzeugt effizient extrahiert werden können, genutzt und verwertet werden.

Fluoreszenz-Nachweisverfahren für Mikrofluidik-Tropfen-Plattformen

Dieses Video beschreibt eine Methode, um die Assemblierung von Fusionsprotein-Kondensaten auf DNA-Molekülen an bestimmten Loci mit Hilfe von Einzelmolekül-Bildgebung zu visualisieren. Diese Kondensate werden durch LCD-LCD- und LCD-DBD-Wechselwirkungen gebildet, die die Rekrutierung von RNA-Polymerase II und eine verbesserte Gentranskription ermöglichen.

Einzelmolekül-Bildgebung zur Visualisierung der Ansammlung von Fusionsprotein-Kondensaten auf DNA-Vorhängen

Hier beschreiben wir die Instrumentierung und Verfahren zum Nachweis einzelner fluoreszenzmarkierten Proteinmoleküle in Wechselwirkung mit einem einzelnen DNA-Molekül zwischen den zwei optisch eingeschlossene Mikrokügelchen suspendiert.

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Wir präsentieren einen mikrofluidischen Biochip-basierten elektrochemischen DNA-Hybridisierung für Erkennung. Folgende ssDNA-Sonde Funktionalisierung werden die Spezifität, Empfindlichkeit und Nachweisgrenze mit komplementären und nicht-komplementären ssDNA Ziele untersucht. Ergebnisse veranschaulichen den Einfluss der DNA-Hybridisierungsereignisse auf dem elektrochemischen System, mit einer Nachweisgrenze von 3,8 nM.

Einem mikrofluidischen Biochip-basierte Elektrochemische für Markierungsfreie DNA-Hybridisierungsanalyse

Wir beschreiben einen digitalen Endpunkt-Assay zur Quantifizierung von Nukleinsäuren mit einer vereinfachten (analogen) Auslesung. Wir messen die Massenfluoreszenz von tröpfchenbasierten digitalen Assays mit einem Standard-qPCR-Gerät anstelle von speziellen Instrumenten und bestätigen unsere Ergebnisse durch Mikroskopie.

Einfache Massen Auslesen des digitalen Nukleinsäure Quantifizierung Assays

Wir schlagen eine einfache Selbstorganisationstechnik von kolloidalen Siliziumdioxid-Nanopartikeln vor, um eine nanofluidische Verbindung zwischen zwei Mikrokanälen in Polydimethylsiloxan (PDMS) zu erzeugen. Mit dieser Technik wurde eine nanoporöse Kügelchenmembran mit einer Porengröße von bis zu ~45 nm in einem Mikrokanal aufgebaut und auf die elektrokinetische Vorkonzentration von DNA-Proben aufgebracht.

Erstellen von Unter 50 Nm nanofluidische Junctions in PDMS mikrofluidischen Chip über Selbstorganisation von kolloidalen Teilchen

Einzellige Sequenzierung zeigt genotypischen Heterogenität in biologischen Systemen, aber aktuelle Technologien fehlen des Durchsatzes für die Tiefe Profilierung der Zusammensetzung und Funktion notwendig. Hier beschreiben wir einen mikrofluidischen Workflow für die Sequenzierung &gt; 50.000 einzellige Genome aus verschiedenen Zell-Populationen.

Eine höchste Durchsatz mikrofluidischen Plattform für einzellige Genom-Sequenzierung

Mit Hilfe von Quantenpunkt-markierter DNA und Totalreflexionsfluoreszenzmikroskopie können wir den Reaktionsmechanismus von Restriktionsendonukleasen untersuchen, während wir unmarkierte Proteine verwenden. Diese Einzelmolekültechnik ermöglicht die massiv gemultiplexte Beobachtung einzelner Protein-DNA-Wechselwirkungen, und Daten können gepoolt werden, um gut bevölkerte Verweilzeitverteilungen zu erzeugen.

Einzelmolekül-Verweilzeitanalyse der Restriktionsendonuklilease-vermittelten DNA-Spaltung

Hier beschreiben wir die Verwendung der Einzelmolekül-Bildgebungsmethode DNA Curtains, um den biophysikalischen Mechanismus von EWS-FLI1-Kondensaten zu untersuchen, die sich auf DNA ansammeln.

Einzelmolekül-Bildgebung von EWS-FLI1-Kondensaten auf DNA

Die visuelle Einzelmolekülbiochemie, die durch mikrofluidische Kammern untersucht wird, wird durch Glaszylinder, gasdichte Spritzen, stabile Verbindungen von Schläuchen zu Durchflusszellen und Beseitigung von Blasen durch Platzierung von Schaltventilen zwischen Spritzen und Schläuchen erheblich erleichtert. Das Protokoll beschreibt duale optische Fallen, die die Visualisierung von DNA-Transaktionen und intermolekularen Interaktionen ermöglichen.

Verwendung von zwei optischen Pinzetten und Mikrofluidik für Einzelmolekülstudien

Erfahren Sie die Echtzeitüberwachung von DNA-Nanokomplex-Selbstassemblierung mittels QD-FRET und Mikrofluidik. Diese Methode ermöglicht präzise Kontrolle bei der Synthese von Polyelektrolyt-Polyplexen für Gentherapieanwendungen.

Die Kombination QD-FRET-und Mikrofluidik, um DNA Nanocomplex Self-Assembly in Real-Time Monitor

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