Beziehen High Quality-RNA aus Einzel-Zellpopulationen in menschlichen Postmortem Gehirngewebe

Wir beschreiben ein Verfahren mittels Laser-Mikrodissektion zu isolieren und zu extrahieren RNA aus einer homogenen Zellpopulation, pyramidalen Neuronen in der Schicht III des oberen temporalen Gyrus in postmortalen menschlichen Gehirnen. Wir anschließend linear verstärken (T7-based) mRNA und hybridisieren die Probe auf die Affymetrix menschlichen X3P Microarray.

Dieses Verfahren beginnt mit dem Schneiden von acht Mikrometer flüssigem Stickstoffdampf gefrorenen Gewebeblöcken auf einem Kryostaten, der auf minus 17 Grad Celsius eingestellt ist, auf einfache, ungeladene Glasobjektträger. Danach werden die Schnitte mit dem histo gene staining kit gefärbt. Nach der Identifizierung der pyramidalen Neuronen werden die etwa 500 Zellen mit dem Laser auf die HS-Capture-Kappe aufgebracht.

Die Kappe mit den Zellen wird in ein Mikrozentrifugenröhrchen mit 50 Mikrolitern Extraktionspuffer gelegt, auf den Kopf gestellt und in ein zuvor im Irak positioniertes Falcon-Röhrchen gelegt, das in einem auf 42 Grad Celsius eingestellten Wasserbad sitzt. Nach einem kurzen Zentrifugationsschritt wird die Kappe entfernt. Die restliche Lösung ist dann bereit für die RNA-Isolierung.

Hallo, ich bin Charmaine Peterson aus dem Labor von Wilson Wu in der Abteilung für strukturelle und molekulare Neurowissenschaften am McLean Hospital. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Lasererfassung von Parametall-Neuronen aus menschlichem postmortalem Hirngewebe. Wir verwenden dieses Verfahren in unserem Labor, um die differentielle Genexpression bei den oberen und armen Gyrus von Schizophrenie-Probanden mit Hilfe der Microarray-Technologie zu untersuchen.

Also lasst uns loslegen. Das Hirngewebe wurde vom Harvard Brain Tissue Resource Center als gefrorene Blöcke mit flüssigem Stickstoffdampf vor der Gewebeschnittung gewonnen. Es ist wichtig, die RNA-Kontamination zu reduzieren Alle Oberflächen, einschließlich des Arbeitsbereichs, der Schnittklinge und der Objektträger, werden mit einer RNA-Dekontaminationslösung wie RNA SAP behandelt und mit 100%igem Ethanol abgewischt.

Dieses Verfahren beginnt mit dem Schneiden von gefrorenen Gewebeblöcken mit flüssigem Stickstoffdampf auf einem Kryostaten bei minus 17 Grad Celsius auf einfache, ungeladene Objektträger. Die Gewebeschnitte sind nun bereit für die Identifizierung von pyramidalen Neuronen mit dem histo gene quick staining kit. Bereiten Sie die Ethanol-Dehydratisierungsserie vor: Aliquot 25 Milliliter der entsprechenden Ethanolkonzentrationen und RNA-freies Wasser in die Färbegefäße, die mit dem Histo-Gen-Kit geliefert werden.

Stellen Sie alle Gläser bis auf ein 75%iges Ethanolglas in einen Eiskübel. Legen Sie das 75%ige Ethanol in den Gefrierschrank bei minus 20 Grad Celsius. Bereiten Sie als Nächstes die Färbelösung vor, indem Sie einen Mikroliter RNAs-Inhibitor pro 100 Mikroliter Färbelösung hinzufügen.

Da wir vier Gewebeschnitte auf zwei Objektträgern färben werden, werden vier Mikroliter RNAs-Inhibitor zu 400 Mikrolitern der Färbelösung in einem Mikrozentrifugenröhrchen gegeben. Bewahren Sie die Färbelösung auf Eis auf. Unter einem Abzug.

Geben Sie Molekularsiebe in das Xylolglas, um überschüssiges Wasser zu entfernen, das den Gewebeauftrieb beeinträchtigen könnte. Schalten Sie das Wasserbad bei einer Temperatur von 42 Grad Celsius ein und stellen Sie ein 50-Milliliter-Falcon-Rohr mit einem Gestell in das Wasserbad. Nehmen Sie zwei Objektträger aus dem minus 80 Grad Celsius heißen Gefrierschrank und tauen Sie sie auf einem Kim-Tuch auf.

Fixieren Sie das Taschentuch für ca. 30 Sekunden oder bis die Ecken der Objektträger aufzutauen beginnen, kurz im 75%igen Ethanol für 30 Sekunden im minus 20 Grad Celsius warmen Gefrierschrank. Übertragen Sie dann die Objektträger mit einer RNA-freien Pinzette für eine 32. Wäsche in nukleasefreies Wasser. Nachdem die Objektträger gewaschen wurden, umreißen Sie die Schnitte mit einem PAP-Barrierestift, um die Färbelösung auf dem Schnitt zu konzentrieren. Färben Sie die vier Abschnitte 20 Sekunden lang mit der histo-Gen-Färbelösung. Mit 97 Mikrolitern des Stain-Slash-RNAs-Inhibitors pro Schnitt dehydrieren die Schnitte im zuvor vorbereiteten Ethanol auf Eis für 30 Sekunden pro Schritt.

Der letzte Schritt mit 100 % Ethanol sollte auf drei Minuten verlängert werden, um eine ausreichende Dehydrierung für eine angemessene Gewebestraffung zu erreichen. Tauchen Sie schließlich die Objektträger fünf Minuten lang in Xylol, lassen Sie die Objektträger vollständig an der Luft trocknen, bevor Sie mit der Laser-Capture-Mikrodissektion fortfahren. Die pyramidalen Neuronen müssen sofort nach dem Färben des Verfahrens für die Einzelzell-Laser-Capture entfernt werden. Die MIKRODISSEKTION oder LCM erfordert ein 42 Grad Celsius heißes Wasserbad, das ein 50 Milliliter Falcon-Rohr enthält, das von einem zuvor aufgestellten Röhrchen getragen wird.

Das Einzelzellen-LCM wird mit dem ARCTURUS XT Lasererfassungssystem und der Software realisiert. Um diesen Vorgang zu starten, laden Sie die Objektträger und Kappen auf das arcturus XT-Gerät. Verwenden Sie die Capture-HS-Kappen, behalten Sie jedoch die Programmeinstellung auf Makro bei.

Klicken Sie auf die Box mit Übersicht, um ein Übersichtsfoto zu jeder Folie zu erhalten. Stellen Sie den Helligkeitsfokus auf zwei x Vergrößerung ein, um den optimalen Ausschnitt für die Laseraufnahme zu bestimmen. Vermeiden Sie Gewebeschnitte mit übermäßiger Faltung, sondern wählen Sie Abschnitte, die intakt, glatt und fleckig sind.

Platzieren Sie eine Kappe über dem allgemeinen Bereich, in dem Sie aufnehmen werden, und stellen Sie sicher, dass der zu erfassende Bereich in unserem Fall enthalten ist. Schicht drei des Kortex. Achten Sie darauf, dass die Kappenschienen nicht auf Falten aufliegen, da dies die Kappe kippt, was zu variablen Punktgrößen führt.

Bestätigen Sie anschließend die Position des IR-Laserspots manuell bei der 40-fachen Vergrößerung. Das blaue Kreuz sollte innerhalb des IR-Laserspots zentriert sein. Wenn nicht, passen Sie die Position an, indem Sie mit der rechten Maustaste auf den Punkt klicken und den lokalisierten IR-Punkt auswählen.

Bei 40-facher Vergrößerung identifizieren Sie pyramidale Neuronen nach den folgenden Kriterien, erstens, dass Zellen unsere pyramidale Form haben, und zwei, der proximale Teil der apikalen und/oder basalen Dendriten sind identifizierbar. Speichern Sie die Position der Kappe, indem Sie auf das Pluszeichen bei der Positionsfunktion klicken. Auf diese Weise kehrt die Kappe, wenn sie verschoben wird, immer an genau die Stelle zurück, für die Sie die Spotgröße angepasst haben.

Geben Sie diese Werte in das Steuerfeld ein: 70 in Leistung und 16 in Dauer. Da diese Parameter spezifisch für unser Gewebe sind, empfehlen wir Ihnen, diese Variablen entsprechend Ihrer spezifischen Gewebeprobe zu testen und anzupassen, bevor Sie beginnen. Deaktivieren Sie bei der Lasererfassung einzelner Zellen die Option zum automatischen Verschieben der Stufe, und stellen Sie sicher, dass das Symbol in der richtigen Größe mit dem Symbol auf dem Bedienfeld auf der rechten Seite übereinstimmt.

Wählen Sie die Kreisoption unten rechts aus, um ein Neuron auszuwählen, das Sie testen möchten. Nachdem Sie das blaue Kreuz mit dem Kreis ausgerichtet haben, aktivieren Sie den Laser, indem Sie auf IR-Spot testen klicken. Der vom Laser erzeugte Fleck sollte zunächst einen scharfen dunklen Ring um das aufgenommene Objekt haben.

Stellen Sie sicher, dass der Ring groß genug ist, um die Zelle zu umfassen, aber klein genug, dass er kein unerwünschtes Gewebe oder andere Zellen enthält. Wenn dieser Ring zu hell ist, wurde die Zelle nicht erfasst. Wenn sich in der Mitte des dunklen Rings ein dunkler Fleck befindet, ist die Dauer des Laserstärke-Schrägstrichs zu groß.

Wiederholen Sie diesen Vorgang an verschiedenen Teilen des Gewebes innerhalb der Schicht, die Sie erfassen möchten. Um sicherzustellen, dass sich die Spotgröße je nach Standort nicht unterscheidet, passen Sie sie entsprechend an. Identifizieren Sie pyramidale Neuronen für die Erfassung von etwa 500 Zellen.

Drücken Sie die Laser-Capture-Taste, um Zellen zu erfassen. Bewegen Sie die Kappe auf die QC-Station. Stellen Sie sicher, dass mindestens 90 % der Neuronen entfernt wurden.

Wenn nicht, fangen Sie mehr Zellen in dem Bereich, in dem die meisten Zellen gefangen wurden. Setzen Sie die Kappe in ein 0,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen mit 50 Mikrolitern Extraktionspuffer ein. Die Kappe wurde so konzipiert, dass sie perfekt passt, um ein Auslaufen des Puffers zu verhindern.

Drehen Sie die Baugruppe auf den Kopf, achten Sie darauf, dass der Extraktionspuffer die gesamte Kappe bedeckt, und legen Sie ihn auf den Boden des 50-Milliliter-Falcon-Rohrs in das auf 42 Grad Celsius eingestellte Wasserbad. Inkubieren Sie die Neuronen 30 Minuten lang, um das Gewebe nach der Inkubation von der Kappe zu entfernen, zentrifugieren Sie das Röhrchen und die Kappenbaugruppe zwei Minuten lang bei 800 g. Entfernen Sie nach der Zentrifugation die Kappe.

Wenn die RNA-Isolierung erst zu einem späteren Zeitpunkt durchgeführt wird. Lagern Sie den restlichen Zellextrakt bei minus 80 Grad Celsius. Andernfalls fahren Sie mit der Isolierung von RNA aus dem Zellextrakt fort, wie im nächsten Abschnitt gezeigt. Die RNA-Isolierung wird mit dem reinen PICO-Isolationskit durchgeführt, das für die Isolierung einer kleinen Anzahl von Zellen aus LCM-Proben und die Beibehaltung von mRNA mit geringer Abundanz ausgelegt ist.

Um dieses Verfahren zu starten, fügen Sie dem Zellextrakt 70 % Ethanol hinzu und zentrifugieren Sie es auf einer vorkonditionierten Reinigungssäule. Um die RNA nach dem Waschen an den Säulenfilter zu binden, behandeln Sie die RNA mit D Ns, um das Risiko einer DNA-Interferenz auszuschließen. Dieser Schritt ist besonders wichtig bei nachgelagerten Anwendungen wie Echtzeit-R-T-P-C-R.

Nach dem DNA-Aufschluss fügen Sie 40 Mikroliter Waschpuffer eins hinzu und zentrifugieren Sie die Aufreinigungssäule 15 Sekunden lang bei 8.000 gs. Danach fahren Sie mit den Waschgängen gemäß dem mit dem Kit gelieferten Protokoll fort, verlängern Sie jedoch den letzten Waschschritt mit Waschpuffer zwei von zwei auf zweieinhalb Minuten, um sicherzustellen, dass kein Waschpuffer in der Säule verbleibt. was Ihre RNA-Ausbeute verringern kann. Übertragen Sie die Säule in ein anderes Mikrozentrifugenröhrchen. Fügen Sie den elucianischen Puffer hinzu und inkubieren Sie eine Minute lang auf dem Filter in der Säule, zentrifugieren Sie die Säule, um die RNA zu eluieren.

Überprüfen Sie abschließend die Qualität der extrahierten RNA, indem Sie einen Experian High Sense-Laborchip ausführen, der ein virtuelles Gel und eine Elektropherogrammpipette bereitstellt und 1,3 Mikroliter der Probe in ein 0,5-Milliliter-Röhrchen umfüllt. Für die Qualitätskontrolle frieren Sie den Rest der Probe bei minus 80 Grad Celsius ein. Sobald die Qualität der RNA verifiziert ist, kann sie amplifiziert, markiert und hybridisiert werden.

Für die Analyse des Genexpressionsprofils werden zwei Runden der linearen Amplifikation mit dem Ribo-Amp HS plus-Kit durchgeführt, was zu etwa 50 Mikrogramm amplifizierter RNA führen sollte, die für die Durchführung von Microarray- und Q-R-T-P-C-R-Experimenten ausreicht. Das Turbo-Biotin-Markierungskit und die Markierung von molekularen Geräten werden verwendet, um die amplifizierte RNA zu markieren. Abschließend wird ein Genexpressions-Profiling mit dem humanen X three P Genchip-Programm von atrix durchgeführt.

Die Gewebeschnittung sollte zu zwei Objektträgern mit zwei Schnitten pro Objektträger führen, insgesamt vier Schnitte pro Fall. Jeder Abschnitt sollte glatt sein und nur minimale Risse, Risse oder Falten aufweisen. Die pyramidalen Neuronen sollten etwa 20 bis 25 Mikrometer groß dunkel gefärbt sein, pyramidenförmig und mit sichtbaren apikalen Dendriten versehen.

Während der LCM, nachdem der Laser durch die thermoplastische Folie gepulst ist, haften die Zellen an der Kappe und befinden sich daher nicht mehr auf dem Objektträger und hinterlassen das umgebende Gewebe. Dahinter sollten etwa 85 bis 100% der Neuronen mit den Capture-HS-Kappen bei Makroeinstellungen und korrekter Einstellung der Laserleistung und -stärke an der Kappe haften. Für jeden Schnitt sollten Sie etwa 500 bis 700 Zellen pro Schnitt erhalten, was zu mindestens 500 Pikogramm Gesamt-RNA pro Fall führt.

Nach der vollständigen RNA-Isolierung wird die RNA-Qualität mittels eines Elektropherogramms und eines virtuellen Gels über den BioRad Experian bewertet. Im Elektropherogramm sollten Sie zwei deutliche Peaks sehen, die den ribosomalen RNA-Einheiten von 18 s und 20 s mit postmortalem Gewebe entsprechen. Dies ist jedoch nicht immer der Fall, da das Gewebe aufgrund von Faktoren vor der Sektion abgebaut werden kann.

Normalerweise sehen Sie eine große Beule, die auf eine Degradation hinweist, mit einem großen Peak um 18 s und einem kleineren Peak von 28 s, wie durch die roten Pfeile angezeigt. Im Gegensatz dazu wird RNA von schlechter Qualität mit zu starkem Abbau durch ein Elektropherogramm mit einer großen Fläche unter ihrer Kurve angezeigt. Neben einer Herunterverschiebung des Ortes der Ausbreitung, um die Qualität der mRNA nach zwei Runden linearer Amplifikation zu testen, verwenden wir sowohl den BioRad Experian Standard Sense Laborchip als auch das NanoDrop-Spektralphotometer.

Die herkömmliche Microarray-Technologie von Atrics erfordert, dass die mRNA-Transkriptspreizung mindestens 600 Nukleotide lang ist, um mit diesem Protokoll nachgewiesen zu werden. Die mRNA-Ausbreitung erreichte den Bereich von 1000 Nukleotiden, wie das Elektropherogramm zeigt, mit großen Peaks, die in Abhängigkeit von der Zeit langsam abfielen. Dieses Ergebnis wird auch durch das virtuelle Gel bestätigt.

Wenn die Transkriptlängen kürzer als 600 Nukleotide sind, sollte die Probe nicht eingeschlossen werden. Für die Hybridisierung zeigten die NanoDrop-Messwerte ein durchschnittliches Verhältnis von zwei 60 über zwei 80 oder eine Reinheit von 2,5 über die Proben. Die durchschnittliche Konzentration betrug 1,7 Mikrogramm pro Mikroliter, was zu etwa 50 Mikrogramm mRNA pro Probe führte, ausreichend sowohl für die Microarray-Analyse als auch für die anschließende Validierung, die zwischen 15 und 20 Mikrogramm mRNA und die anschließende Validierung der Ergebnisse mit QR TPCR erfordert. Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass mit diesem Protokoll sowohl die Menge als auch die Qualität der erhaltenen RNA gut genug ist, um Unterschiede in der Genexpression über den Atrix Human X Three P Chip zu untersuchen.

Nach der Hybridisierung mit dem Atrics Human X three P-Chip erreichten wir prozentuale Aufrufe von durchschnittlich 26,6 %, was auf eine angemessene Hybridisierung und Sondenintensität hinweist. Wir haben Ihnen gerade gezeigt, wie man Parametall-Neuronen aus postmortalem menschlichem Hirngewebe per Laser einfangen kann, um die aus diesen Zellen gewonnene RNA zu verwenden. Bei Microarray-G-Profiling-Studien ist es bei diesem Verfahren wichtig, alle Schritte in einer RNA-freien Umgebung durchzuführen und die Schritte rechtzeitig abzuschließen, um die RNA-Integrität zu erhalten.

Das war's also. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.