Beziehen High Quality-RNA aus Einzel-Zellpopulationen in menschlichen Postmortem Gehirngewebe

Dieses Verfahren beginnt mit dem Schneiden von acht Mikrometer dicken, in flüssigem Stickstoffdampf gefrorenen Gewebeproben an einem auf minus 17 Grad Celsius eingestellten Kryostaten auf einfache, unbeladene Glasobjektträger. Anschließend werden die Schnitte mit dem Histo-Gene-Färbesatz gefärbt. Nach Identifizierung der Pyramidenneurone werden etwa 500 Zellen mittels Laserstrahl auf die HS-Kapselfolie übertragen.

Die Kappe mit den Zellen wird in ein Mikrozentrifugenröhrchen mit 50 Mikrolitern Extraktionspuffer gegeben, das auf den Kopf gestellt wurde, und in ein Falcon-Röhrchen platziert, das zuvor im Irak positioniert war, und in ein Wasserbad bei 42 Grad Celsius gestellt. Nach einem kurzen Zentrifugationsschritt wird die Kappe entfernt. Die verbleibende Lösung ist dann bereit für die RNA-Isolierung.

Hallo, ich bin Charmaine Peterson aus dem Labor von Wilson Wu in der Abteilung für Strukturelle und Molekulare Neurowissenschaften am McLean Hospital. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zum Laser-Mikrodissektion von parametallenen Neuronen aus menschlichem postmortalen Hirngewebe. In unserem Labor verwenden wir dieses Verfahren, um die differentielle Genexpression in den oberen und unteren Gyrus bei Schizophrenie-Patienten mittels Mikroarray-Technologie zu untersuchen.

Beginnen wir also. Gehirngewebe wurde vom Harvard Brain Tissue Resource Center als in flüssigem Stickstoffdampf eingefrorene Blöcke bezogen, bevor das Gewebe in Schnitte zerlegt wurde. Es ist wichtig, RNA-Kontaminationen auf allen Oberflächen zu vermeiden; daher werden der Arbeitsbereich, das Schneidemesser und die Objektträger mit einer RNA-Entkontaminierungslösung wie RNA SAP behandelt und mit 100 %igem Ethanol abgewischt.

Dieses Verfahren beginnt mit dem Schneiden von auf Trockeneis gefrorenen Gewebeproben an einem Kryostaten bei minus 17 Grad Celsius auf einfache, unbeschichtete Objektträger. Die Gewebeschnitte sind nun bereit zur Identifizierung von Pyramidenneuronen mithilfe des Histo-Gene-Schnellfärbekits. Bereiten Sie die Alkohol-Dehydrierungsreihe vor, indem Sie jeweils 25 Milliliter der entsprechenden Ethanol-Konzentrationen sowie RNA-freies Wasser in die mit dem Histo-Gene-Kit bereitgestellten Färbegefäße abfüllen.

Stellen Sie alle Gläser bis auf ein 75 % Ethanol-Glas in einen Eisbehälter. Dieses 75 % Ethanol-Glas stellen Sie in den Gefrierschrank bei minus 20 Grad Celsius. Bereiten Sie anschließend die Färbelösung vor, indem Sie je 100 Mikroliter Färbelösung ein Mikroliter RNase-Inhibitor hinzufügen.

Da vier Gewebeschnitte auf zwei Objektträgern gefärbt werden, werden vier Mikroliter RNase-Inhibitor in einem Mikrozentrifugenröhrchen zu 400 Mikrolitern der Färbelösung hinzugefügt. Die Färbelösung auf Eis lagern. Unter einem Abzug.

Geben Sie Molekularsiebe in das Xylol-Gefäß, um überschüssiges Wasser zu entfernen, das die Gewebeprobe beeinträchtigen könnte. Schalten Sie das Wasserbad ein, stellen Sie die Temperatur auf 42 Grad Celsius ein und stellen Sie ein 50-Milliliter-Falcon-Röhrchen, das in einem Rack befestigt ist, in das Wasserbad. Entnehmen Sie zwei Objektträger aus dem Minus-80-Grad-Celsius-Gefrierschrank und lassen Sie sie auf einem Kim-Tuch antauen.

Fixieren Sie das Gewebe für ungefähr 30 Sekunden oder gerade so lange, bis die Ecken der Objektträger anfangen, aufzutauen, kurz in 75 % Ethanol für 30 Sekunden im minus 20 Grad Celsius kalten Gefrierschrank. Übertragen Sie die Objektträger danach mit RNA-freier Pinzette zur 32-sekündigen Wäsche in nukleasefreies Wasser. Nach dem Waschen der Objektträger umreißen Sie die Schnitte mit einem PAP-Sperrenstift, um die Färbelösung auf dem Schnitt zu konzentrieren, und färben Sie die vier Schnitte 20 Sekunden lang mit der Histo-Gene-Färbelösung. Dehydratisieren Sie die Schnitte mit jeweils 97 Mikrolitern der Färbelösung pro Schnitt, angereichert mit RNase-Inhibitor, in dem zuvor auf Eis vorgekühlten Ethanol für jeweils 30 Sekunden pro Schritt.

Der abschließende 100 % Ethanol-Schritt sollte auf drei Minuten verlängert werden, um eine ausreichende Dehydrierung für eine adäquate Gewebeliftung zu erreichen. Anschließend die Objektträger fünf Minuten lang in Xylol eintauchen und vollständig an der Luft trocknen lassen, bevor mit der Laser-Mikrodissektion fortgefahren wird; die pyramidalförmigen Neurone müssen unmittelbar nach der Färbung im Verfahren zur Einzelzell-Laser-Mikrodissektion entfernt werden. Die MIKRODISSEKTION oder LCM erfordert ein Wasserbad mit 42 Grad Celsius, das einen 50-Milliliter-Falcon-Röhrchen enthält, der zuvor aufgestellt wurde.

Die Einzelzell-LCM wird mit dem ARCTURUS XT-Lasererfassungssystem und der dazugehörigen Software durchgeführt. Um dieses Verfahren zu beginnen, laden Sie die Objektträger und Kappen in das Arcturus-XT-Gerät ein. Verwenden Sie die Capture-HS-Kappen, behalten Sie jedoch die Programmeinstellung auf Makro.

Klicken Sie auf das Feld „Laden mit Übersicht“, um ein Übersichtsfoto jeder Probe zu erhalten. Stellen Sie die Helligkeit und den Fokus bei zweifacher Vergrößerung ein, um den optimalen Bereich für die Laser-Mikrodissektion zu bestimmen. Vermeiden Sie Gewebeschnitte mit übermäßiger Faltung, wählen Sie jedoch Schnitte, die intakt, glatt und gefärbt sind.

Platzieren Sie eine Kappe über dem allgemeinen Bereich, in dem die Aufnahme erfolgen soll, wobei sichergestellt werden muss, dass der Aufnahmебereich in unserem Fall Schicht drei der Großhirnrinde umfasst. Achten Sie darauf, dass die Kappenrillen auf keiner Falte aufliegen, da dies die Kappe kippen und zu variablen Fleckgrößen führen würde.

Als Nächstes bestätigen Sie manuell die Position des IR-Laserflecks bei 40-facher Vergrößerung. Das blaue Kreuz sollte mittig innerhalb des IR-Laserflecks liegen. Falls dies nicht der Fall ist, passen Sie die Position an, indem Sie mit der rechten Maustaste auf den Fleck klicken und „IR-Laserfleck positionieren“ auswählen.

Bei 40-facher Vergrößerung identifizieren Sie Pyramidenzellen anhand der folgenden Kriterien: Erstens müssen die Zellen eine pyramidenförmige Gestalt aufweisen, und zweitens müssen der proximale Abschnitt des apikalen und/oder der basalen Dendriten erkennbar sein. Speichern Sie die Position der Kappe, indem Sie auf das Pluszeichen in der Positions-Funktion klicken. Auf diese Weise kehrt die Kappe, falls sie verschoben wird, stets exakt an dieselbe Stelle zurück, für die Sie die Fleckgröße eingestellt haben.

Geben Sie diese Werte in das Steuerfeld ein: 70 für Leistung und 16 für Dauer. Da diese Parameter spezifisch für unser Gewebe sind, empfehlen wir, dass Sie diese Variablen an Ihr spezifisches Gewebeprobe anpassen, bevor Sie beginnen. Aktivieren Sie bei der Lasererfassung einzelner Zellen die Option „Autobewegung des Stages“ nicht und stellen Sie sicher, dass das Symbol der richtigen Größe mit dem Symbol auf dem rechten Bedienfeld übereinstimmt.

Wählen Sie unten rechts die Kreisoption aus, um ein Neuron auszuwählen, dessen Erfassung Sie testen möchten. Richten Sie nach der Auswahl das blaue Kreuz mit dem Kreis aus und aktivieren Sie den Laser, indem Sie auf „Test IR Spot“ klicken. Der vom Laser erzeugte Punkt sollte zunächst einen scharfen, dunklen Ring um das erfasste Objekt aufweisen.

Stellen Sie sicher, dass der Ring groß genug ist, um die Zelle einzuschließen, aber klein genug, um unerwünschtes Gewebe oder andere Zellen auszuschließen. Wenn dieser Ring zu hell ist, wurde die Zelle nicht erfasst. Wenn ein dunkler Fleck in der Mitte des dunklen Rings sichtbar ist, ist die Laserintensität beziehungsweise -dauer zu hoch.

Wiederholen Sie diesen Vorgang an verschiedenen Stellen des Gewebes innerhalb der Schicht, die Sie erfassen möchten. Um sicherzustellen, dass die Fleckgröße unabhängig vom Ort nicht variiert, passen Sie entsprechend an. Identifizieren Sie etwa 500 pyramidale Neuronen zur Erfassung.

Drücken Sie die Laser-Erfassungstaste, um die Zellen zu erfassen. Bewegen Sie die Kappe zur QC-Station. Stellen Sie sicher, dass mindestens 90 % der Neuronen entfernt wurden.

Falls nicht, erfassen Sie mehr Zellen in dem Bereich, in dem die meisten Zellen erfasst wurden. Setzen Sie die Kappe in ein 0,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen, das 50 Mikroliter Extraktionspuffer enthält. Die Kappe wurde so konstruiert, dass sie perfekt sitzt und ein Austreten des Puffers verhindert.

Drehen Sie die Vorrichtung um, stellen Sie sicher, dass der Extraktionspuffer die gesamte Kappe bedeckt, und stellen Sie sie auf den Boden eines 50-Milliliter-Falcon-Röhrchens in das auf 42 Grad Celsius eingestellte Wasserbad. Inkubieren Sie die Neuronen 30 Minuten lang, um das Gewebe von der Kappe zu lösen. Anschließend zentrifugieren Sie die Röhrchen-Kappe-Vorrichtung zwei Minuten bei 800 ×g. Entfernen Sie nach der Zentrifugation die Kappe.

Falls die RNA-Isolierung erst zu einem späteren Zeitpunkt durchgeführt wird, lagern Sie den verbleibenden Zellextrakt bei minus 80 Grad Celsius. Andernfalls fahren Sie mit der Isolierung der RNA aus dem Zellextrakt wie im nächsten Abschnitt gezeigt fort. Die RNA-Isolierung wird mit dem PICO pure Isolationskit durchgeführt, das dafür konzipiert ist, geringe Zellzahlen aus LCM-Proben zu isolieren und mRNA mit geringer Häufigkeit zu erhalten.

Um dieses Verfahren zu beginnen, geben Sie das mit dem Kit bereitgestellte 70 % Ethanol zum Zellextrakt hinzu und zentrifugieren Sie die Probe in einer vorbereiteten Reinigungssäule. Um die RNS nach dem Waschen an den Säulenfilter zu binden, behandeln Sie die RNS mit DNs, um das Risiko einer DNA-Störung auszuschließen. Dieser Schritt ist insbesondere bei nachfolgenden Anwendungen wie der Echtzeit-R-T-P-C-R von großer Bedeutung.

Nach der DNA-Digestion 40 Mikroliter Waschpuffer eins hinzufügen und die Reinigungssäule 15 Sekunden bei 8.000 G zentrifugieren. Danach fortfahren mit den Waschschritten gemäß der mit dem Kit bereitgestellten Anleitung, jedoch den endgültigen Waschschritt mit Waschpuffer zwei von zwei auf zweieinhalb Minuten verlängern, um sicherzustellen, dass kein Waschpuffer in der Säule verbleibt, was die RNA-Ausbeute verringern könnte. Die Säule in ein anderes Mikrozentrifugenröhrchen überführen. Den Elutionspuffer hinzufügen und eine Minute auf dem Filter in der Säule inkubieren, dann die Säule zentrifugieren, um die RNA zu eluieren.

Überprüfen Sie abschließend die Qualität der extrahierten RNA mithilfe eines Experian High Sense Lab-Chips, der ein virtuelles Gel und ein Elektropherogramm liefert. Pipettieren Sie 1,3 Mikroliter der Probe in ein 0,5-Milliliter-Röhrchen. Für die Qualitätskontrolle sollte der Rest der Probe bei minus 80 Grad Celsius eingefroren werden. Sobald die RNA-Qualität bestätigt ist, kann sie amplifiziert, markiert und hybridisiert werden.

Für die Genexpressions-Profilierungsanalyse werden zwei Runden der linearen Amplifikation mit dem Ribo Amp HS Plus-Kit durchgeführt, wodurch etwa 50 Mikrogramm amplifizierte RNA erhalten werden sollten, was ausreicht, um sowohl Microarray- als auch Q-R-T-P-C-R-Experimente durchzuführen. Das Turbo-Biotin-Markierungskit von Molecular Devices wird zur Markierung der amplifizierten RNA verwendet. Schließlich erfolgt die Genexpressions-Profilierung unter Verwendung des Human X Three P Gene Chip Pro Beret von Atrix.

Die Gewebeschnittführung sollte zu zwei Objektträgern mit jeweils zwei Schnitten führen, insgesamt vier Schnitte pro Fall. Jeder Schnitt sollte glatt sein mit minimalen Einrissen, Rissen oder Faltungen. Die pyramidalförmigen Neurone sollten dunkel angefärbt sein, etwa 20 bis 25 Mikrometer groß, pyramidalförmig und mit sichtbaren apikalen Dendriten.

Während der LCM haften die Zellen nach dem Durchtrennen des thermoplastischen Films durch den Laser an der Kappe und befinden sich somit nicht mehr auf dem Objektträger mit dem umgebenden Gewebe. Hinter etwa 85 bis 100 % der Neuronen sollten an der Kappe haften, wenn die Erfassungskappen (HS-Kappen) in Makroeinstellung verwendet und die Laserleistung sowie -stärke korrekt eingestellt sind. Für jeden Schnitt sollten Sie etwa 500 bis 700 Zellen pro Schnitt erhalten, was pro Fall mindestens 500 Pikogramm Gesamt-RNA ergibt.

Nach der Gesamt-RNA-Isolierung wird die RNA-Qualität mittels eines Elektropherogramms und eines virtuellen Gels mit dem BioRad Experian bewertet. Im Elektropherogramm sollten zwei deutliche Peaks zu erkennen sein, die den 18S- und 28S-Ribosomen-RNA-Einheiten bei postmortalem Gewebe entsprechen. Dies ist jedoch nicht immer der Fall, da das Gewebe aufgrund von Faktoren vor der Schnittstellung möglicherweise bereits degradiert ist.

Sie werden normalerweise eine große Erhöhung sehen, die auf eine Degradation hinweist, mit einem großen Peak bei etwa 18 s und einem kleineren Peak bei 28 s, wie durch die roten Pfeile angezeigt. Im Gegensatz dazu weist eine schlechte RNA-Qualität mit übermäßiger Degradation auf ein Elektropherogramm mit einer großen Fläche unter der Kurve hin. Zusätzlich zu einer Verschiebung der Lage der Bandenbreite zur Überprüfung der Qualität der mRNA nach zwei Runden linearer Amplifikation verwenden wir sowohl den BioRad Experian Standard Sense Lab-Chip als auch das NanoDrop-Spektrophotometer.

Die herkömmliche Atrics-Mikroarray-Technologie erfordert, dass die Länge der mRNA-Transkriptverbreitung mindestens 600 Nukleotide beträgt, um mit diesem Protokoll nachgewiesen werden zu können. Die Ausdehnung der mRNA erreichte den Bereich von 1000 Nukleotiden, wie durch das Elektropherogramm mit großen Peaks angezeigt, die langsam als Funktion der Zeit abfallen. Dieses Ergebnis wird ebenfalls durch das virtuelle Gel bestätigt.

Wenn die Transkriptlängen kürzer als 600 Nukleotide sind, sollte die Probe nicht einbezogen werden. Für die Hybridisierung zeigten die NanoDrop-Messungen ein durchschnittliches Verhältnis der Absorptionswerte bei 260 nm zu 280 nm oder eine Reinheit von 2,5 über alle Proben hinweg. Die durchschnittliche Konzentration betrug 1,7 Mikrogramm pro Mikroliter, was zu etwa 50 Mikrogramm mRNA pro Probe führte, ausreichend sowohl für die Microarray-Analyse als auch für die anschließende Validierung, für die zwischen 15 und 20 Mikrogramm mRNA benötigt werden, sowie für die nachfolgende Validierung der Ergebnisse mittels qRT-PCR. Unsere Ergebnisse zeigen, dass mit diesem Protokoll sowohl Menge als auch Qualität der gewonnenen RNA ausreichend gut sind, um Genexpressionsunterschiede mittels des Affymetrix Human X3P-Chips zu untersuchen.

Nach der Hybridisierung an den Atrics Human X three P-Chip erzielten wir Prozentaufrufe mit einem Durchschnitt von 26,6 %, was auf eine ausreichende Hybridisierung und Probensignalintensitäten hinweist. Wir haben Ihnen soeben gezeigt, wie man parametale Neurone aus postmortalem menschlichem Hirngewebe mittels Lasermikrodissektion gewinnt, um die aus diesen Zellen gewonnene RNA zu nutzen. Bei Mikroarray-G-Profilierungsstudien ist es wichtig, alle Schritte in einer RNA-freien Umgebung durchzuführen und die Arbeitsschritte zeitnah abzuschließen, um die RNA-Integrität zu bewahren.

Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.