RNA Isolation aus embryonalen Zebrafisch und cDNA-Synthese für die Genexpressionsanalyse

Um die RNA-Isolierung zu beginnen und ausreichende Ausbeuten zu erzielen, werden 50 Zebrafischembryonen in ein mikrofusiertes Mörchengefäß überführt. Die RNA wird zunächst nach gründlicher Homogenisierung mit Triol, Reagenz und Chloroform extrahiert. Anschließend wird die RNA mithilfe des Qiagen RNEZ-Minikits gereinigt und aufgereinigt, um hochwertige, nicht degradierte Gesamt-RNA für zukünftige Anwendungen und die Langzeitlagerung zu erhalten.

Die RNA wird in das stabilere cDNA-Produkt umgeschrieben. Die cDNA wird gereinigt, um den ursprünglichen RNA-Vorlagestrang zu entfernen. Hallo, mein Name ist Sam Peterson aus dem Labor von Dr. Jennifer Freeman am Fachbereich Gesundheitswissenschaften der Purdue University.

Heute zeigen wir Ihnen, wie man hochwertige RNA aus ganzen Zebrafischembryonen extrahiert und in das cDNA-Produkt umwandelt. Typischerweise verwenden wir dieses Verfahren, um Genexpressionsprofile zu untersuchen. Beginnen wir also.

Bei der Arbeit mit RNA ist es sehr wichtig, in einer Umgebung zu arbeiten, die frei von RNasen ist. Gehen Sie einfache Vorsichtsmaßnahmen ein, wie beispielsweise reservierte Pipetten für ausschließliche Verwendung bei RNA-Verfahren und das Besprühen des Arbeitsbereichs mit einer RNase-Entfernungslösung, bevor die Isolierung der Gesamt-RNA beginnt. Beginnen Sie die Extraktion in der Abzugshaube und überführen Sie 50 Zebrafischembryonen in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Entfernen Sie so viel Wasser wie möglich und geben Sie sofort 250 Mikroliter Triol-Reagenz, das Phenol enthält, hinzu.

Verwenden Sie einen Pellet-Mörserstößel, um die Embryonen etwa 20 Mal zu zerkleinern und homogenisieren, bis das Gewebe ausreichend disruptiert ist. Geben Sie anschließend 750 Mikroliter Triazol-Reagenz hinzu und inkubieren Sie fünf Minuten bei Raumtemperatur, um eine vollständige Dissoziation der nukleären Protein-Komplexe zu ermöglichen. Sobald die fünf Minuten abgelaufen sind, fügen Sie 0,2 Milliliter Chloroform hinzu, mischen durch Schwenken des Röhrchens für 15 Sekunden und inkubieren die Probe zwei Minuten bei Raumtemperatur. Zentrifugieren Sie danach bei 12.000 ×g für 15 Minuten bei vier Grad Celsius.

Die Mischung trennt sich in eine untere rote Phenol-Chloroform-Phase, eine Interphase und eine farblose obere wässrige Phase. Die obere Schicht beträgt etwa 0,6 Millimeter und enthält die RNA. Überführen Sie die gesamte obere wässrige Schicht, etwa 0,6 Millimeter, vorsichtig in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen, wobei darauf geachtet werden muss, dass keine Bestandteile der Interphase mitübertragen werden. Um die RNA anschließend auszufällen, fügen Sie 0,5 Milliliter Isopropanol hinzu und mischen Sie gründlich.

Und lassen Sie die Probe 10 Minuten bei Raumtemperatur stehen, anschließend zentrifugieren Sie die Probe 10 Minuten bei 12.000 G und vier Grad Celsius. Die RNA sollte ein gelartiges Pellet bilden. Entfernen Sie den Überstand, ohne das Pellet zu stören, und waschen Sie es, indem Sie einen Milliliter 75 %igen Ethanol hinzufügen, vorsichtig durch Inversion mischen und 5 Minuten bei 7.500 G und vier Grad Celsius zentrifugieren.

Nach der Zentrifugation das Ethanol entfernen und das Röhrchen umgedreht zur Trocknung für 10 Minuten stehen lassen. Den Pellet durch Zugabe von 100 Mikrolitern RNA-freiem Wasser resuspendieren und 10 Minuten bei 55 Grad Celsius inkubieren. Häufig mit dem Finger vortexen, um die RNA-Rehydratation zu unterstützen.

Nachdem die RNA aus den Embryonen extrahiert wurde, fahren Sie mit der RNA-Reinigung und der DNAse-Behandlung fort. Zum Reinigen der RNA verwenden Sie zunächst ein Rogen RN easy Mini-Kit. Geben Sie bei erstmaliger Verwendung vier Volumina 100 %igen Ethanol zu einem Volumen Puffer RPE im Abzug hinzu.

Fügen Sie 10 µL Beta-Mercaptoethanol für jedes Milliliter Puffer RLT hinzu. Anschließend geben Sie 350 µL Puffer RLT und 250 µL 100 % Ethanol zu der Probe hinzu, die mehrmals auf- und abpipettiert wurde, und überführen Sie die gesamte Probe auf eine RNeasy-Säule, die in einem 2 ml Sammelröhrchen platziert ist. Zentrifugieren Sie eine Minute bei 8.000 × g und Raumtemperatur; danach entsorgen Sie den Durchlauf und geben 700 µL Puffer RW1 auf die Säule.

Zentrifugieren Sie erneut mit 8.000 G für eine Minute und entsorgen Sie den Durchlauf, um DA aus der Probe zu entfernen. Behandeln Sie anschließend die DNA mit dem RNase-freien DNA-Kit. Sobald Sie das Kit erhalten haben, geben Sie 550 Mikroliter nukleasefreies Wasser zu der DNA hinzu und mischen Sie vorsichtig durch mehrmaliges Umstülpen. Lagern Sie die Stammlösung aufgeteilt in Portionen zu je 10 Mikrolitern bei minus 20 Grad Celsius eingefroren.

Fügen Sie 70 µL Puffer RDD zu 10 µL der Stammlösung der DNA hinzu, mischen Sie durch vorsichtiges Invertieren, zentrifugieren Sie kurz und geben Sie das Gemisch direkt auf die Säule R und easy spin column A. Inkubieren Sie die DNA-Behandlung 30 Minuten bei Raumtemperatur. Geben Sie anschließend 350 µL Puffer RW1 auf die Säule, zentrifugieren Sie eine Minute bei 8.000 ×g und Raumtemperatur, verwerfen Sie den Durchlauf und fügen Sie 500 µL Puffer RPE zur Säule hinzu. Inkubieren Sie die Probe fünf Minuten bei Raumtemperatur.

Zentrifugieren Sie erneut bei 8.000 G für eine Minute bei Raumtemperatur, entsorgen Sie den Durchlauf und geben Sie 500 Mikroliter 75 %igen Ethanol auf die Säule. Wiederholen Sie die Zentrifugation bei 8.000 G, diesmal jedoch für zwei Minuten bei Raumtemperatur. Danach entsorgen Sie den Durchlauf und lassen die Säule unmittelbar für fünf Minuten trocknen. Zentrifugieren Sie bei 8.000 G für fünf Minuten bei Raumtemperatur, um eventuelle verbleibende Spuren von Ethanol zu entfernen.

Überführen Sie nun die Säule in ein neues Sammelröhrchen mit 1,5 ml und geben Sie 10 µL nukleasefreies Wasser hinzu. Inkubieren Sie eine Minute lang, um die RNA zu eluieren. Zentrifugieren Sie eine Minute bei 10.000 ×g bei Raumtemperatur. Die RNA befindet sich im Durchfluss. Wiederholen Sie die Elution mit weiteren 10 µL Wasser.

Überprüfen Sie Menge und Qualität der RNA mithilfe eines NanoDrop ND-1000-Spektrophotometers gemäß den Herstelleranweisungen. Zusätzlich sollte ein denaturierendes Gel eingesetzt oder ein Agilent 2100 Bioanalyzer verwendet werden, um die Integrität der RNA zu kontrollieren. Wenn Menge und Qualität der RNA zufriedenstellend sind, fahren Sie mit der cDNA-Synthese fort.

Speichern Sie die RNA abschließend bei minus 80 Grad Celsius, bis die CD-NA-Synthese durchgeführt werden kann. Beginnen Sie die CD-NA-Synthese, indem Sie jede Komponente des RNA-Primers mischen und kurz zentrifugieren. Mischen Sie die RNA-DN-NTPs und Oligo-dT.

Fügen Sie jede Komponente einem sterilen 0,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen hinzu, bis insgesamt 10 Mikroliter erreicht sind. Für spezifische Volumina siehe den beigefügten schriftlichen Protokoll. Anschließend inkubieren Sie die Probe bei 65 Grad Celsius für fünf Minuten.

Überführen Sie die Probe sofort in eine Eis-Schlammsuspension für 10 Minuten. Während die Probe abkühlt, bereiten Sie eine Puffer-Hauptmischung auf ein Gesamtvolumen von neun Mikrolitern vor, wie im beigefügten schriftlichen Protokoll beschrieben. Nach dem Abkühlen verbinden Sie die Puffer-Hauptmischung vorsichtig mit der RNA-Primer-Mischung und sammeln Sie durch kurze Zentrifugation. Anschließend inkubieren Sie die kombinierte Probe im Thermocycler bei 42 Grad Celsius für zwei Minuten.

Um die Reverse Transkription zu starten, fügen Sie einen Mikroliter Superscript Two RT dem Röhrchen hinzu und mischen Sie gründlich. Inkubieren Sie anschließend eine Stunde lang bei 42 Grad Celsius. Beenden Sie die Reaktion durch eine 15-minütige Inkubation bei 70 Grad Celsius.

Kühlen Sie die Probe dann auf vier Grad Celsius und überführen Sie sie in ein Eisbad mit Eis. Geben Sie einen Mikroliter RNase H zur Probe hinzu und inkubieren Sie 20 Minuten bei 37 Grad Celsius. RNase H degradiert die RNA-Vorlage, sodass nur noch das Einzelstrang-cDNA-Produkt übrig bleibt. Die cDNA-Synthese ist nun abgeschlossen und erfordert nur noch eine zusätzliche Reinigungs- und Konzentrierungsstufe. Um das cDNA-Produkt zu isolieren, bereiten Sie eine 1,5-Milliliter-Phasensperre-Gel-Röhrchen durch Zentrifugation bei 12.000 × g für zwei Minuten vor.

Alle Gele sollten sich am Boden des Röhrchens befinden. Geben Sie 81,5 µL Tris-sättigtes Phenol, das auf pH 8,0 gepuffert ist, 81,5 µL Chloroform:isoamylalkohol (24:1) und die Probe in das Phase-Lock-Gel-Röhrchen. Mischen Sie mehrmals vorsichtig durch Inversion. Zentrifugieren Sie die Probe bei 12.000 ×g für fünf Minuten bei Raumtemperatur. Die cDNA sollte sich in der oberen wässrigen Phase befinden.

Überführen Sie die obere Phase, die etwa 20 µL betragen sollte, in ein sauberes 1,5-mL-Mikroröhrchen. Um die cDNA auszufällen, geben Sie zwei µL dreimolarer Natriumacetatlösung bei pH 5,2 hinzu und mischen vorsichtig. Geben Sie sieben µL Fällungshilfsmittel (5 mg/mL Glykogen) hinzu und mischen erneut vorsichtig.

Dann 30 µL Isopropanol hinzufügen, vorsichtig mischen und die Probe 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren lassen. Anschließend bei 12.000 ×g 20 Minuten bei Raumtemperatur zentrifugieren. Nach der Zentrifugation erscheint ein kleines cDNA-Pellet am Boden des Röhrchens.

Entfernen Sie vorsichtig den Überstand mit einem Perpet. Waschen Sie das Pellet, indem Sie 500 Mikroliter 70%igen Ethanol hinzufügen und die Probe durch Inversion mischen. Zentrifugieren Sie die Probe bei 12.000 ×g für fünf Minuten. Entfernen Sie nach der Zentrifugation den Überstand mit einem Ape.

Wiederholen Sie die Waschung, fügen Sie Ethanol hinzu, zentrifugieren Sie und entfernen Sie den Überstand. Nach der zweiten Waschung zentrifugieren Sie das Röhrchen kurz, um die restliche Flüssigkeit zu sammeln. Entfernen Sie jegliche überschüssige Flüssigkeit und lassen Sie das Pellet fünf Minuten lang bei Raumtemperatur trocknen.

Anschießend 20 Mikroliter nukleasefreies Wasser hinzufügen, um das Pellet erneut aufzuschließen. Die Probe fünf Minuten lang bei 55 Grad Celsius inkubieren. Zum erneuten Aufschließen kann die CD NA bei minus 20 Grad Celsius gelagert werden.

Überprüfen Sie abschließend Menge und Qualität des cDNA-Produkts mit einem NanoDrop ND-1000-Spektrophotometer gemäß den Herstelleranweisungen. Die Extraktion und Aufreinigung von RNA aus 50 Zebrafischembryonen ergibt routinemäßig etwa 15 Mikrogramm hochwertige Gesamt-RNA, wie mit einem NanoDrop ND-1000-Spektrophotometer bestimmt. Das Verhältnis der Absorption bei 60 bis 80 nm liegt bei etwa 1,9 bis 2,0. Die Integrität der extrahierten RNA wird mittels einer denaturierenden RNA-Gelelektrophorese überprüft. Die RNA erscheint als Smear mit zwei hellen Banden, die den ribosomalen RNAs 18S und 28S entsprechen.

Das 28-S-Band sollte ungefähr doppelt so intensiv sein wie das 18-S-Band. Alternativ wird die RNA-Integrität mithilfe eines Agilent 2100 Bioanalyzer bewertet. Zwei scharfe Peaks, die der 18-S- und 28-S-Ribosomen-RNA entsprechen, sind sichtbar.

Der 28-S-Peak sollte größer sein als der 18-S-Peak. Die Reverse Transkription von fünf Mikrogramm Gesamt-RNA ergibt routinemäßig ein bis zwei Mikrogramm cDNA, wie mittels eines NanoDrop ND-1000 bestimmt wurde. Das Absorptionsverhältnis der cDNA bei 60 bis 80 beträgt etwa 1,8.

Wir haben Ihnen soeben gezeigt, wie man die Gesamt-RNA aus ganzen Zebrafisch-Embryonen isoliert und diese RNA in das cDNA-Produkt umschreibt. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, stets ein RNasenfreies Umfeld aufrechtzuerhalten. Damit ist der Vorgang abgeschlossen.

Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.