Globale Genexpressionsanalyse Mit einem Zebrafisch Oligonukleotid-Microarray-Plattform
10. August 2009
Gene Microarrays sind mächtige Werkzeuge in Genexpressions-Profiling bei einer genomweiten Ebene. Diese Technologie findet Anwendung in einer Vielzahl von biologischen Disziplinen Entwicklungsbiologie und Toxikologie. In diesem Video-, Detail haben wir ein Protokoll für die globale Genexpressionsanalyse mit einem umfassenden Oligonukleotid-Microarray-Plattform für die Zebrafisch.
Dieses Verfahren beginnt mit cDNA, die aus einer Vorlage von hochwertiger RNA synthetisiert wurde. Die cDNA wird zunächst mit dem fluoreszierenden Farbstoff SI three markiert. Nach Abschluss der Markierungsreaktion wird die markierte cDNA gereinigt, isoliert und die Qualität der Markierungsreaktion bewertet.
Die markierte cDNA wird anschließend auf einem Microarray hybridisiert. Nach der Hybridisierung werden die Arrays analysiert, um die relativen Genexpressionsniveaus in den Proben zu bestimmen. Hallo, mein Name ist Sam Peterson aus dem Labor von Dr. Jennifer Freeman an der School of Health Sciences der Purdue University.
Zuvor haben wir Ihnen gezeigt, wie man RNA aus Zebrafischembryonen extrahiert und diese RNA in cDNA umschreibt. Heute zeigen wir Ihnen das Verfahren zum Markieren und Hybridisieren dieser cDNA auf einer Oligonukleotid-Mikroarray-Plattform für Zebrafische, um globale Genexpressionsprofile zu untersuchen. Typischerweise verwenden wir dieses Verfahren, um differentielle Genexpression als Reaktion auf eine Exposition gegenüber einem Toxin zu untersuchen.
Beginnen wir nun. Das Microarray-Experiment erfordert eine minimale Lichtumgebung, um eine photochemische Zersetzung des fluoreszierenden Farbstoffs SI drei zu verhindern, der bei der Markierung verwendet wird. Um die cDNA mit SI drei zu markieren, benötigen Sie die folgenden Komponenten des BioPrime Array CGH genomischen Markierungssystems: 2,5× Zufallsprimerpuffer, 10× dNTP-Mix und nukleasefreies Wasser. Zusätzlich sollten Sie den 1-Millimolar-Grundstock des mit SI drei markierten dCTP auftauen. Nach dem Auftauen zentrifugieren Sie die Reagenzien kurz in einem 0,6-Milliliter-Reaktionsröhrchen mit dicker Wand und kombinieren sie.
500 Nanogram cDNA, 40 Mikroliter, 2,5 x Zufallsprimerpuffer und nukleasefreies Wasser, um ein Gesamtvolumen von 86 Mikrolitern zu erreichen. Gut mischen und kurz zentrifugieren, dann die Reaktion in einem Thermocycler bei hundert Grad Celsius fünf Minuten lang inkubieren. Am Ende der Inkubation die Reaktion sofort für 10 Minuten in eine Eisbad-Suspension überführen.
Nehmen Sie als Nächstes die Exo-DNA-Polymerase aus dem Gefrierschrank und stellen Sie sie auf Eis. Geben Sie dann 10 µL der 10×-dNTP-Mischung, 2 µL der 1 mM SI 3D CTP und 2 µL der XO-Cleanout-DNA-Polymerase in das Reaktionsröhrchen, mischen Sie gründlich und zentrifugieren Sie kurz. Inkubieren Sie die Reaktion abschließend 16 Stunden lang bei 37 °C in einem Thermocycler, sobald die Markierung abgeschlossen ist.
Fahren Sie mit der Reinigung und Präzipitation des markierten cDNA fort. Um die Reinigung des markierten cDNA zu beginnen, setzen Sie eine MicroCon-Säule in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen ein.
Geben Sie 300 Mikroliter 0,1 × SSC zur Säule hinzu und anschließend die Markierungsreaktion. Zentrifugieren Sie die Säule bei 16.100 × g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius. Beachten Sie, dass das Durchflussvolumen leicht rosa gefärbt sein kann.
Entfernen Sie das Durchflussvolumen und geben Sie weitere 300 Mikroliter 0,1 × SSPE zur Säule hinzu. Wiederholen Sie anschließend die Zentrifugation bei 16.100 × g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius. Entsorgen Sie erneut das Durchflussvolumen und geben Sie nun zusätzliche 300 Mikroliter 0,1 × SSC zur Säule hinzu. Zentrifugieren Sie danach für 12 Minuten bei 16.100 × g bei vier Grad Celsius nach dieser letzten Waschung.
Der Durchlauf sollte klar sein und die rosa markierte cDNA ist auf der Säule sichtbar. Entsorgen Sie erneut den Durchlauf dieser letzten Waschung, um die markierte cDNA zu erhalten. Geben Sie 100 Mikroliter nukleasefreies Wasser auf die Säule. Nehmen Sie die Säule aus dem Mikrozentrifugenröhrchen und invertieren Sie sie in ein neues Röhrchen.
Anschließend die umgedrehte Säule bei 2.300 × g zwei Minuten lang bei vier Grad Celsius zentrifugieren. Die markierte cDNA löst sich im Wasser am Boden des Röhrchens auf. Überprüfen Sie die eluierte cDNA mithilfe eines NanoDrop ND-1000-Spektrophotometers gemäß den Herstelleranweisungen.
Berechnen Sie die DNA-Konzentration und bewerten Sie die Farbstoffinkorporierung, wie in dem begleitenden schriftlichen Protokoll beschrieben. Falls die cDNA ausreichend markiert ist, geben Sie sechs Mikrogramm in ein neues Röhrchen, um die markierte cDNA-Mischung durch Zugabe von 0,1 Volumen 3-molarer Natriumacetatlösung (pH 5,2) und einem Volumen Isopropanol zu präzipitieren, und inkubieren Sie die Probe 30 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln.
Beachten Sie, dass alle bisherigen Schritte in einer möglichst lichtarmen Umgebung durchgeführt wurden. Anschließend die Probe 20 Minuten bei Raumtemperatur mit 16.100 G zentrifugieren. Nach der Zentrifugation vorsichtig den überstehenden Überstand verwerfen, ohne den DNA-Präzipitat, der rosa ist, zu stören.
Schließlich wurde durch Zugabe von 500 Mikrolitern 70 %igem Ethanol gewaschen und durch vorsichtiges Invertieren gemischt, anschließend wurde fünf Minuten bei 16.100 × g zentrifugiert. Bei Raumtemperatur wurde der Überstand entfernt, das Röhrchen invertiert und das Pellet fünf Minuten lang trocknen lassen. Die markierte cDNA ist nun für die Hybridisierung bereit.
Vor Beginn der Hybridisierung schalten Sie das Nimblegen-Hybridisierungssystem ein und lassen es sich auf 42 Grad Celsius einstellen. Lösen Sie zunächst das markierte cDNA-Pellet in fünf Mikrolitern nukleasefreiem Wasser auf. Fügen Sie die Hybridisierungskomponenten aus dem Roche Nimblegen Hybridisierungskit – Hybridisierungspuffer, Hybrid A und Alignierungs-Oligo – zu einem Gesamtvolumen von 18 Mikrolitern hinzu, wie im beigefügten schriftlichen Protokoll beschrieben.
Gut mischen und das Röhrchen kurz abzentrifugieren, um den Inhalt am Boden zu sammeln. Den markierten cDNA-Ansatz anschließend durch Erhitzen auf 95 Grad Celsius für fünf Minuten denaturieren. Das Röhrchen unverzüglich auf das NimbleGen-Hybridisierungssystem übertragen, bis die Arrays bereit sind.
Beachten Sie, dass die Microarrays sorgfältig behandelt und gelagert werden müssen. Roche NimbleGen Arrays werden im Dunkeln mit Trockenmittel bei Raumtemperatur aufbewahrt. Legen Sie das Array in das Justierwerkzeug des Präzisionsmischers ein.
Laden Sie die PMA T-Last in X einen Mischer auf die PMA T auf und entfernen Sie den Klebestreifen mit einer Pinzette. Schließen Sie die PMA T sicher, nachdem das Array und der Mischer geladen sind. Lösen Sie anschließend das Array und den Mischer von der PMA T, indem Sie durch das Loch in der PMA t Druck auf den Mischer ausüben.
Verwenden Sie abschließend einen Farbroller, um Druck um die Außenseite des Mischers auszuüben, um sicherzustellen, dass das Array abgedichtet ist, und um eventuelle Blasen zu entfernen. Stellen Sie anschließend den Array-Mixer-Komplex auf das Hybridisierungssystem, um ihn aufzuwärmen und die cDNA-Probe auf das Array aufzutragen. Führen Sie die Verdrängung langsam und mit gleichmäßigem Druck durch.
Geben Sie 15 Mikroliter der markierten Probe in die Füllöffnung in der Mitte des Mischers. Wischen Sie überschüssige Probe von den Öffnungen ab und verschließen Sie diese mit Klebestreifen. Schließen Sie anschließend den Verschluss.
Beginnen Sie nun mit dem Mischen der Hybridisierungslösung unter Verwendung des Programms B am NimbleGen-Hybridisierungssystem. Lassen Sie die Microarray-Hybridisierung 16 bis 20 Stunden lang durchlaufen. Wenn die Hybridisierung nahezu abgeschlossen ist, wird die Microarray gewaschen und gescannt. Bereiten Sie das Scannen vor, indem Sie den GenePicks 4,000 B Array-Scanner einschalten und ihn etwa 15 Minuten lang aufwärmen lassen.
Bereiten Sie anschließend die Waschpuffer eins A, eins B zwei und drei gemäß der beigefügten schriftlichen Anleitung vor. Erwärmen Sie den Waschpuffer eins A auf 42 Grad Celsius, lassen Sie die anderen Puffer jedoch bei Raumtemperatur. Sobald der Waschpuffer eins A erwärmt ist, gießen Sie ihn in eine Schale.
Ein Objektträgergestell in Waschpuffer 1B eintauchen. Entfernen Sie nun den Array-Mixer-Komplex aus dem NimbleGen-Hybridisierungssystem und schieben Sie ihn in die Haltevorrichtung. Beginnen Sie die Wäsche, indem Sie die gesamte Anordnung in den vorgewärmten Waschpuffer 1A eintauchen, und nehmen Sie den Mixer vorsichtig ab, indem Sie ihn von dem Objektträger ablösen. Entfernen Sie danach den Array aus der Haltevorrichtung und schwenken Sie ihn 15 Sekunden lang in Waschpuffer 1A. Überführen Sie den Array anschließend schnell in ein Objektträgergestell, das in Waschpuffer 1B eingetaucht ist, und schütteln Sie das Gestell kräftig zwei Minuten lang.
Überführen Sie den Objektträgerhalter anschließend in Waschpuffer zwei und schwenken Sie ihn eine Minute lang. Zuletzt überführen Sie den Objektträgerhalter in Waschpuffer drei und schwenken Sie ihn 15 Sekunden lang. Beenden Sie die Wäsche, indem Sie das Array in die Objektträgertrocknungszentrifuge überführen und zwei Minuten lang zentrifugieren.
Scannen Sie das Array unverzüglich, da das D empfindlich gegenüber Licht und Ozon ist. Beginnen Sie den Scanvorgang, indem Sie den Array-Barcode mit der Markierung nach unten in den Genepix 4,000 B Array-Scanner einführen. Legen Sie im Dialogfeld „Hardware-Einstellungen“ für den 532-Nanometer-Laser einen PMT-Wert von 500 fest, stellen Sie die Leistung auf 100 %, die Pixelgröße auf fünf Mikrometer, die Anzahl der zu mittelnden Zeilen auf eins und die Fokusposition auf null Mikrometer. Nach Abschluss der Einrichtung zeigen Sie eine Vorschau des Arrays an.
Wählen Sie einen Bereich zum Scannen aus und scannen Sie diesen. Sobald das Scannen abgeschlossen ist, überprüfen Sie das Bildhistogramm. Im Idealfall sollte eine E minus fünf normalisierte Zählung bei 65.000 Sättigungsgrenze liegen, was bedeutet, dass ungefähr ein bis zwei Prozent der Merkmale gesättigt sind.
Wenn die normalisierten Zählwerte kleiner als eins E minus fünf sind, erhöhen Sie die PMT-Verstärkung und scannen Sie den Objektträger erneut. Wenn die normalisierten Zählwerte größer als eins E minus fünf sind, verringern Sie die PMT-Verstärkung, scannen Sie den Objektträger erneut, speichern Sie das Bild und verwenden Sie ein Datenanalyseprogramm zur Datennormalisierung und Berechnung der Intensitätswerte. Die Markierungsreaktion liefert routinemäßig mindestens 10 Mikrogramm markiertes cDNA.
Die Farbstoffaufnahme kann mithilfe eines einfachen Basisfarbstoffverhältnisses berechnet werden, bei dem das Verhältnis von Nukleotid zu SI drei dem Verhältnis von A 260 zu A 550 multipliziert mit 23,15 entspricht. Eine gute Reaktion führt zu einem Wert zwischen 50 und 80. Eine akzeptable Hybridisierung zeigt, dass 1 bis 2 % der Merkmale gesättigt sind.
Eine E minus fünf normalisierte Zählungen bei der 65.000-Sättigungsgrenze. Bei eingestelltem PMT-Wert kann die Hybridisierungsqualität ebenfalls qualitativ beurteilt werden, indem das gescannte Bild des Microarrays betrachtet und die Intensität der ausgerichteten Oligos im Vergleich zu anderen Merkmalen auf dem Array bewertet wird. Das gescannte Bild sollte außerdem auf spezifische Artefakte oder Staubpartikel innerhalb des Array-Bereichs überprüft werden.
In der anschließenden Analyse kann ein Streudiagramm verwendet werden, um Ihre analysierten Daten abzubilden, um die relativen Genexpressionsniveaus in den Proben zu bestimmen und Gene zu identifizieren, die unterschiedlich exprimiert werden. Gene, die unterschiedlich exprimiert werden, weichen signifikant von der Regressionsgeraden in einem komplementären Verfahren ab. Wir haben Ihnen gezeigt, wie man RNA aus Zebrafischembryonen extrahiert, um cDNA zu synthetisieren. Hier haben wir Ihnen gezeigt, wie man cDNA markiert und auf einer Oligonukleotid-Mikroarray-Plattform hybridisiert, um globale Genexpressionsprofile zu untersuchen.
Beachten Sie bei diesem Verfahren stets die Verwendung von hochwertiger CD-Na und vermeiden Sie die direkte Belichtung des Site-Three-Farbstoffs. Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.
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Übersicht
In diesem Artikel wird das Verfahren der globalen Genexpressionsanalyse unter Verwendung einer zebrafischspezifischen Oligonukleotid-Microarray-Plattform demonstriert. Das Protokoll umfasst die fluoreszenzmarkierte Kennzeichnung von cDNA, die Hybridisierung auf dem Microarray und das Scannen zur Signalerfassung und ermöglicht es Forschern, Transkriptspiegel in Zebrafischproben genomweit quantitativ zu erfassen.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Genomik
- Molekularbiologie
- Genexpressionsanalyse
- Transkriptomik
Hintergrund
- Die Gen-Mikroarray-Technologie ermöglicht die quantitative Messung der Genexpression über das gesamte Genom hinweg.
- Sie wird häufig zur Untersuchung von Veränderungen der Genexpression im Zusammenhang mit Entwicklung, Krankheiten und toxischen Reaktionen eingesetzt.
- Die Zebrafisch-Mikroarray-Plattform analysiert über 37.000 Zielstrukturen mit umfassender Abdeckung des Transkriptoms.
- Daten aus mehreren genomischen Datenbanken wurden zur Konstruktion des Arrays verwendet, um eine breite Anwendbarkeit für die Zebraforschung sicherzustellen.
Zweck der Studie
- Eine robuste Protokollmethode zur Markierung und Hybridisierung von cDNA auf einem Zebrafisch-Oligonukleotid-Microarray demonstrieren.
- Die globale Profilierung der Genexpression beim Zebrafisch ermöglichen, insbesondere als Reaktion auf Umwelt- oder Toxinexpositionen.
- Detaillierte Schritte bereitstellen, damit Forschende den Prozess nachvollziehen und qualitativ hochwertige Genexpressionsdaten erhalten können.
Verwendete Methoden
- Synthese von cDNA aus hochwertiger RNA, isoliert aus Zebrafisch-Embryonen.
- Markierung der cDNA mit dem Farbstoff Cy3 unter Verwendung eines genomischen Markierungssystems.
- Reinigung und Qualitätsbewertung der markierten cDNA, einschließlich Überprüfung der Farbstoff-Inkorporation.
- Hybridisierung der markierten cDNA an das Microarray unter kontrollierten Bedingungen.
- Post-Hybridisierungs-Waschschritte und Scannen des Arrays mittels eines Microarray-Scanners.
- Daten-Normalisierung und Analyse zur Bestimmung relativer Genexpressionslevel.
Hauptergebnisse
- Das Protokoll liefert mindestens 10 Mikrogramm markierte cDNA, die für die Hybridisierung geeignet ist.
- Eine optimale Farbstoffinkorporierung wird erreicht, mit einem Verhältnis von Nukleotid zu Cy3 zwischen 50 und 80.
- Eine Hybridisierung hoher Qualität zeigt sich durch eine Sättigung der Merkmale von 1–2 % und angemessene Signalintensität.
- Gescannte Bilder und die Datenanalyse ermöglichen die Identifizierung differentiell exprimierter Gene in Zebrafischproben.
Schlussfolgerungen
- Das beschriebene Protokoll ermöglicht eine zuverlässige und reproduzierbare globale Genexpressionsanalyse bei Zebrafischen.
- Sorgfältiges Handling von fluoreszenten Farbstoffen und hochwertige cDNA sind entscheidend für erfolgreiche Ergebnisse.
- Diese Methode unterstützt vielfältige Anwendungen in der Entwicklungsbiologie, Toxikologie und Krankheitsforschung unter Verwendung von Zebrafischmodellen.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Mittels globaler Genexpressionsanalyse unter Verwendung von Zebrafisch-Oligonukleotid-Microarrays lässt sich durch die Bereitstellung transkriptomweiter Transkriptprofilierung ein mechanistisches De-Risiko-Management in der frühen Entdeckungsforschung realisieren. Dieser Ansatz unterstützt die Zielvalidierung sowie phänotypische Screening-Verfahren in der Toxikologie und Entwicklungsbiologie. Die Plattform liefert quantitative, reproduzierbare Daten, die die Vorhersagesicherheit für die Identifizierung von Leitstrukturen und die Entscheidungen zur Portfolio-Priorisierung stützen.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Überprüft therapeutische Hypothesen mittels genomweiter Expressionsprofilierung, um die Beteiligung von Signalwegen und biologische Mechanismen zu klären.
- Operationaler Wert: Ermöglicht die funktionelle Validierung von Zielstrukturen durch Identifizierung differentiell exprimierter Gene als Reaktion auf Toxikant-Exposition oder Krankheitsmodelle.
- Prädiktiver Wert: Stützt die Vorhersagekraft und die Priorisierung von Projektportfolios, indem mechanistische Erkenntnisse bereitgestellt werden, die das Risiko bei der Zielstrukturauswahl verringern.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Bereitet validierte biologische Systeme für nachgeschaltete Screening-Verfahren vor, indem Baseline-Expressionsprofile in Zebrafisch-Modellen etabliert werden.
- Operativer Wert: Liefert standardisierte, quantitative Ergebnisse mit hoher Reproduzierbarkeit aufgrund robuster Sondenkonzeption und Normalisierungskontrollen.
- Bereitschaft für Screening: Ermöglicht zuverlässige Wirkstoffevaluierung durch skalierbare, plattformübergreifend wiederverwendbare Arbeitsabläufe, die mit automatisierten Hybridisierungs- und Abbausystemen kompatibel sind.
Translationale und präklinische Forschung
- Translationale Kontinuität: Verbindet Entdeckungsergebnisse mit der präklinischen Validierung, indem krankheitsrelevante Expressionsmuster über verschiedene Modellsysteme hinweg aufrechterhalten werden.
- Biomarker-Korrelation: Unterstützt die translationale Biomarker-Entdeckung durch konsistente transkriptomische Messgrößen, die mit phänotypischen Ergebnissen korrelieren.
- Risikoadjustierte Weiterentwicklung: Leitet Go/No-Go-Entscheidungen ein, indem sie bereits früh im Entwicklungsprozess expressionsbasierte Sicherheits- und Wirksamkeitssignale liefert.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode integriert sich in den Entdeckungsprozess von der Testung der Zielhypothese über die Identifizierung von Leitstrukturen bis hin zur präklinischen Validierung und ermöglicht eine iterative Verbesserung des biologischen Verständnisses.
- Entdeckungsbiochemie: Unterstützt die Hypothesenprüfung und Klärung von Signalwegen durch die Detektion von Expressionsänderungen im gesamten Transkriptom als Reaktion auf Störungen.
- Screening: Stellt die Bereitschaft von Assays sicher durch standardisierte Markierungs-, Hybridisierungs- und Scanprotokolle, die reproduzierbare Intensitätswerte liefern.
- Analysen: Erzeugt normalisierte Zähldaten und Intensitätswerte, die statistische Vergleiche zwischen Bedingungen und die Identifizierung unterschiedlich exprimierter Merkmale ermöglichen.
- Translationale Forschung: Schafft Anschluss an die präklinische Kontinuität, indem zebrabärchen-spezifische transkriptomische Signaturmuster erhalten bleiben, die für menschliche Krankheitswege relevant sind.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Funktioniert als wiederverwendbare Kapazität über verschiedene Projekte hinweg aufgrund standardisierter Array-Designs, Markierungschemie und Scanparameter.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Bietet Vorhersagesicherheit durch mechanistische Ent风险bewertung und Verringerung biologischer Mehrdeutigkeiten bei der Zielstrukturauswahl.
- Operationaler Wert: Gewährleistet Standardisierung, Reproduzierbarkeit und Skalierbarkeit durch validierte Markierungs-, Hybridisierungs- und Qualitätskontrollverfahren.
- Strategischer Wert: Verbessert Go/No-Go-Entscheidungen, Kapitalnutzungseffizienz und verringert biologische Risiken in späteren Phasen, indem frühzeitige, expressionsbasierte Erkenntnisse bereitgestellt werden.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht risikoadjustierte Priorisierung und Fortschrittsentscheidungen basierend auf genomweiten Expressionsprofilen und differentieller Analyse.
Durchführungsaspekte
- Benötigt Fachkenntnisse in Molekularbiologie, Nukleinsäuremarkierung und Mikroarray-Handhabung, um die Datenintegrität sicherzustellen.
- Ist abhängig von speziellen Geräten wie Thermocyclern, Mikroarray-Hybridisierungssystemen und Laserscannern zur Signaldetektion.
- Erfordert eine standardisierte Vorgehensweise zwischen Teams hinsichtlich der Markierungseffizienzschwellen, Waschprotokolle und PMT-Verstärkungseinstellungen für konsistente Ergebnisse.
- Beinhaltet Anpassungsüberlegungen bei der Anwendung der Plattform auf verschiedene Zebrafisch-Stämme, Entwicklungsstadien oder Expositionsbedingungen.
- Umfasst praktische Einschränkungen wie die Lichtempfindlichkeit fluoreszierender Farbstoffe sowie die Notwendigkeit optimierter cDNA-Eingabemengen und Farbstoff-Einbauraten.
