Globale Genexpressionsanalyse Mit einem Zebrafisch Oligonukleotid-Microarray-Plattform

Dieses Verfahren beginnt mit CDNA, das aus einem Template mit hochwertiger RNA synthetisiert wurde. Die CDNA wird zunächst mit dem Fluoreszenzfarbstoff SI three markiert. Nach Abschluss der Markierungsreaktion wird das markierte CDNA gereinigt, isoliert und die Qualität der Markierungsreaktion bewertet.

Das markierte CDNA wird dann auf einem Microarray hybridisiert. Nach der Hybridisierung werden die Arrays analysiert, um das relative Niveau der Genexpression in den Proben zu bestimmen. Hallo, mein Name ist Sam Peterson aus dem Labor von Dr. Jennifer Freeman an der School of Health Sciences der Purdue University.

Zuvor haben wir Ihnen gezeigt, wie Sie RNA aus Zebrafischembryonen extrahieren und diese RNA in CDNA umwandeln können. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Markierung und Hybridisierung dieses CDNA auf einer Zebrafisch-Oligonukleotid-Microarray-Plattform, um globale Genexpressionsprofile zu untersuchen. Typischerweise verwenden wir dieses Verfahren, um die differentielle Genexpression als Reaktion auf eine Exposition gegenüber einem Toxin zu untersuchen.

Also lasst uns loslegen. Das Microarray-Experiment erfordert eine Umgebung mit minimalem Licht, um eine Photodegradation des Fluoreszenzfarbstoffs SI drei zu verhindern, der bei der Markierung verwendet wird, um mit der Markierung der CD NA mit sci drei zu beginnen: die folgenden Komponenten des genomischen Markierungssystems des Bio-Prime-Arrays: CGH: 2,5 x zufälliger Primerpuffer, 10 X-D-C-T-P-Mix und nukleasefreies Wasser. Zusätzlich tauen Sie nach dem Auftauen den ein Millimolar schweren Stamm des SI drei markierten DCTP auf, zentrifugieren Sie kurz oder kombinieren Sie Reagenzien in einem 0,6 Milliliter dickwandigen Röhrchen.

500 Nanogramm CDNA 40 Mikroliter, 2,5 x Random Primer Buffer und nukleasefreies Wasser, um ein Gesamtvolumen von 86 Mikrolitern zu erreichen. Gut mischen und kurz zentrifugieren, dann die Reaktion bei hundert Grad Celsius in einem Thermocycler fünf Minuten lang inkubieren. Am Ende der Inkubation wird die Reaktion sofort für 10 Minuten in eine Eisbadaufschlämmung überführt.

Nehmen Sie dann die Exo-DNA-Polymerase aus dem Gefrierschrank und legen Sie sie auf Eis. Geben Sie dann 10 Mikroliter des 10 X-D-C-T-P Mix, zwei Mikroliter des ein Millimolar SI 3D CTP und zwei Mikroliter der XO-Cleanout-DNA-Polymerase in das Reaktionsröhrchen, mischen Sie es gut und zentrifugieren Sie es kurz. Zum Schluss inkubieren Sie die Reaktion 16 Stunden lang bei 37 Grad Celsius und einen Thermocycler, wenn die Markierung abgeschlossen ist.

Fahren Sie mit der Bereinigung fort und fällen Sie das gekennzeichnete CDNA aus. Um mit der Reinigung des beschrifteten CDNA zu beginnen. Setzen Sie eine MicroCon-Säule in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen ein.

Geben Sie 300 Mikroliter null 0,1 XSSC in die Säule und fügen Sie dann die Markierungsreaktion hinzu. Die Säule wird bei 16.100 G 10 Minuten lang bei vier Grad SIUs zentrifugiert. Beachten Sie, dass der Durchfluss hellrosa sein kann.

Verwerfen Sie den Durchfluss und geben Sie weitere 300 Mikroliter Null 0,1 XSSE in die Säule. Wiederholen Sie dann die Zentrifugation bei 16.100 G für 10 Minuten bei vier Grad Celsius. Auch hier verwerfen Sie den Durchfluss und geben Sie weitere 300 Mikroliter T 0,1 XSSC in die Säule, die nun nach dieser letzten Wäsche 12 Minuten lang bei 16.100 G bei vier Grad Celsius zentrifugiert.

Der Durchfluss sollte klar sein, und die rosafarbene Beschriftung CDNA ist auf der Säule sichtbar. Verwerfen Sie auch hier den Durchfluss aus dieser letzten Wäsche, um der beschrifteten CD NA zu entgehen. Geben Sie 100 Mikroliter nukleasefreies Wasser in die Säule. Nehmen Sie die Säule aus dem Mikrozentrifugenröhrchen und drehen Sie sie in ein neues Röhrchen.

Dann zentrifugieren Sie die umgekehrte Säule bei 2.300 g für zwei Minuten bei vier Grad Celsius. Das markierte CDNA wird am Boden des Röhrchens im Wasser gelöst. Überprüfen Sie die angegebene CDNA mit einem NanoDrop ND 1000 Spektralphotometer gemäß den Anweisungen des Herstellers.

Berechnen Sie die DNA-Konzentration und bewerten Sie den Farbstoffeinbau, wie im beigefügten schriftlichen Protokoll beschrieben. Wenn die CDNA ausreichend markiert ist, geben Sie sechs Mikrogramm in ein neues Röhrchen, um die markierte CD NA-Mischung in naut 0,1 x Volumen von drei molaren Natriumacetat bei pH 5,2 und einem x Volumen auszufällen. Isopropanol inkubiert die Dunkelheit 30 Minuten lang bei Raumtemperatur.

Unter Berücksichtigung aller Schritte bis zu diesem Punkt wurden sie in einer Umgebung mit minimalem Licht durchgeführt. Anschließend wird die Probe bei 16.100 g 20 Minuten lang bei Raumtemperatur zentrifugiert. Entsorgen Sie nach der Zentrifugation den SUP-Nativstoff vorsichtig, ohne das rosa DNA-Kügelchen zu stören.

Zum Schluss durch Zugabe von 500 Mikrolitern, 70% Ethanol gewaschen und durch sanfte Inversionszentrifuge bei 16.100 g für fünf Minuten gemischt. Entfernen Sie bei Raumtemperatur das Supinat, drehen Sie das Rohr um und lassen Sie das Pellet fünf Minuten lang trocknen. Das markierte CDNA ist bereit für die Hybridisierung.

Bevor Sie mit der Hybridisierung beginnen, schalten Sie das Hybridisierungssystem der flinken Generation ein und lassen Sie es auf 42 Grad Celsius ausgleichen. Beginnen Sie damit, das markierte CD NA-Pellet in fünf Mikrolitern nukleasefreiem Wasser in dem gelösten Pellet aufzulösen. Fügen Sie Hybridisierungskomponenten aus dem Roche Nimble Gen Hybridisierungskit Hybridisierungspuffer Hybrid A und Alignment-Oligo zu einem Gesamtvolumen von 18 Mikrolitern hinzu, wie im begleitenden schriftlichen Protokoll beschrieben.

Gut mischen und das Röhrchen kurz drehen, um den Inhalt am Boden aufzufangen. Als nächstes denaturieren Sie das markierte CDNA, indem Sie das Röhrchen fünf Minuten lang bei 95 Grad Celsius platzieren. Übertragen Sie die Röhre sofort in das Nimble-Gen-Hybridisierungssystem, bis die Arrays bereit sind.

Beachten Sie, dass die Microarrays eine sorgfältige Handhabung und Lagerung erfordern. Die flinken Gen-Arrays von Roche werden im Dunkeln mit Trockenmittel bei Raumtemperatur gelagert. Laden Sie das Array in das Ausrichtungswerkzeug für den Präzisionsmischer.

Der PMA T lädt in X einen Mischer auf den PMA T und entfernt den Klebestreifen mit einer Pinzette. Wenn das Array und der Mixer geladen sind, schließen Sie den PMA T sicher. Trennen Sie als Nächstes das Array und den Mischer von der PMA T, indem Sie durch das Loch in der PMA t Druck auf den Mischer ausüben.

Verwenden Sie zum Schluss einen Brayer, um Druck auf die Außenseite des Mischers auszuüben, um sicherzustellen, dass das Array abgedichtet ist, und um Blasen zu entfernen. Platzieren Sie anschließend den Array-Mischerkomplex zum Erwärmen auf dem Hybridisierungssystem, um die CDNA-Probe auf das Array zu laden. Betätigen Sie den Verdränger langsam und mit gleichmäßigem Druck.

Geben Sie 15 Mikroliter der markierten Probe in die Einfüllöffnung in der Mitte des Mischers. Wischen Sie überschüssige Probe von den Bullaugen ab und verschließen Sie diese mit Klebestreifen. Schließen Sie dann die Verriegelung.

Beginnen Sie nun mit dem Mischen der Hybridisierungslösung mit Programm B auf dem Hybridisierungssystem der nimble-gen. Lassen Sie den Microarray 16 bis 20 Stunden lang hybridisieren. Nach der Hybridisierung wird der Microarray gewaschen und gescannt, wenn die Hybridisierung kurz vor dem Abschluss steht. Bereiten Sie sich auf den Scanvorgang vor, indem Sie den Gen-Picks-Scanner mit 4.000 B Array einschalten und etwa 15 Minuten lang aufwärmen lassen.

Bereiten Sie als Nächstes die Waschpuffer eins A, eins B, zwei und drei vor, wie im beigefügten schriftlichen Protokoll beschrieben. Vorkriegswaschpuffer einen A bis 42 Grad Celsius, aber lassen Sie die anderen Puffer bei Raumtemperatur. Wenn der Waschpuffer eins A erwärmt ist, gib ihn in eine Schüssel.

Tauchen Sie ein Objektträgergestell in den Waschpuffer eins B. Entfernen Sie nun den Array-Mischerkomplex aus dem Nimble-Gen-Hybridisierungssystem und schieben Sie ihn in die Vorrichtung. Beginnen Sie den Waschvorgang, indem Sie die Baugruppe in den vorwarmen Waschpuffer eins A eintauchen und den Mischer vorsichtig entfernen, indem Sie ihn von der Schiene abziehen. Nehmen Sie dann das Array aus der Vorrichtung und rühren Sie 15 Sekunden lang im Waschpuffer eins A. Übertragen Sie das Array schnell in ein Objektträgergestell, das in den Waschpuffer eins B getaucht ist, und rühren Sie das Objektträgergestell zwei Minuten lang kräftig um.

Schieben Sie dann den Objektträger in den Waschpuffer zwei und rühren Sie eine Minute lang. Zum Schluss den Objektträger in den Waschpuffer drei schieben und 15 Sekunden lang rühren. Beenden Sie die Waschmaschinen, indem Sie das Array in die Objektträger-Trockenzentrifuge geben und nach dem Zentrifugieren zwei Minuten lang schleudern.

Scannen Sie das Array sofort, da das D licht- und ozonempfindlich ist, starten Sie den Scanvorgang, indem Sie den Array-Barcode in den Genpicks 4.000 B Array-Scanner laden. Im Dialogfeld für die Hardwareeinstellung hat der 532-Nanometer-Laser einen PMT-Wert von 500, stellen Sie die Leistung auf 100 % Pixelgröße auf fünf Mikrometer, Linien auf durchschnittlich eins und Fokusposition auf null Mikrometer ein. Wenn die Einrichtung abgeschlossen ist, zeigen Sie eine Vorschau des Arrays an.

Wählen Sie einen Bereich aus, den Sie scannen möchten, und scannen Sie ihn dann. Sobald der Scanvorgang abgeschlossen ist, überprüfen Sie das Bildhistogramm. Im Idealfall sollte ein E minus fünf normalisierte Zählungen an der Sättigungsgrenze von 65.000 liegen, was bedeutet, dass etwa ein bis 2 % der Features gesättigt sind.

Wenn die normalisierten Zählungen kleiner als eins E minus fünf sind, erhöhen Sie die PMT-Verstärkung und scannen Sie den Objektträger erneut. Wenn die normalisierten Zählungen größer als eins E minus fünf sind, verringern Sie die PMT-Verstärkung und scannen Sie den Objektträger erneut, speichern Sie das Bild und verwenden Sie ein Datenanalyseprogramm zur Datennormalisierung und Berechnung der Intensitätswerte. Die Markierungsreaktion ergibt routinemäßig mindestens 10 Mikrogramm markiertes CDNA.

Der Farbstoffeinbau kann unter Verwendung eines einfachen Basenfarbstoffverhältnisses berechnet werden, wobei das Verhältnis von Nukleotid zu SI drei dem Verhältnis von A zwei 60 zu fünf 50 multipliziert mit 23 Punkt 15 entspricht. Eine gute Reaktion führt zu einem Wert zwischen 50 und 80. Bei einer akzeptablen Hybridisierung sind ein bis 2 % der Merkmale gesättigt.

Ein E minus fünf normalisierte Zählungen an der Sättigungsgrenze von 65.000. Mit dem eingestellten PMT-Wert kann auch eine Hybridisierungsqualität von nahezu 500 qualitativ beurteilt werden, indem das gescannte Bild des Microarrays betrachtet und die Intensität der ausgerichteten Oligos zu anderen Merkmalen auf dem Array beurteilt wird. Das gescannte Bild sollte auch auf bestimmte oder Staubflecken innerhalb des Array-Bereichs untersucht werden.

In der anschließenden Analyse kann ein Streudiagramm verwendet werden, um Ihre Analysedaten abzubilden, um das relative Niveau der Genexpression in den Proben zu bestimmen und Gene zu identifizieren, die unterschiedlich exprimiert werden. Gene, die unterschiedlich exprimiert werden, weichen in einem komplementären Verfahren erheblich von der Best-Fit-Linie ab. Wir haben Ihnen gezeigt, wie Sie RNA aus Zebrafischembryonen extrahieren können, um c CD NA zu synthetisieren. Hier haben wir Ihnen gerade gezeigt, wie Sie CD NA auf einer Oligonukleotid-Mikrostrahlenplattform markieren und hybridisieren können, um globale Genexpressionsprofile zu untersuchen.

Denken Sie bei diesem Verfahren immer daran, hochwertige CD NA zu verwenden und vermeiden Sie es, die Stelle mit drei Farbstoffen direktem Licht auszusetzen. Das war's also. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.