Name: Methode zur Messung des Viral Fusion Kinetics auf der Single Particle Stufe (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-09-07T16:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 59 s
Description: Lernen Sie eine Fluoreszenzmethode zur Visualisierung viraler Fusion auf Einzelpartikelebene. Diese Technik ermöglicht die Echtzeitbeobachtung von Hemifusion und Porenbildung zur Untersuchung viraler Eintrittsmechanismen.

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Die Arbeit wurde durch die NIH gewährt AI57159 (SCH) und AI72346 (bis AMvO) unterstützt. SCH ist ein Howard Hughes Medical Institute Investigator.

Deckglas Funktionalisierung Die planare Doppelschicht in der Fusion-Assay verwendet wird, auf eine hydratisierte Film von Dextran unterstützt. Dextran dient als Abstandshalter zwischen den planaren Bilayer und Glasoberfläche. Dies verhindert Membran-Komponenten erst gar nicht auf der Glasoberfläche fest und bietet auch Raum in dem die Inhalte einer Virus-Partikel können auf Fusion zu entkommen. Deckgläser werden durch Behandlung mit einem Epoxysilan, die uns chemisch binden Dextran, das Glas (Elender, et al. 1996) ermöglicht funktionalisiert. <ol><li> Vereinbaren Sie 25 mm Deckgläschen in einer keramischen Färbebank und Platz im Rack in ein Glas oder Becher. </li><li> Füllen Sie den Behälter mit einer 10% igen Laborqualität Glaswaren Reinigungsmittel. Stellen Sie den Behälter in einem Ultraschall-Reinigungsgerät für 30 Minuten. </li><li> Spülen Sie den Behälter und Deckglas Rack mit deionisiertem Wasser und füllen Sie mit 1M postassium Hydroxid. Bringen Sie den Behälter zum Ultraschallbad für weitere 30 Minuten. </li><li> Wiederholen Sie diesen Reinigungsvorgang unter Verwendung von Aceton und Ethanol. </li><li> Spülen Sie den coverlips in Wasser und trocknen. </li><li> Schließlich, reinigen Sie die Deckgläser mit einem Sauerstoff-Plasma-Stripper für drei Minuten. </li><li> Der letzte Reinigungsschritt oxidiert die Oberfläche, so dass das Glas gleichmäßig hydrophil und reaktiven in den folgenden Silanisierung Schritte. </li><li> Bereiten Sie eine 0,2% ige Lösung von 3-Glycidoxypropyltrimethoxysilan in Isopropanol. Tauchen Sie die Deckgläser in dieser Lösung für 5 Minuten. </li><li> Entsorgen Sie die Silan-Lösung und spülen Sie die Deckgläser mehrmals in Isopropanol. </li><li> Die Deckgläser werden nun mit einer Schicht aus Silan beschichtet, aber sie müssen gehärtet werden, um damit das Silan kovalent an das Glas. Legen Sie die Deckgläser in einem Ofen auf 80 Grad Celsius für eine Stunde. </li><li> Während die Deckgläser Aushärtung sind, wiegen Sie Dextran 500 und erstellt einen 30% w / v Lösung. Vorwärmen des Wassers wird die Beihilfe Auflösung. Wir werden ca. 1 ml dieser Lösung pro Deckglas. Sobald die Dextran gelöst hat, entschäumen die Lösung in einem Vakuumexsikkator. </li><li> Wenn die silanisierte Deckgläschen abgeschlossen haben Härtung, entfernen Sie sie aus der Keramik-Rack und ordnen Sie sie flach auf der Innenseite einer Kunststoff-Gefrierfach. Verwenden einer 1 ml Pipette auf die Oberseite eines jeden Deckglas mit ca. 1 ml der Dextranlösung decken. Schließen Sie das Gefrierfach und lassen Sie sich in einem ruhigen Platz für 24-36 Stunden. </li><li> Fassen Sie die Deckgläser mit Kunststoff-Pinzette, giesst die überschüssige Dextran und ersetzen Sie sie in die Keramik-Rack. Spülen Sie die Deckgläser mehrmals in Wasser, und lassen Sie die Deckgläschen in Wasser für 48 Stunden einweichen. Das Glas kann leicht auf einem Tisch-Rotator geschüttelt werden. </li><li> Trocknen Sie die Deckgläser in einem Ofen auf 80 Grad Celsius und speichern in einem Vakuum-Exsikkator. </li></ol> Liposomenzubereitung Lipiddoppelschichten sind durch Adsorption Liposomen zu einer Dextran funktionalisierten Deckglas gebildet. Die adsorbierten Liposomen verschmelzen mit einander, bis Membran reißt und breitet sich flach über der Oberfläche. <ol><li> Ein typisches Liposomenformulierung im Assay verwendet wird, besteht aus 1,2, Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (DOPC), 1-Oleoyl-2-Palmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (POPC), Cholesterin, Rinderhirn Disialoganglioside (GD 1a) und N-((6 - (Biotinoyl) amino) Hexanoyl) -1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3-Phosphoethanolamin in einem Verhältnis von 4:4:2:0.1:5 x10 -5. Alle Komponenten sind in Chloroform oder Chloroform und Methanol-Lösungen gespeichert. </li><li> Bereiten Sie eine Mischung aus zwei Mikromol Lipid durch die Übertragung von Mengen der einzelnen Komponenten in ein Reagenzglas. Das Lösungsmittel wird unter einem Strom von Argon oder Stickstoff. Entfernen Sie das restliche Lösungsmittel, indem man das Reagenzglas in einen Vakuumexsikkator für zwei Stunden. </li><li> Resuspendieren getrocknete Lipidfilm in 400 Mikroliter HNE-Puffer (5 mM HEPES, 145 mM NaCl, 0,1 mM EDTA). </li><li> Übertragen Sie die Suspension auf eine Kunststoff-Mikrozentrifugenröhrchen. Einfrieren der Suspension in einem Bad aus flüssigem Stickstoff und Auftauen in einem warmen Wasserbad. Wiederholen Sie diesen Frost / Tau-Zyklus viermal. </li><li> Montieren einer Lipid-Extruder mit einer 100 nm Polycarbonat-Membranfilter, und extrudieren die Lipidsuspension 25-mal. Die Suspension sollte erscheinen zu mehr Transparenz nach der Extrusion. </li><li> Liposomen sollten am Tag sind sie bereit verwendet werden. Sie können bei Raumtemperatur gelagert werden, bis verwendet. </li></ol> Mikrofluidik-Messzelle Vorbereitung Eine einfache mikrofluidischen Durchflusszelle ist durch Einfügen doppelte Klebeband zwischen einem Quarz-Rutsche und einer funktionalisierten Deckglas gemacht. <ol><li> Besorgen Sie sich ein 20x20x3 mm Quarz-Objektträger. Verwenden Sie einen Diamantkugel zwei 1 mm Löcher an gegenüberliegenden Seiten bohren. </li><li> Schneiden Sie ein 20 mm ² aus einem Blatt der doppelten Klebeband, und mit einer Rasierklinge, schneiden Sie ein 15 x 2 mm Ausschnitt aus dem Zentrum. </li><li> Ziehen Sie eine Seite des Bandes sichern, und halten das Band an der quartz gleiten. Beachten der anderen Seite zu einer funktionalisierten Deckglas. </li><li> Schneiden Sie zwei 20 cm Länge aus Polyethylen-Schlauch und stecken sie in die Löcher in der Quarz-Objektträger. </li><li> Seal die Flusszelle mit 5 Minuten Epoxy-Kleber. </li><li> Wenn der Kleber ausgehärtet ist, prime die Durchflusszelle und Schläuche mit Puffer. </li><li> Ein unterstützter Lipiddoppelschicht kann in diesem Stadium, indem etwa 80 Mikroliter der Liposomen-Suspension in die Kanäle gebildet werden. </li></ol> Viruspartikel Kennzeichnung <ol><li> H3N2 Influenza A (X-31) ist in der Regel für die Fusion-Assay verwendet, aber auch andere Grippestämme und anderen Viren wurden erfolgreich eingesetzt. </li><li> Virus ist mit bis zu zwei unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen markiert den Nachweis von hemifusion und Poren-Bildung zu ermöglichen. </li><li> Lösen Sie Sulforhodamin b (SRB) in HNE-Puffer zu einer 20 mM Lösung zu machen. Kombinieren Sie 20 Mikroliter der Lösung des Farbstoffes mit 10 Mikroliter der Virussuspension, und lassen bei Raumtemperatur für 20 Stunden. Während dieser Zeit wird Farbstoff langsam in die Viruspartikel akkumulieren. </li><li> Entfernen Sie die überschüssige Farbe, indem der die Virussuspension durch eine PD-10 Entsalzungssäule. Wenn genug viralem Material verwendet wird, kann ein farbiges Band in der Spalte zu sehen. Dieser Band enthält beschriftet Virus und kann gesammelt, wie es ist, eluiert werden. </li><li> Wenn kein Band zu sehen ist, sammeln 200 Mikroliter Fraktionen und bestimmen, welche Fraktionen enthalten beschriftet Virus durch die Messung 565 nm Absorption auf einem Spektralphotometer. Das Virus sollte in einem Gesamtvolumen von ca. 0,8 ml eluieren. </li><li> Beschriften Sie die Virushülle von Zugabe von 13 Mikroliter einer 2 mM Dimethylformamid (DMF)-Lösung von Octadecyl Rhodamin 110 (Rh110C18), um den SRB gekennzeichnet Virussuspension. </li><li> Rühre die Suspension durch das Anbringen der Röhre in ein Labor-Rotator und lassen für 3 Stunden. </li><li> Purify das Virus von überschüssigem Rh110C18 mit einer PD-10 Entsalzungssäule wie zuvor beschrieben. </li></ol> Mikroskop-Konfiguration Das Experiment basiert auf einem Fluoreszenz-Mikroskop mit einer hohen NA Ölimmersionsobjektiv geeignet für Total Internal Reflection Fluorescence Mikroskopie ausgestattet war. Die 488 und 568 nm Linien aus einem Argon / Krypton-Gas-Laser verwendet, um die Rh110C18 und SRB gekennzeichnet Virus zu erregen. Gleichzeitige Darstellung von jedem Etikett ist durch die Spaltung der grünen und roten Fluoreszenz-Emission mit einem dichroitischen Spiegel erreicht und unabhängig konzentriert die Bilder auf getrennten Hälften eines Elektrons multipliziert CCD-Kamera. Durchführung des Tests Die Ausführung der Fusion Test beinhaltet eine stufenweise Zusammenbau des biochemischen Komponenten innerhalb der Messzelle: Montage der planaren Lipid-Doppelschicht, Docking-markierter Viruspartikel, die Beschichtung der Oberfläche mit Fluorescein und dem Anspringen der Reaktion bei niedrigen pH-Puffer (Abbildung 1A) . <ol><li> Montieren Sie die Flow-Zelle auf dem Mikroskoptisch, und befestigen Sie den Ablaufschlauch auf eine Spritzenpumpe, die bei einem Steuersatz von 40 Mikroliter pro Minute fließen. </li><li> Deaktivieren Sie die Strömungskanäle von überschüssigem Liposomen durch fließendes in 300 Mikroliter HNE. </li><li> Fokus des Mikroskops und stellen Sie die Laserleistung, die Oberfläche mit 350 W / cm 2 von 488 nm-Licht und 70 W / cm 2 von 568 nm Licht zu beleuchten. Wenn Sie mit einem 1,45 NA 60x Ölimmersionsobjektiv sind, stellen Sie den Laser-Intensitäten zu 100 Mikro-Watt und 20 Watt Mikro-bzw.. </li><li> Pump gekennzeichnet Virus (verdünnt 1 / 100) in eine Durchflusszelle. Da das Virus diffundiert an der Bodenfläche des Strömungskanals wird Partikel beginnen zu dem Gangliosid in die Lipid-Doppelschicht eingebaut bleiben. </li><li> Wenn ein geeigneter Dichte angedockt Viruspartikel erreicht wurde (bis etwa 1000 Teilchen pro field of view). Schalten Sie den Zulaufschlauch, um eine Lösung mit zwei Mikrogramm pro Milliliter Fluorescein markiertem Streptavidin. Die markierten Streptavidin binden gekoppelt Lipid-Moleküle in der Doppelschicht Biotin, und schließlich ein schwaches grünen Hintergrund sichtbar sein wird. </li><li> Waschen Sie den Strömungskanal mit 300 Mikroliter HNE. </li><li> Wählen Sie eine Imaging-Bereich, konzentrieren die Lupe und bereiten die CCD-Kamera für zeitversetzt Bildaufnahme. Stellen Sie die Belichtungszeit auf 100 ms und sammeln Bilder bei einer Rate von 10 Hz. </li><li> Initiieren Fusion durch fließendes in einem sauren Puffer mit 10 mM Natriumcitrat und 140 mM NaCl. Der pH-Wert des Puffers sollte so eingestellt werden unterhalb des kritischen pH-Wert des Virus untersucht werden. X-31 Sicherungen bei pH-Werten unter 5,5. </li></ol> Repräsentative Ergebnisse Abbildung 1B zeigt Schnappschüsse von Doppelschicht angedockt Virionen vor und während der Fusion. Jeder beugungsbegrenzten Spot stellt eine einzelne Viruspartikel. Rote und grüne Fluoreszenz wurden getrennt auf den oberen und unteren Hälften einer CCD-Kamera abgebildet, so dass die gleichzeitige Beobachtung der Virushülle und Content-Etiketten. Es gibt in der Regel doppelt so viele Punkte in den grünen Kanal im Vergleich zudie rote, und dies spiegelt die geringere Effizienz der Kennzeichnung durch den Inhalt Farbstoff im Vergleich zu den Umschlag-Label. Der grüne Hintergrund-Fluoreszenz von der Oberfläche emittierte gebunden Fluorescein verschwindet bei der Ankunft der Citrat-Puffer und erlaubt die Bestimmung der Startzeit der Fusionsreaktion. Hemifusion Ereignisse werden als platzt der grünen Fluoreszenz als abgeschreckt Rh110C18 in der Virushülle diffundiert durch die hemifusion Stiel erkannt und ist in der planaren Membran verdünnt. Ein nach außen erweitert fluoreszierende Wolke kann um hemifused Teilchen betrachtet werden, zeigt freie Diffusion der Fettsäuren-Acyl verbunden Farbstoff in die planare Membran. Porenbildung ist als der Zerfall von roten Fluoreszenz von SRB in das Innere der viralen Partikel gefangen beobachtet. Die Eröffnung eines Fusionspore ermöglicht der Farbstoff in die wässrige Raum unterhalb der planaren Bilayer und aus der Beobachtung Region zu entkommen. Fluoreszenzintensität Trajektorien für jedes Teilchen, aufgetragen von der integrierten Intensitäten der einzelnen Teilchen, erleichtern die Bestimmung der Ausbeute und Zeiten der hemifusion und Porenbildung (Abb. 1C). Hemifusion und Porenbildung bei Zeiten sind als der Punkt, an dem die maximale Steigung einer Rh110C18 Fluoreszenz platzen oder SRB Signalabfall tritt bestimmt. In einem erfolgreichen Experiment, geben etwa 50 Prozent der Partikel mit Rh110C18 Ertrag Dequenching Signale, und 30 Prozent der SRB markierten Partikel bezeichnet nutzbare Signal. Der Teilchen mit den beiden Farbstoffen markiert, zeigen rund 10 Prozent sowohl Lipid Misch-und Porenbildung Signale. Abb.. 2A-C zeigt die Verteilung der hemifusion und Porenbildung Verzögerungszeiten von einem typischen Experiment. Fig.2D-F zeigt Event-Verteilungen von Ereignissen aus fünf Experimenten unter den gleichen Bedingungen durchgeführt kombiniert. Auch bei einer bescheidenen Anzahl der Beobachtungen ist die Form der Histogramme deutlich. Da jedes Experiment durch den Nachweis des pH-Abfall-Zeit synchronisiert wird, können mehrere Experimente miteinander kombiniert werden und detaillierte Informationen über Rate-Limiting Zwischenschritte erreicht werden kann. <img src="/files/ftp_upload/1484/1484fig1a.jpg" border="0" alt="Abbildung 1"> <img src="/files/ftp_upload/1484/1484fig1b.jpg" border="0" alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Experimental Design. A) Virus Partikel sind mit zwei Fluoreszenzfarbstoffen markiert, um die Kinetik der hemifusion und Fusion Porenbildung zu überwachen. Die Fluoreszenz wird durch einen High-NA Mikroskopobjektiv gesammelt und abgebildet auf eine CCD. B) Fluoreszenz Bilder vor (links) und während (rechts) die Verschmelzung der einzelnen Viruspartikel. Obere und untere Hälfte jedes Bild, um die rote und grüne Fluoreszenz entsprechen jeweils der gleichen ~ 50 x 100 mm 2 Fläche der unterstützten Doppelschicht. C) Die Intensität der Fluoreszenz der roten SRB virale Inhalte Tracer (obere Kurve), bieten die grünen Rh110C18 Membran-Farbstoff (Mitte Spur), und die Fluorescein-pH-Sensor (untere Kurve) die genauen Zeiten zwischen pH-Abfall, hemifusion und Fusion vergangen. Bitte <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1484/1484fig1.jpg">klicken Sie hier,</a> um eine größere Version der Abbildung 1 zu sehen. <img border="0" src="/files/ftp_upload/1484/1484fig2tmb.jpg" alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. Fusion Kinetik der fluoreszenzmarkierten Virus. Verteilungen der Zeit zwischen dem pH-Abfall und hemifusion (A, D) und Porenbildung (B, E) verstrichen sind. Der Aufstieg und Verfall der Verteilungen weisen auf das Vorhandensein von mehreren Zwischenschritten. Der Übergang zwischen hemifusion und Eröffnung einer Fusionspore für einzelne Partikel ist exponentiell verteilt, was auf einen einzigen geschwindigkeitsbestimmenden Schritt. Panels AC zeigen die Ergebnisse einer einzigen Experiment. Panels DF sind aus fünf verschiedenen Experimenten unter den gleichen Bedingungen durchgeführt zusammengestellt. Bitte <a href="/files/ftp_upload/1484/1484fig2.jpg1484">klicken Sie hier,</a> um eine größere Version der Abbildung 2 zu sehen.

<ol><li>Elender, G., Kuhner, M., Sackmann, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functionalisation+of+Si%2FSiO2+and+glass+surfaces+with+ultrathin+dextran+films+and+deposition+of+lipid+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Functionalisation of Si/SiO2 and glass surfaces with ultrathin dextran films and deposition of lipid bilayers.</a> Biosens Bioelectron. 11, 565-577 (1996).</li>
<li>Floyd, D. L., Ragains, J. R., Skehel, J. J., Harrison, S. C., van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-particle+kinetics+of+influenza+virus+membrane+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Single-particle kinetics of influenza virus membrane fusion.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 15382-15387 (2008).</li>
</ol>

Vorbereitung von Flüssigkeit und kontinuierliche Lipiddoppelschichten kann schwierig sein. Spuren von Verunreinigung materieller oder Oberflächenfehler verhindert Ausbreitung von Doppelschichten. Eine sorgfältige Reinigung und Abscheidung einer gleichmäßigen Schicht von Dextran sind unerlässlich. Längerer Abbildung von Viruspartikeln können Bleichmittel der fluoreszierenden Markierungen oder diese wieder inaktiviert. Photo-Schäden dieser Art ist auch in der Bio-Imaging und Einzelmolekül-Bere...

<table><tbody><tr><td>Corning Deckgläser, quadratisch, 25 mm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS286525</td><td></td></tr><tr><td>Schmelzsilizium-Scheiben</td><td>Technical Glass</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Färbehalterung</td><td>Thomas Scientific</td><td>8542E40</td><td></td></tr><tr><td>(3-Glycidoxypropyl)trimethoxysilan</td><td>Gelest Inc.</td><td>SIG5840.1</td><td></td></tr><tr><td>Dextran T-500</td><td>Pharmacosmos</td><td>5510 0500 4006</td><td></td></tr><tr><td>1,2-Dioleoyl-&lt;em&gt;sn&lt;/em&gt;-glycero-3-phosphocholin (DOPC)</td><td>Avanti Polar Lipid, Inc</td><td>850375</td><td></td></tr><tr><td>1-Palmitoyl-2-oleoyl-&lt;em&gt;sn&lt;/em&gt;-glycero-3-phosphocholin (POPC)</td><td>Avanti Polar Lipid, Inc</td><td>850457</td><td></td></tr><tr><td>Cholesterin</td><td>Avanti Polar Lipid, Inc</td><td>700000</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;N&lt;/em&gt;-((6-(Biotinoyl)amino)hexanoyl)-1,2-dihexadekanoyl-&lt;em&gt;sn&lt;/em&gt;-glycero-3-phosph&amp;#8211;ethanolamin, Triethylammoniumsalz (Biotin-X DHPE)</td><td>Invitrogen</td><td>B1616</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin, mit Fluorescein konjugiert</td><td>Invitrogen</td><td>S-869</td><td></td></tr><tr><td>Disialogangliosid GD&lt;sub&gt;1a&lt;/sub&gt; aus Rindergehirn</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2392</td><td></td></tr><tr><td>Mini-Extruder</td><td>Avanti Polar Lipid, Inc</td><td>610000</td><td></td></tr><tr><td>Polycarbonat-Membranfilter, 0,1 Mikron</td><td>Whatman, GE Healthcare</td><td>800309</td><td></td></tr><tr><td>10-mm-Abflussscheiben (Membranträger)</td><td>Whatman, GE Healthcare</td><td>230300</td><td></td></tr><tr><td>Sulforhodamin B-Natriumsalz</td><td></td><td>S1402</td><td></td></tr><tr><td>Octadecylrhodamin 110 (Rh110C18)</td><td></td><td></td><td>&lt;em&gt;Siehe&lt;/em&gt; Floyd &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt; 2008 für den Syntheseprotokoll</td></tr><tr><td>PD-10-Desalting-Säulen</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0851-01</td><td></td></tr><tr><td>Nikon-Fluoreszenzmikroskop</td><td>Nikon Instruments</td><td>TE2000-U</td><td></td></tr><tr><td>Plan Apo TIRF 60x 1,45 NA Objektiv</td><td>Nikon Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Innova 70C Spectrum Ar/Kr-Laser</td><td>Coherent Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spritzenpumpe</td><td>Harvard Apparatus</td><td>702213</td><td></td></tr></tbody></table>

methode zur messung des viral fusion kinetics auf der single particle stufe

Method for Measurement of Viral Fusion Kinetics at the Single Particle Level

Membranfusion ist ein wesentlicher Schritt bei der Eingabe von umhüllten Viren in die Zellen. Konventionelle Fusion-Assays in der Regel über eine große Anzahl von Fusion Events, so dass es schwierig quantitativ zu analysieren die Reihenfolge der molekularen Schritte. Wir haben eine in vitro entwickelt, zwei-Farben-Fluoreszenz-Assay zur Kinetik der einzelnen Viruspartikel Verschmelzung mit einer Ziel-Doppelschicht auf einer im Wesentlichen Flüssigkeit Unterstützung zu überwachen. Influenza Virus-Partikel sind mit einem grünen lipophilen Fluorophor an die Membran und eine rote hydrophilen Fluorophor an die virale Innenraum Fleck Fleck inkubiert. Wir deponieren ein Gangliosid-haltigen Lipid-Doppelschicht auf der Dextran-funktionalisierten Glasoberfläche einer Durchflusszelle, bebrüten die Viruspartikel auf der planaren Bilayer und Bild der Fluoreszenz einer 100 x 100 pm 2-Gebiet, mit mehreren hundert Partikel, auf einem CCD Kamera. Durch die Abbildung die rote und grüne Fluoreszenz können wir gleichzeitig überwachen das Verhalten der Membran-Farbstoff (grün) und der wässrigen Inhalt (rot) der Partikel. Beim Absenken des pH auf einen Wert unterhalb der Fusion pH-Wert, werden die Partikel mit der Membran verschmelzen. Hemifusion, die Verschmelzung der äußeren Blatt der viralen Membran mit dem äußeren Blatt der Zielmembran, wird sichtbar, wie eine plötzliche Veränderung in der grünen Fluoreszenz eines Teilchens. Bei der anschließenden Fusion der beiden verbleibenden distalen Flugblättern eine Pore wird gebildet werden und die rot-emittierenden Fluorophors in der Viruspartikel wird unter dem Zielmembran freigegeben werden. Diese Veranstaltung wird zu einer Abnahme der roten Fluoreszenz der einzelnen Teilchen. Schließlich berichtet der integrierten Fluoreszenz aus einer pH-sensitiven Fluorophor, dass in der Ziel-Membran eingebettet ist auf den genauen Zeitpunkt der pH-Abfall. Von den drei Fluoreszenz-time Spuren lassen sich alle wichtigen Ereignisse (pH-Abfall-, Lipid-Mischung auf hemifusion, Content-Mischen nach Porenbildung) jetzt auf einfache Weise und für jedes Teilchen einzeln entnommen werden. Durch das Sammeln der verstrichenen Zeit für die verschiedenen Übergänge für viele einzelne Partikel in Histogramme, können wir die Lebensdauer der entsprechenden Zwischenprodukte. Auch versteckte Zwischenprodukte, die nicht über eine direkte Fluoreszenz beobachtbar können direkt visualisiert werden aus diesen Histogrammen.

Wir präsentieren einen<em&gt; In vitro,</em&gt; Zwei-Farben-Fluoreszenz-Assay auf die Fusion einzelner Viruspartikel mit einer Flüssigkeit Ziel Doppelschicht zu visualisieren. Durch die Kennzeichnung Viruspartikel mit Fluorophoren, die unterschiedlich Fleck der viralen Membran und im Inneren sind wir in der Lage, die Kinetik der hemifusion und Porenbildung zu überwachen.

Methode zur Messung des Viral Fusion Kinetics auf der Single Particle Stufe

Die Membranfusion ist ein essenzieller Schritt beim Eintritt behüllter Viren in Zellen. Konventionelle Fusionsassays berichten typischerweise über eine große Anzahl von Fusionen ...

Die in diesem Assay verwendeten Deckgläser sind mit Dextrin funktionalisiert und anschließend in mikrofluidische Durchflusszellen eingebaut. Danach wird jede Durchflusszelle mit einer Suspension von Liposomen inkubiert, die zur Bildung einer Lipiddoppelschicht auf der hydratisierten Dextrin-Schicht fusionieren. Unter dem Fluoreszenzmikroskop werden ein mit Fluoro vier markiertes Virus sowie mit Fluorescein markiertes Streptavidin zugegeben, und das Virus kann an die Doppelschicht andocken.Ein Zustrom von saurem Puffer löst die virale Fusion mit der Doppelschicht aus, und eine Digitalkamera zeichnet die Änderungen der Fluoreszenz während des gesamten Assays auf. Hallo, ich bin Daniel Floyd und befinde mich im Labor von Anine Vanian am Department für Biologische Chemie und Molekulare Pharmakologie der Harvard University. Heute werde ich Ihnen eine Methode zur Visualisierung der Kinetik der viralen Fusion auf Ebene einzelner Partikel zeigen.Wir verwenden dieses Verfahren im Labor, um zu untersuchen, wie das Virus in Wirtszellen gelangt. Beginnen wir also. Starten Sie dieses Protokoll, indem Sie die mit Dextrin funktionalisierten Deckgläser vorbereiten.Der erste Schritt besteht darin, die Deckgläser in Lösungen mit 10% Reinigungsmittel, einmolarer Kaliumhydroxid-Aceton-Lösung und 100%igem Ethanol jeweils 30 Minuten lang zu beschallen. Dazwischen mit entionisiertem Wasser spülen. Nach der letzten Beschallung die Deckgläser mit Wasser spülen und anschließend im 80 Grad Celsius-Brutschrank trocknen.Als Nächstes die Deckgläser drei Minuten lang in einen Sauerstoff-Plasmareiniger geben. Dieser Schritt oxidiert die Oberfläche der Objektträger, wodurch das Glas für die nachfolgenden Silanisierungsschritte einheitlich hydrophil und reaktiv wird. Danach die Deckgläser in eine frische Lösung von 0,2 % Glycidoxipropyltrimethoxysilan in Isopropanol eintauchen und fünf Minuten lang inkubieren.Anschließend spülen Sie die Deckgläser mehrmals mit Isopropanol aus. Legen Sie die mit Slan beschichteten Deckgläser eine Stunde lang bei 80 Grad Celsius. Dieser Aushärtungsschritt ermöglicht es, dass das Slan kovalent an das Glas bindet.Nach dem Aushärten die Deckgläser flach auf die Innenseite einer Kunststoff-Box für die Tiefkühlung legen. Die Oberfläche jedes Deckglases mit etwa einem Milliliter einer Dextrinlösung bedecken. 30 % Gewicht pro Volumen in Wasser.Schließen Sie die Kühlbox und lassen Sie die Deckgläser 24 bis 36 Stunden lang an einem ruhigen Ort stehen. Gießen Sie am nächsten Tag das überschüssige Dextrin ab, greifen Sie die Deckgläser mit Plastiktupfern und legen Sie sie zurück in das Keramikgestell. Spülen Sie sie mehrmals mit Wasser ab und lassen Sie sie 48 Stunden lang in Wasser einweichen.Der Behälter kann vorsichtig auf einem Tischrotator bewegt werden, um die Deckgläser in einem auf 80 Grad Celsius eingestellten Ofen zu trocknen, und anschließend bis zum nächsten Arbeitsschritt im Vakuumexsikkator aufbewahrt werden. Beschichten Sie die Deckgläser mit einer Mischung aus Liposomen, um eine planare Doppelschicht zu bilden. Im nächsten Schritt bereiten Sie die Liposomen zur Bildung der Lipiddoppelschicht im Abzug vor, indem Sie alle in Chloroform gelösten Lipide in einem Glasreagenzglas vereinigen.Die Liposomenformulierung enthält Dia-Ganglien-Seite, das Viruspartikel bindet, und ein biotinyliertes Lipid, das den mit Streptavidin konjugierten pH-Indikator Fluorescein bindet. Anschließend verdampfen Sie das Lösungsmittel unter einem Strom von Argon- oder Stickstoffgas. Entfernen Sie das verbleibende Lösungsmittel, indem Sie das Reagenzglas zwei Stunden im Vakuumexsikkator stehen lassen.Suspendieren Sie den getrockneten Lipidfilm in 400 µL HNE-Puffer. Überführen Sie die Suspension danach in ein Kunststoff-Mikrozentrifugenröhrchen. Gefrieren Sie die Suspension in einem flüssigen Stickstoffbad und tauen Sie sie in einem warmen Wasserbad auf.Wiederholen Sie diesen Gefrier-Tau-Zyklus viermal nach den Gefrier-Tau-Zyklen. Verwenden Sie einen Lipid-Extruder mit einem Membranfilter von 100 Nanometern, um die Lipidsuspension zu extrudieren. Nach der Extrusion sollte die Suspension 25-mal transparenter erscheinen.Bewahren Sie die Liposomen bei Raumtemperatur auf und verwenden Sie sie am Tag der Herstellung. Da die Lipide nun bereit sind, bereiten Sie als Nächstes die mikrofluidische Flusszelle vor. Nehmen Sie dazu einen Quarzglasobjektträger mit den Maßen 20 mal 20 mal drei Millimeter und bohren Sie mit einem Diamantbohrer zwei ein Millimeter große Löcher auf gegenüberliegenden Seiten.Schneiden Sie mit einem Rasiermesser ein 20 Millimeter großes Quadrat aus einer Doppelseitklebefolie aus. Schneiden Sie einen 15 mal 2 Millimeter großen Bereich in der Mitte aus. Entfernen Sie die Schutzfolie auf einer Seite und befestigen Sie die Folie auf dem Objektträger.Befestigen Sie die andere Seite an einer funktionalisierten Deckglasplatte, die nun in 20 cm lange Stücke von Polyethylenschläuchen geschnitten ist, und setzen Sie diese in die Bohrungen des Quarzobjektträgers ein. Versiegeln Sie die Durchflusszelle abschließend mit Fünf-Minuten-Epoxidharzkleber. Tragen Sie den Kleber ringsum die Seiten des Quarzobjektträgers auf, um diesen mit der Deckglasplatte zu verbinden.Verwenden Sie zwei weitere Tropfen Klebstoff, um die Verbindung zwischen der Schlauchleitung und dem Quarzobjektträger abzudichten. Nach dem Aushärten des Klebstoffs spülen Sie die Durchflusszelle und die Schläuche mit HNE-Puffer vor. Um als Nächstes den unterstützten Lipiddoppelschicht aufzubauen, nehmen Sie die extrudierte Liposomensuspension und ziehen etwa 80 Mikroliter in die Kanäle am Tag vor dem Fusionsexperiment ein.Beginnen Sie mit der Markierung der Viruspartikel, um das virale Innere rot zu färben. Geben Sie 20 Mikroliter frisch zubereitete Sulfur-Rubin- oder SRB-Lösung zu 10 Mikrolitern der Virus-Suspension hinzu und lassen Sie die Mischung 20 Stunden bei Raumtemperatur stehen. Am nächsten Tag entfernen Sie den überschüssigen Farbstoff, indem Sie die Virus-Suspension durch eine PD-10-Desalting-Säule laufen lassen und mit 800 Mikrolitern HNE-Puffer verdünnen.Die Säule sollte eine deutliche farbige Bande aufweisen, die das markierte Virus enthält. Sammeln Sie diese Fraktion im nächsten Schritt während der Ellucian-Phase und markieren Sie die virale Hülle grün, indem Sie 13 Mikroliter Octa decal, RUMINE one 10 oder RH one 10 C 18 zur SRB-markierten Virus-Suspension hinzufügen. Rühren Sie die Suspension um, indem Sie das Gefäß an einen Laborrotator anschließen, und lassen Sie es drei Stunden lang stehen.Entfernen Sie anschließend überschüssiges RH one 10 C 18 mithilfe einer PD-10-Desalting-Säule. Wie zuvor ist das Virus nun bereit für den Fusionstest. Führen Sie den Assay zur Fusionskinetik mit einem Fluoreszenzmikroskop durch, das mit einem Objektiv mit hoher numerischer Apertur für Ölimmersion ausgestattet ist.Ein Argonne-Kryptonlaser regt die Fluorofarbstoffe in der viralen Membran und im Inneren an. Ein dichroitischer Spiegel trennt anschließend die rote und grüne Fluoreszenzemission und fokussiert die Bilder unabhängig voneinander auf getrennte Hälften einer elektronenmultiplizierenden CCD- oder ladengekoppelten Vorrichtungskamera. Befestigen Sie die Deckglasplatte auf der Mikroskopbühne und schließen Sie das Auslasrohr an eine Spritzenpumpe an, die auf einen Durchfluss von 100 Mikrolitern pro Minute eingestellt ist.Entfernen Sie überschüssige Liposomen aus den Flusskanälen, indem Sie 300 Mikroliter HNE durchströmen lassen. Fokussieren Sie das Mikroskop und stellen Sie die Laserleistung so ein, dass die Oberfläche mit 350 Watt pro Quadratzentimeter Licht der Wellenlänge 488 Nanometer zur Anregung der roten Flora und mit 70 Watt pro Quadratzentimeter Licht der Wellenlänge 568 Nanometer zur Anregung der grünen Flora beleuchtet wird. Nun, da das Mikroskop bereit ist, pumpen Sie das markierte Virus, verdünnt im Verhältnis 1:100, in die Flusszelle.Während das Virus zur unteren Oberfläche des Flusskanals diffundiert, beginnen die Partikel zu andocken. Sie haften an der in die Deckgläser eingebauten, planaren Doppelschicht auf der Seite der DIA-Ganglien. Wenn die Dichte der angehefteten Partikel etwa mehrere hundert Partikel pro Sichtfeld erreicht hat, beginnen Sie, eine Lösung mit zwei Mikrogramm pro Milliliter zuzuführen.Fluorescein-markiertes Streptavidin, ein pH-empfindlicher Fluorophor, da das markierte Streptavidin an biotinylierte Lipidmoleküle in der Doppelschicht bindet. Ein schwaches grünes Hintergrundsignal erscheint erneut; spülen Sie den Flusskanal mit 300 Mikroliter HNE. Nachdem die Viren angeheftet sind und die Oberfläche der Doppelschicht mit Fluorescein beschichtet ist, kann der Nachweis beginnen.Wählen Sie einen Bildgebietsbereich aus, fokussieren Sie das Mikroskop und bereiten Sie die CCD-Kamera für die zeitaufgelöste Bildaufnahme vor. Stellen Sie die Belichtungszeit auf 100 Millisekunden ein und sammeln Sie Bilder mit einer Rate von 10 Hertz. Leiten Sie die Virusmembranfusion ein, indem Sie einen sauren Zitratpuffer mit Natriumzitrat zuführen.Wenn der pH-Wert sinkt, nimmt die Fluorescein-Fluoreszenz ab, wodurch der Zeitpunkt der Versäuerung genau bestimmt werden kann. Die CCD-Kamera zeichnet während des gesamten Assays Daten auf, mit deren Hilfe man den Zeitpunkt der Hemi-Fusion und die Bildung von Poren bestimmen kann, wie von der CCD-Kamera dokumentiert. Nach dem pH-Abfall treten kurze Ausbrüche grüner Fluoreszenz auf, wenn sich die virale und die planare Membran verschmelzen, sich die Lipide vermischen und der grüne Farbstoff in der viralen Hülle in der planaren Membran verdünnt wird.Im Gegensatz dazu kommt es nach dem pH-Abfall zu einer Abnahme der roten Fluoreszenz, da die viralen und lipidären Membranen Poren bilden, wodurch der rote Farbstoff aus dem viralen Inneren in den wässrigen Raum unterhalb der planaren Doppelschicht entweicht und außerhalb des Sichtfelds gelangt; diese Trends können ebenfalls durch fluoreszierende Momentaufnahmen vor und während der Fusion veranschaulicht werden. Zeichnen Sie außerdem die Fluoreszenzintensitätsverläufe für jedes Partikel wie in diesem Beispiel gezeigt auf. Hemi-Fusion wird als der Zeitpunkt definiert, zu dem die Steigung der grünen Fluoreszenzintensität am steilsten ist, und Porenbildung als der Zeitpunkt, zu dem der Abfall der roten Fluoreszenz auftritt. Kombinieren Sie Daten aus mehreren Experimenten, um Histogramme der Lag-Zeiten für Hemi-Fusion und Porenbildung wie hier dargestellt zu erstellen, wobei der Zeitpunkt des pH-Abfalls als t gleich null gesetzt wird, um Daten aus verschiedenen Experimenten zu synchronisieren.Ich habe Ihnen soeben eine Methode gezeigt, mit der man die Kinetik der Virusfusion auf Ebene einzelner Partikel messen kann. Achten Sie bei dieser Prozedur darauf, saubere Deckgläser zu verwenden, um eine homogene und fluide Doppelschicht zu gewährleisten.Versuchen Sie außerdem, die Lichtmenge während der Fluoreszenzbildgebung so gering wie möglich zu halten, um photoinduzierte Schäden zu minimieren. Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

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