Name: Denaturierung Urea Polyacrylamidgelelektrophorese (Urea PAGE) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-10-29T07:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 44 s
Description: Lernen Sie die Denaturierende Urea-Polyacrylamid-Gelelektrophorese zur Trennung einzelsträngiger DNA oder RNA nach Molekulargewicht. Diese Methode ermöglicht präzise Analysen von Oligonukleotiden.

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Diese Arbeit wurde von der Singapore Academic Research Council (ARC) [Förderkennzeichen 90/07] unterstützt. Wir danken radiodurans für die Unterstützung.

Die vollständige und detaillierte Text-Protokoll für dieses experimentelle Vorgehen ist in Current Protocols in Molecular Biology. Detaillierte Schritt-für-Schritt-Anleitungen für die Montage des Gels Sandwich und für Gel-Apparatur kann auf der Website BioRad 3 gefunden werden. Erforderliche Ausrüstung: Glasplatten (innere und äußere) 10 cm-Zelle: 10,1 x 7,3 cm (Innen-Platte), 10,1 x 8,2 cm (äußere Platte), BioRad 20 cm-Zelle: 20 x 20 cm (innere Platte), 20 x 22,3 cm (äußere Platte), BioRad 0.5-1.5 mm Gel-Kamm und Spacer Gel Gelgießstand Gel Gerät mit Deckel und Kabel Hochspannungs-Netzgerät Heizblock oder Wasserbad Serologische Pipetten und Pipettenspitzen Hilfe Pipette und Pipettenspitzen Gel Trockner oder Scanner Reagenzien und Lösungen: Urea (Reinstwasser) 40% Polyacrylamid-Lösung (29:1) 10 x TBE-Lösung (Tris-Borat, EDTA-Puffer) Deionisiertes, destilliertes Wasser TEMED 30% (w / v) Ammoniumpersulfat-Lösung 0,5 x TBE-Lösung Formamid EDTA Xylencyanol Bromphenolblau Methanol Ethanol <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td> Volumen </td><td colspan="3" style="text-align:center;"> 50 ml </td><td colspan="3" style="text-align:center;"> 60 ml </td><td colspan="3" style="text-align:center;"> 10 ml </td></tr><tr><td> Acrylamid-Konzentration </td><td> 10% </td><td> 12,5% </td><td> 15% </td><td> 10% </td><td> 12,5% </td><td> 15% </td><td> 10% </td><td> 12,5% </td><td> 15% </td></tr><tr><td> g Harnstoff </td><td> 24 </td><td> 24 </td><td> 24 </td><td> 28,8 </td><td> 28,8 </td><td> 28,8 </td><td> 4,8 </td><td> 4,8 </td><td> 4,8 </td></tr><tr><td> ml 40% Acryl (29:1) </td><td> 12,5 </td><td> 15,625 </td><td> 18,75 </td><td> 15 </td><td> 18,75 </td><td> 22,5 </td><td> 2,5 </td><td> 3,125 </td><td> 3,75 </td></tr><tr><td> ul 30% APS </td><td> 166 </td><td> 166 </td><td> 166 </td><td> 199,2 </td><td> 199,2 </td><td> 199,2 </td><td> 33 </td><td> 33 </td><td> 33 </td></tr><tr><td> ul TEMED </td><td> 20 </td><td> 20 </td><td> 20 </td><td> 24 </td><td> 24 </td><td> 24 </td><td> 4 </td><td> 4 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> 10 x TBE </td><td> 5 </td><td> 5 </td><td> 5 </td><td> 6 </td><td> 6 </td><td> 6 </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td colspan="10"> Füllen Sie das Volumen mit deionisiertem, destilliertem Wasser </td></tr></tbody></table> Tabelle 1: Reagenzien und Lösungen für die verschiedenen Acrylamid-Konzentrationen und Volumina für die Lösung einzelner Oligonukleotide benötigt Gel-Sandwich Montage und Gelzubereitung <ol><li> Montieren Sie das Gel nach Herstellerangaben Beschreibung und fix das Gel in die Gel-Casting Kammer 3. Verwenden 0,5-1,5 mm dicke Abstandshalter. </li><li> Die geeignete Polyacrylamid-Lösung nach aktuellen Protokolle der Molekularbiologie oder, wie in Tabelle 1 aufgeführt. Für eine Denaturierung Acrylamid-Gel von 20 cm x 22 cm x 1,5 mm, 60 ml Gel-Lösung und für ein 10,1 x 8,2 cm x 1 mm Gel 5 ml Gel-Lösung ist ausreichend. Größere Gele verwendet werden, wenn die erwarteten Produkte / Bands im Bereich von wenigen Basen sind, dann eine längere Gel lösen Bands mit einer Differenz von einem einzigen Nukleotid. Wenn die erwarteten Banden in mehr als 10 Nukleotide unterscheiden, werden kleinere Gele geeignet sein, um die Fragmente zu lösen. Wählen Sie den Prozentsatz der Polyacrylamid, dass Ihre Trennung Anforderungen entspricht, wird eine höhere Polyacrylamid-Konzentrationen lösen niedrigerem Molekulargewicht Fragmente. Verwenden Sie Reinstwasser Harnstoff und vermischen sich mit der gewünschten Menge an Acrylamid. Add TBE-Puffer, um das Gel mischen, um eine endgültige Konzentration von 0,5-1 x TBE bekommen und füllen Sie das Volumen mit deionisiertem, destilliertem Wasser. Erhitzen Sie die Lösung für 20 Sekunden in der Mikrowelle und mischen Sie es sanft. Für größere Gelvolumina wiederholen Sie diesen Schritt, bis die Lösung handwarm. </li><li> Gießen Sie das Gel sofort mit einer serologischen Pipette und einer automatischen Pipette Hilfe zwischen den beiden Glasplatten. Vermeiden Sie die Einführung von Luftblasen. Setzen Sie den Kamm und lassen Sie das Gel für 30-60 Minuten polymerisieren. </li></ol> Richten Sie die Elektrophorese-Apparatur und Vorlauf des Gels <ol><li> Demontieren Sie das Gel aus der Giesskammer und der Montage auf das Gel gemäß produziert Anleitung 3. </li><li> Füllen Sie das untere Pufferkammer wit Laufpuffer (0.5-1 x TBE), dass die Glasplatten werden subzusammengeführt 2-3 cm mit Puffer. Füllen Sie die obere Pufferkammer bis an die Spitze des Gels mit Laufpuffer. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig den Kamm und spülen Sie die Taschen mit Laufpuffer mit Hilfe einer Pipette und Ladepuffer Tipps. </li><li> Bringen Sie den Deckel des Gel-System und stecken Sie die Kabel zu einem Hochspannungs-Stromversorgung. Bevor Sie Ihre Proben laden können, müssen Sie das Gel für mindestens 30 Minuten Vorlauf des Gels erhitzen und die verbleibenden Harnstoff aus dem Gel zu entfernen. Die optimale Temperatur sollte zwischen 45-55 ° C. Vermeiden Sie Temperaturen über 60 ° C als Banden konnten Abstrich oder die Glasplatten knacken könnte. Wählen Sie konstante Watt für den Vorlauf (15-25 W pro Gel). </li></ol> Probenvorbereitung <ol><li> In der Zwischenzeit bereiten Sie Ihre Proben. Daher fügen Sie die entsprechende Menge von 2 x Gelbeladung Mix Ihrer Probe. Der Laden-Mix enthält in der Regel 90% Formamid, 0,5% EDTA, 0,1% Xylencyanol und 0,1% Bromphenolblau. </li><li> Bevor die Proben auf das Gel aufgetragen werden kann, müssen Proben werden hitzedenaturiert durch Erhitzen der Proben zwischen 70-90 ° C für ein paar Minuten. </li></ol> Laden und Ausführen des Gels <ol><li> Wenn der Vorlauf beendet ist, entfernen Sie den Deckel und spülen Sie die Taschen gründlich wie vor als Harnstoff hat sich in den Vertiefungen ausgewaschen beschrieben. </li><li> Übernehmen Sie die Proben vorsichtig aus dem Boden der Tasche. Vermeiden Sie die Einführung von Luftblasen. Loading Puffer zu leeren Taschen angewendet werden, um gleiche Bedingungen während des Laufes zu halten. </li><li> Montieren Sie den Deckel, und führen Sie das Gel bei konstanten Watt zu einem Gel Temperatur von 55 ° C zu halten ähnlich dem Vorlauf. Beachten Sie die Migration der Marker-Farbstoffe, bis der Farbstoff vor Erreichen des unteren Endes des Gels. Die Laufzeit beträgt abhängig von den Prozentsatz der verwendeten Acrylamid, Ionenstärke des Puffers und Geldicke. Ein Lauf kann zwischen 2-4 Stunden dauern. Prüfen Sie auf die Temperatur des Gels. Ein Gel-Thermometer kann helfen, die richtige Temperatur während des Laufs zu überwachen. </li></ol> Prozess des Gels <ol><li> Wenn der Farbstoff vor das Ende des Gels erreicht Das Gel wird aus dem unteren Pufferkammer. Entfernen Sie das Gel aus der Kammer und lösen Sie die Klammern. Ziehen Sie die Abstandhalter und vorsichtig verstellen den Glasplatten. Wenn nötig entfernt der oberen und Gel Teil abgeschnitten. </li><li> Sorgfältig Transfer des Gels in eine Schale mit Gel Fixation Lösung (gleiche Konzentration an TBE plus 5-10% Methanol und Ethanol). Lassen Sie das Gel in die Lösung für 5-10 Minuten und ändern Sie den Puffer zweimal. </li><li> Das Gel ist bereit für die weitere Verarbeitung mit einem Staubsauger Geltrockner oder direktes Scannen des Gels. </li></ol>

<ol><li>Maniatis, T., Jeffrey, A., van deSande, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chain+length+determination+of+small+double-+and+single-stranded+DNA+molecules+by+polyacrylamide+gel+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Chain length determination of small double- and single-stranded DNA molecules by polyacrylamide gel electrophoresis.</a> Biochemistry. 14, 3787-3794 (1975).</li>
<li>Albright, L. M., Slatko, B. E. Denaturing polyacrylamide gel electrophoresis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAlbright%2C+LM+%22Curr+Protoc+Nucleic+Acid+Chem%22">Curr Protoc Nucleic Acid Chem</a>. , (2001).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22PROTEAN+II+xi+Cell+and+PROTEAN+II+xi+2-D+Cell+Instruction+Manual%22">PROTEAN II xi Cell and PROTEAN II xi 2-D Cell Instruction Manual</a>. , Biorad. (2001).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

<ol><li> Die Band Schärfe hängt von mehreren Faktoren ab. Das Volumen der Probe für scharfe Banden geladen werden sollte, so klein wie möglich, also im Idealfall zwischen 1-5 pl. Allerdings können bis zu 15 ul geladen, die noch eine akzeptable Auflösung. Weniger Probenvolumen Ergebnisse in schärfere Banden. </li><li> Die Band Qualität ist auch abhängig von der Gel-Dicke. Thinner Gelen, wie z. B. 0,75 mm zeigen bessere Ergebnisse als 1,5 mm dicken Gele. </li><li> Die Form der Bänder können auch während der Gel-loading beeinflusst werden, wenn di...

denaturierung urea polyacrylamidgelelektrophorese (urea page)

Denaturing Urea Polyacrylamide Gel Electrophoresis (Urea PAGE)

Harnstoff-PAGE oder denaturierende Harnstoff-Polyacrylamid-Gelelektrophorese beschäftigt 6-8 M Harnstoff, der sekundären DNA-oder RNA-Strukturen denaturiert und wird für die Trennung in einem Polyacrylamid-Gel-Matrix auf das Molekulargewicht eingesetzt. Fragmente zwischen 2 bis 500 Basen, mit einer Länge von Differenzen so klein wie ein single nucleotide können getrennt mit dieser Methode 1 sein. Die Migration der Probe ist abhängig von der gewählten Acrylamid-Konzentration. Ein höherer Prozentsatz von Polyacrylamid löst niedrigerem Molekulargewicht Fragmente. Die Kombination von Harnstoff und Temperaturen von 45-55 ° C während der Gel laufen zu lassen für die Trennung von unstrukturierten DNA-oder RNA-Moleküle. Im allgemeinen wird diese Methode ist erforderlich, um zu analysieren oder zu reinigen Einzelstrang-DNA oder RNA-Fragmente, wie synthetisiert oder markierte Oligonukleotide oder Produkte aus der enzymatischen Spaltung Reaktionen. In diesem Video-Artikel zeigen wir, wie die Vorbereitung und Ausführung der denaturierenden Harnstoff-Polyacrylamidgelen. Technische Tipps enthalten sind, zusätzlich zu den Original-Protokoll 1,2.

Denaturierung Harnstoff-Polyacrylamid-Gelelektrophorese wird verwendet, um Einzelstrang-DNA oder RNA getrennt bis zu einer Grenze von 500 Nukleotiden. Urea in Kombination mit Hitze denaturiert Proben und unstrukturierte Einzelstränge in der Gel-Matrix migrieren nach ihrem Molekulargewicht.

Denaturierung Urea Polyacrylamidgelelektrophorese (Urea PAGE)

Die Harnstoff-PAGE oder denaturierende Harnstoff-Polyacrylamid-Gelelektrophorese verwendet 6–8 M Harnstoff, welcher sekundäre DNA- oder RNA-Strukturen denaturiert und für deren ...

Im Allgemeinen wird dieser Geltyp zur Trennung einzelsträngiger DNA- oder RNA-Fragmente benötigt, wie beispielsweise synthetisierter oder markierter Oligonukleotide oder Produktionsstoffe aus enzymatischen Spaltreaktionen. Der Trennbereich hängt von der Polyamidkonzentration ab, Harnstoff in Kombination mit Hitzedenaturierung der Probe sorgt dafür, dass einzelsträngige Moleküle innerhalb der Gelmatrix entsprechend ihrem Molekulargewicht wandern. In diesem Video wird das Gießen, Laufenlassen und die Aufarbeitung eines typischen Gels vorgestellt.Hallo, mein Name ist Haki. Ich bin an der Nang Technological University tätig. In dieser Demonstration zeige ich Ihnen, wie man eine denaturierende Polyacrylamid-Gelelektrophorese durchführt.Verwenden Sie saubere Glasplatten und bauen Sie das Gel-Sandwich gemäß der Herstellerbeschreibung zusammen. Befestigen Sie das Gel in der standardmäßigen Giegelkammer. Entfernen Sie die Glasplatten bei großen Gele, wenn das Gel dazu neigt, an den Glasplatten zu haften.Wählen Sie eine Gelelektrophorese mit geeigneter Größe und Dicke entsprechend Ihren Trennanforderungen. Bereiten Sie die Gelelektrophorese-Lösung gemäß den aktuellen Protokollen der Molekularbiologie vor.Wählen Sie eine Polyamidkonzentration, die Ihren Trennanforderungen entspricht. Höhere Acrylamidgehalte ermöglichen die Auftrennung von Fragmenten mit niedrigerem Molekulargewicht. Verwenden Sie Alta pure UIA und mischen Sie es in einem Becher oder einer Flasche mit der gewünschten Menge Polyacrylamid.Gebe 10 XTBE-Puffer zur Lösung hinzu und fülle mit Wasser auf das erforderliche Volumen auf. Erhitze die Lösung 20 Sekunden in der Mikrowelle und mische sie vorsichtig, bis sich das UIA vollständig aufgelöst hat. Bei Bedarf kann die Lösung für größere Gelelektrophoresevolumina aufbewahrt werden.Wiederholen Sie den Mikrowellenschritt, bis die Lösung handwarm ist. Vermeiden Sie es, die Lösung zu stark zu erhitzen. Überhitzen Sie nicht, da Harnstoff nach 60 Grad zu degradieren beginnt.Grad Celsius kann am Geruch von Ammoniak erkannt werden. Wenn die Lösung klar ist und auf Raumtemperatur abgekühlt hat, fügen Sie PS und Tamid zur Gel-Lösung hinzu und mischen Sie sie vorsichtig. Wenn die Gel-Lösung zu warm ist, polymerisiert das Gel innerhalb der Pipette.Gießen Sie das Gel mit einer serologischen Pipette und dann Pipettenhilfe zwischen die beiden Glasplatten. Vermeiden Sie das Einführen von Luftblasen. Führen Sie den Kamm vorsichtig ein.Vermeiden Sie, Luftblasen einzuschließen, und lassen Sie das Gel 30 bis 60 Minuten lang polymerisieren. Nehmen Sie das Gel vom Gießgestell ab und bauen Sie es in die obere Pufferkammer ein. Gemäß der Herstelleranleitung platzieren Sie das Gel in die untere Pufferkammer und füllen das untere Reservoir mit Elektrophoresepuffer, üblicherweise 0,5 bis 1× TBE.Die gleiche Konzentration wie für das Gel verwendend, füllen Sie die obere Pufferkammer mit Laufpuffer für das Gel bis zum Rand der Glasplatte. Bevor Sie Ihre Proben auftragen können, müssen Sie das Gel mindestens 30 Minuten vorlaufen lassen, um das Gel aufzuheizen und verbleibendes Harnstoff aus dem Gel zu entfernen. Die optimale Temperatur sollte zwischen 45 und 55 Grad Celsius liegen, wie auch bei der eigentlichen Gelelektrophorese.Vermeiden Sie Temperaturen über 60 Grad, da sich die Banden verwischen könnten oder die Glasplatten springen könnten. Entfernen Sie die Flüssigkeit vorsichtig, ohne die Kanten zu stören, und spülen Sie die Vertiefungen durch, um Harnstoff zu entfernen, der in sie eingedrungen ist. Verwenden Sie Gelauftrags-Pipettenspitzen und pipettieren Sie mehrmals auf und ab.Für jedes Gel befestigen Sie den Deckel des Gelsystems und schließen Sie die Kabel an eine Hochspannungsstromquelle an. Wählen Sie für den Vorgang konstante Wattzahlen, etwa 15 bis 20 Watt pro Gel. Sobald die Stromquelle eingeschaltet wird, zeigen Luftblasen eine gute Leitfähigkeit an.Unterdessen bereiten Sie Ihre Proben vor und geben daher die geeignete Menge an 2x-Gel-Ladepuffer zu Ihrer Probe. Wenn der Vorgang des Vorlaufs beendet ist, nehmen Sie den Deckel ab und spülen Sie die Taschen gründlich aus, wie zuvor beschrieben; es ist sehr wichtig, die Geltaschen sorgfältig zu reinigen, um Harnstoffrückstände zu entfernen, da Harnstoff eine dichte Schicht bildet, die der Probe das Eindringen in das Gel erschwert.Gleich vor Ihnen. Erhitzen Sie Ihre Probe, indem Sie sie mehrere Minuten lang mindestens auf 70 Grad Celsius inkubieren. Geben Sie die Proben vorsichtig von der Unterseite der Tasche aus auf.Für bestimmte Anwendungen stört der Farbstoff Ihre Probe und kann unscharfe Banden verursachen, oder der Farbstoff zeigt das fluoreszierende Signal an. In diesem Fall ist es sinnvoll, einen Farbstoff oder alle Farbstoffe zu entfernen und den Standardpuffer mit Farbstoff aufzutragen. In ein leeres Loch geben Sie einen Größenstandard; die Menge an Probe, die Sie für scharfe Banden idealerweise auftragen sollten, liegt zwischen ein und fünf Mikrolitern, aber Sie können auch höhere Volumina bis zu 15 Mikrolitern auftragen.Kleinere Probenvolumina führen zu schärferen Banden. Vermeiden Sie das Einführen von Luftblasen und lassen Sie die Probe langsam in die Tasche absinken, damit sich eine einheitliche Schicht bildet. Wenn Sie eine fluoreszente Markierung verwenden, verpacken Sie das Gelsystem in Aluminiumfolie, um eine Belichtung mit Licht zu verhindern, die zu einer Photobleiche Ihrer Probe führen könnte.Bauen Sie den Deckel zusammen und schalten Sie die Stromversorgung ein. Laufen Sie das Gel, bis die DIA-Front das untere Ende des Gels erreicht hat. Die Laufdauer hängt vom Acrylamidgehalt ab.Sie wählen die Ionenstärke Ihres Puffers, die Gelelektrophorese-Dicke und -länge. Ein Lauf kann zwischen einer und mehreren Stunden dauern. Beobachten Sie die Migration der markierten Proteine, um die Elektrophorese-Dauer zu bestimmen.Verwenden Sie konstante Watt und überprüfen Sie die Temperatur des Gels. Ein Gel-Thermometer kann helfen, die richtige Temperatur während des Laufs zu überwachen, oder konsultieren Sie die Bedienungsanleitung des Gel-Apparats, wenn der Lauf beendet ist. Schalten Sie die Stromversorgung aus und entfernen Sie den Deckel des Gel-Apparats.Als Nächstes nehmen Sie das Gel-Sandwich aus der unteren Pufferkammer heraus. Gießen Sie den Puffer aus der oberen Pufferkammer ab. Füllen Sie eine Schale mit Fixierungslösung für das Gel.Diese Lösung sollte die gleiche Konzentration an TB sowie fünf bis 10 % Methanol und äthanolische Säure enthalten. Entfernen Sie das Gelsandwich aus dem Gerät und lösen Sie die Klemmen. Ziehen Sie die Abstandshalter ab und bauen Sie die Glasplatten vorsichtig mit einem Spatel auseinander. Falls erforderlich, schneiden Sie den Wichter in einem Brunnen mit Gellösungsteil oder dem unteren leeren Gellösungsteil auf und entsorgen Sie die überflüssigen Gellösungsstücke wie z. B. Farbstoff enthaltende Bahnen.Bei fluoreszierenden Proben die Gel vorsichtig von der Glasscheibe ablösen und in eine Schale mit Gelfixierungslösung überführen. Das Gel fünf bis zehn Minuten in der Lösung belassen und den Puffer zweimal wechseln. Die Schale vorsichtig schwenken, um Harnstoff aus dem Gel zu waschen, oder das Gel je nach Anwendung in die Färbungslösung geben.Die Gelqualität hängt auch von der Gelstärke ab. Dünnere Gele wie 0,75 Millimeter zeigen bessere Ergebnisse als 1,5 Millimeter dicke Gele, sind jedoch schwieriger zu handhaben. Die Schärfe der Banden hängt von mehreren Faktoren ab.Eine niedrige Spannung zu Beginn des Laufs kann zu schärferen Banden führen, da die Probe gleichmäßiger in die Gelebene eindringt, und verhindert, dass die Geltaschen aufgrund hoher Spannung einbrechen. Ein kurzes Stapelgel mit niedrigem Acrylamidgehalt kann denselben Effekt der Bandenschärfung erzielen; die Zugabe von 10 % Glycerin erleichtert zudem das Beladen des Gels, wodurch die Probe besser in die Mulden absinkt. Es empfiehlt sich, den Lade-Puffer leichter auf leere Taschen aufzutragen, um während des Laufs gleichmäßige Bedingungen beizubehalten.Wenn sich Ihr Gel in Fixierungslösung befindet, können Sie das Gel zur weiteren Bildgebung in einem Vakuum-Geltrockner trocknen oder je nach verwendeter Markierung oder Färbung das Gel direkt scannen. Diese U-Seite eignet sich zur Analyse oder Isolierung von Einzelstrang-DNA- oder RNA-Proben. Gele können bei Raumtemperatur aufbewahrt werden.Daher die Gele in ein Papiertuch einwickeln und mit Wasser oder Laufpuffer tränken. Das eingewickelte und nasse Gel in einen wasserdichten Plastikbeutel geben und innerhalb von 48 Stunden verwenden. Ein häufig beobachtetes Problem ist das „Gel-Lächeln“ (Gel smiling).Das liegt an einer ungleichmäßigen Wärmeverteilung durch das Gel. Wenn das Gel nicht von Puffer umgeben ist, kann die Befestigung einer Metallplatte die Qualität des Gels verbessern. Hallo, ich bin Hi Kasam.Ich bin von der N Yang Technological University. Ich habe Ihnen gezeigt, wie man eine denaturierende Polymerase-Kettenreaktion durchführt. Bis zum nächsten Mal.

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