Name: Skalierbare Fluidic Injector Arrays für Viral Targeting von Intact 3-D Schaltkreise im Gehirn (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-01-21T00:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 36 s
Description: Erfahren Sie, wie skalierbare Fluidic Injector Arrays die parallele Viruslieferung zu komplexen neuronalen Schaltkreisen im Gehirn ermöglichen. Diese Methode erlaubt die optische Manipulation spezifischer Zelltypen in vivo.

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ESB erkennt Finanzierung durch New Innovator des NIH Director Award (DP2 OD002002-01), NIH Challenge Grant 1RC1MH088182-01, NIH Große Chancen Stipendium 1RC2DE020919-01, NIH 1R01NS067199-01, NSF (0835878 und 0848804), die McGovern Institute Neurotechnologie Award Program , dem Department of Defense, NARSAD, die Alfred P. Sloan Foundation, Jerry und Marge Burnett, der SFN-Forschungspreis für Innovation in Neuroscience, dem MIT Media Lab, der Benesse Stiftung und der Wallace H. Coulter Foundation.

1. Der Bau Stereotaktische Clamp <ol><li> Die stereotaktische Klammer zur Befestigung der Injektor-Array mit dem stereotax verwendet, so dass die Injektoren parallel zur stereotaktischen Arm sind. </li><li> Jedes Labor muss nur eine Klammer, es sei denn, es wird erwartet, dass mehr als eine Operation kann gleichzeitig stattfinden. In diesem Fall machen die gleiche Nummer wie die zu erwartende maximale Anzahl der gleichzeitigen Operationen. Es könnte auch ratsam, eine zusätzliche machen, im Falle von Schäden an der ersten. </li><li> Um die stereotaktische Klemme, erstens, ist ein 1,5 mm Außendurchmesser (OD) Stahlkanüle bis 2 cm in der Länge geschnitten, und eines der Enden nach unten, bis flach Dremeled. </li><li> Als nächstes wird ein kleines Stück (ca. 0,5 x 0,5 cm) aus PCB proto-board geschnitten, um als Abstandshalter verwendet werden. </li><li> Mit Hilfe eines Laser-Cutter, um sicherzustellen, dass alle Schnitte senkrecht zur Oberfläche des Materials, sind zwei identische Rechtecke (2.1 &quot;x 3 / 8&quot;) von 1 / 8 &quot;Acryl Folien, jedes Rechteck mit zwei kreisrunde Löcher in Schnitt gegenüberliegenden Ecken des Rechtecks. Das erste Loch hat einen Durchmesser 1,5 mm, und ist gerade groß genug, um die Metallkanüle festhalten. Das zweite Loch hat einen Durchmesser 1 / 16 &quot;(Abbildung 1C). </li><li> Die Metall-Kanüle wird in die 1,5 mm Loch von einem Rechteck eingefügt, dann durch die 1,5 mm Bohrung des zweiten. Das untere Ende der Kanüle ist mit der Unterseite des unteren Rechtecks ​​ausgerichtet und bildet die Form eines Hockey-Schläger. </li><li> Halten Sie die Abstandhalter fest zwischen die beiden Rechtecke statt, ist diese Struktur zusammen mit Heißkleber rund um die Kanüle und 1,5 mm Löcher zementiert, wobei darauf zu vermeiden, kleben Sie den Abstandhalter an den Rechtecken. Knetmasse kann hilfreich sein, Dinge zusammen zu halten während dieses Prozesses. </li><li> Nachdem der Leim getrocknet ist, ist ein 1-72 Schraube in den 1 / 16 Loch von der Oberseite der Rechtecke eingefügt. Dann wird eine 1-72 Sechskantmutter wird auf das Ende der 1-72 Schraube eingedreht und festgezogen. Die Schraube und Mutter dazu dienen, die Klammer zusammenhalten. </li><li> Zur Befestigung der Sechskantmutter an der Unterseite des unteren Rechtecks, kleine Mengen von 5-Minuten-Epoxy sind um den Rand der Sechskantmutter gesunken, ohne dass das Epoxidharz in das Gewinde der hex Mutter oder Schraube zu bekommen. Jede Modelliermasse wird entfernt, und es wird bestätigt, dass der Abstandhalter fest an seinem Platz kann durch Anziehen der Schraube gehalten werden. </li></ol> 2. Vorbereiten des Systems für die individuelle Injektor Array: Hamilton Pumpe und stereotax <ol><li> Der Injektor-Array-System kann an nahezu jedem Satz von Koordinaten in das Gehirn angepasst werden. </li><li> Der Benutzer zuerst lokalisiert Koordinaten des gewünschten Injektionsstellen in eine Maus (oder andere Arten) Hirnatlas, die Umstellung auf den entsprechenden Koordinaten der stereotax verwendet (hier X-, Y-und Z-Koordinaten). Die Zahl der Injektionsstellen (drei in den Figuren 1A und 1B) wird im Folgenden als k sein. </li><li> k-Zahl von 10 ul Hamilton Spritzen sind in einer Injektion / Entnahme Spritzenpumpe wie diese von der Harvard Gerät gestellt. </li><li> Next, 3-Fuß-lange Stücke aus Polyethylen-Schlauch fest mit der Nadel eines jeden Hamilton-Spritze befestigt. </li><li> Für jedes Stück aus Polyethylen-Schlauch, eine F-252-Schlauch Manschette aus Upchurch Scientific ist über das offene Ende geschoben und an eine P-627 Schlauchadapter mit der mitgelieferten Mutter und Ferrule, auch von Upchurch Scientific. </li></ol> 3. Die Konstruktion der Customized Injector Array <ol><li> Jeder Injektor Array wird der Satz von Koordinaten, die der Benutzer angepasst werden. Doch für Sätze von Koordinaten, die nur durch eine Übersetzung und / oder Rotation unterscheiden, kann die gleiche Düse Array verwendet werden. </li><li> Betrachtet man nur die relative X-und Y-Koordinaten der Injektionsstelle, sind k Löcher in eine PCB proto-board mit einer Dicke von 1 / 32 gebohrt &quot;, mit dem gleichen Abstand zueinander. Diese Bohrlöcher werden mit einem Modela Mini-Mühle und eine 0,011&quot; Durchmesser Bohrer von der McMaster-Carr. Achten Sie darauf, eine langsame Bohren (Z-Geschwindigkeit) nutzen, um zu vermeiden brechen oder Verschleiß des Bohrers. Vor dem Entfernen der Karte aus der Mühle, ist ein Rechteck um die kleinen Löcher gebohrt, mit einem größeren Bohrer mit einem Durchmesser von 1 / 32 &quot;, zu vermeiden, tragen die kleineren Code für die Mini-Mühle erzeugt wird, kann leicht mit Hilfe von MATLAB werden;. Probe Code ist in den folgenden Dateien zur Verfügung gestellt. <ol class="lroman"><li> generate.m - MATLAB-Code zur Erzeugung Modela Code gewünschten Koordinaten </li><li> holes_ex.rml - Modela Code für das Bohren Ruftonmuster (acht Löcher) in Proto-Board </li><li> outline_ex.rml - Modela Code für das Bohren Rechteck um Löcher </li></ol></li><li> 245 um OD/100 um Innendurchmesser (ID) Quarzglaskapillare Schlauch, erhältlich von Polymicro Technologies, ist in k Anzahl von 3 cm große Stücke schneiden. Diese umfassen die einzelnen Injektoren. Ein Einweg-Stück Kapillarrohr wird durch stochertejedes der Löcher, zu beseitigen Schmutz, ohne zu verstopfen die tatsächliche Injektoren. Die Injektoren sind dann zur Hälfte in jedes Loch gesteckt, so dass sie dicht und parallel zueinander gehalten. Die Injektoren sind in den Vorstand geklebt und bildet die Struktur der Injektor-Array. Was bleibt, ist die Injektoren auf die richtige Länge zu trimmen. </li><li> Der Injektor-Array ist die stereotaktische Klemme, indem Sie eine Ecke des proto-board zwischen den Acryl-Rechtecke angebracht ist, und dann durch Anziehen der Schraube der stereotaktischen Klemme. Als nächstes wird die Metallkanüle der Klemme, die stereotax befestigt, mit dem Befestigungsmechanismus der stereotax. </li><li> Alle folgenden wird unter dem Mikroskop durchgeführt. Für einen der äußeren Einspritzdüsen (das heißt, eines, das von der Seite mit einer geraden Kante angefahren werden kann, ohne anzustoßen in keine der anderen Injektoren), ist die Spitze, die über den Boden des Proto-Board mit einer Schere abgeschnitten. Für kortikale Injektionen, ist es angebracht, die Injektor sich etwa 5mm über der Oberfläche des proto-board. Für tiefere Injektionen, kann diese Zahl durch die entsprechende Erhöhung in der Tiefe erhöht werden. Die Spitze ist mit einem Dremel abgeflacht. Injector Tipps können auch geschliffen werden in einem Winkel als zusätzliche Vorsichtsmaßnahme gegen Verstopfung, wenn Präzision in der Tiefe ist weniger wichtig. </li><li> Als nächstes wird ein stabiler Bezugspunkt innerhalb der Reichweite der stereotaktischen Arm gewählt, und der Injektor-Array wird verschoben, so dass die abgeflachte Spitze des äußeren Injektor, bei dieser Bezugspunkt ist. </li><li> Ein zweiter Injektor ist so gewählt, zusammen mit den entsprechenden Koordinaten. Betrachtet wird der relative Unterschied in der Höhe (z-Richtung) zwischen dem ersten und zweiten Injektor Koordinaten. Der Injektor-Array ist entlang der Z-Achse durch diese relative Distanz bewegt. Die zweite Einspritzdüse wird beschnitten und Dremeled auf die richtige Länge, so dass die Spitze des zweiten Injektor ist jetzt flach und auf der Höhe des Bezugspunktes. Der Injektor-Array kann in der X-und Y-Richtung bewegt werden, um gegenüber der Injektorspitze mit dem Bezugspunkt zu erleichtern. </li><li> Dieser Prozess der Besatz ist für die restlichen Injektoren wiederholt. </li></ol> 4. Montage des gesamten Systems <ol><li> Die stereotaktische Klemme und maßgeschneiderte Injektor-Array, beide bereits gebaut, sind für diesen Teil benötigt. </li><li> Das hintere Ende eines jeden Injektors (Ende, der bisher nicht beschnitten) ist in einen blauen F-240-Schlauch Manschette und mit Hilfe eines P-235 Nuss-und P-200 Zwinge aus Upchurch Scientific eingefügt wird, wird auf den Gewindeadapter bereits angeschlossen befestigt die Hamilton-Pumpe durch PE-Rohre. Die Anweisungen des Herstellers kann für weitere Details eingesehen werden. </li><li> Mit einer 27-Gauge-Nadel wird Silikonöl in die Rückseite des Hamilton-Spritzen so dass das gesamte System aus dem Hamilton-Spritze ist es, die Injektorspitze gefüllt injiziert, ohne Luftblasen überhaupt. </li><li> Als Hamilton Spritzen sind in der Hamilton-Pumpe neu platziert, ist das größtmögliche Volumen von Silikonöl in die Spritzen erhalten. </li><li> Wenn das Experiment erfordert mehr Spritzen als die Pumpe für (zwei in diesem Fall) ist so konzipiert, kann das Spritzen mit kleinen Stücken aus Kunststoff (z. B. Nadel caps) angeordnet werden, damit sie parallel zueinander, und dafür zu sorgen, dass alle Stücke sind getrieben von der Pumpe im gleichen Umfang. Oder Sie können ein Multi-Rack-Upgrade-Kit von Harvard Apparatus erworben werden, um bis zu 10 Spritzen auf einmal. </li></ol> 5. Injektionen / Chirurgie <ol><li> Der Prozess der Injektion mit einem parallel Injektor ist sehr ähnlich dem der Injektion mit einer einzigen Pipette. </li><li> Es ist wichtig, langsam nachfüllen verwenden / Infusion Raten während dieses Prozesses, denn schnelle Pumpen könnten Druck auf das Gelenk zwischen großen und kleinen Schlauch gelegt. Empfohlene max Geschwindigkeit: 2 ml / min für das Laden-Virus, und 0,1 ml / min zur Infusion Virus. </li><li> Einer narkotisierten Maus ist in der stereotax gesetzt und bleibt während des gesamten Versuchs betäubt. </li><li> Bereiten Sie die Maus nach Bedarf. Zum Beispiel mit einem Skalpell wird ein einziger hieb die Mittellinie der Haut gemacht, zwischen den Augen, zwischen den Ohren. Die Haut wird wieder auf den Schädel freizulegen, und die Faszie zu reinigen. A gezogen Glaspipette auf die stereotax befestigt. Die Positionen des Ohres Bars sind so eingestellt, bis Bregma und Lambda auf die gleiche Höhe ausgerichtet sind, und so, dass die Verbindungslinie zwischen ihnen ist parallel zur Y-Achse des stereotax. Die Achsen der stereotax sind nach dem Koordinatensystem, in dem die Injektion Koordinaten berechnet wurden orientiert. Die stereotaktische ist mit der Spitze der Glaspipette auf Bregma Null und dann die Spitze liegt leicht über dem Schädel an der X-und Y-Koordinaten von einem der Injektionsstelle positioniert. </li><li> Mit Hilfe eines zahnärztlichen Bohrers, der Schädel ist unterhalb der Spitze sorgfältig weg, bis es bleibt eine extrem dünne Schicht des Knochens verglichen. Die Glaspipette kann geringer seined und angehoben, um zu überprüfen, dass das Loch gebohrt an der richtigen Stelle zentriert ist. Mit einer 30-Gauge-Nadel, ein kleines Stück der Schicht wird vorsichtig aus, um die richtige X-und Y-Koordinaten, nahm, so dass die Dura mater freigelegt ist. Dieses Loch sollte gerade groß genug, um einer der Injektoren (0,25 mm breit) passen. Siehe Abbildung 1D für Diagramm. Auf diese Weise sind klein, 0,25 mm große Löcher in den Schädel, beim X-und Y-Koordinaten, die jeweils an der Injektionsstelle. </li><li> Die Glaspipette wird in einem Entsorgungsboxen verworfen, und die individuelle Injektor Array wird an die stereotax angebracht mit der stereotaktischen Klemme. </li><li> Um korrekt den Winkel des Injektors Array sind zwei äußeren Injektoren ausgewählt, um zu einem bestimmten Referenzpunkt kalibriert werden, wie folgt. Nach einer der Injektoren mit dem Referenzpunkt abgestimmt ist, betrachten die relative X-und Y-Abstände zwischen den Injektionen relativ zu diesem Injektor und einem anderen. Die Achsen der stereotax sind so eingestellt, dass gesamte Injektor-Array ist in der X-und Y-Richtung durch diesen relativen Abstände verschoben. Wenn der zweite Injektor ist jetzt nicht mit dem Bezugspunkt ausgerichtet, ist die Metallkanüle gelockert und gedreht werden. Dieser Prozess ist iterativ, bis der Injektor-Arrays richtig abgewinkelt wird wiederholt. </li><li> Vor dem Füllen der Injektoren mit einem Virus, sind die Injektoren mit Silikonöl gefüllt, bis die Spritzen an der 2 ul Punkt (oder mehr) sind. Dies stellt eine Pufferzone, so dass Luftblasen oder Verstopfungen in der Spitze leicht, indem Öl nach vorne mit dem Hamilton-Pumpe, ohne Nachfüllen des gesamten Systems mit Silikonöl von der Rückseite der Spritzen, wie zuvor beschrieben, entfernt werden. </li><li> Eine sterile Stück Parafilm ist auf dem Schädel platziert, und die Injektoren sind leicht auf den Parafilm gesenkt. Für Koordinaten mit sehr unterschiedlichen Tiefen, ein Brauch-Frästeil (z. B. eine Treppe Gebilde) erleichtern könnte loading. </li><li> Die folgenden Teile davon ausgehen, dass 1 ul Virus an jedem Standort geladen werden (die folgenden Mengen sollten verkleinert werden, wenn kleinere Mengen gewünscht werden) ist. Um zu gewährleisten, dass&gt; 1 ul des Virus an jedem Standort eingespritzt wird, beträgt 1,5 ul des Virus auf den Parafilm oder Treppe an der Spitze eines jeden Injektors pipettiert. </li><li> Mit dem Nachfüllen von dem Hamilton-Pumpe auf 1 ml / min, beträgt 1,2 ul des Virus in jedem Injektor wieder aufgefüllt. </li><li> Die Spitze des längsten Injektor ist bei Bregma Null, und dann den Injektor Array wird an die X-und Y-Koordinaten dieser Injektor verschoben. Wenn Verstopfung ist ein Problem, sagen, wenn viele tiefe Ziele beteiligt sind: Schon vor dem Einlegen der Injektor Spitzen in das Gehirn, ist es manchmal ratsam, die Pumpe die Infusion zu starten, bis Viren zu erkennen, die sich aus all den Injektor Tipps. Dies entfernt die Luftblasen in den Injektor Tipps und sorgt dafür, dass es keine Verstopfung. Im Falle einer Verstopfung wird der Hamilton-Pumpe auf einen kurzen Puls mit einer höheren Geschwindigkeit von 2 ml / min ziehen lassen, vorsichtig ausräumen zu verstopfen. </li><li> Der Injektor Array wird dann abgesenkt, durch die kleinen Löcher mit der 30-Gauge-Nadeln aus, um die richtige Z-Tiefe. </li><li> 1 ul-Virus wird durch jeden Injektor, bei 0,1 ml / min. </li><li> Die Injektionen werden allein für 30 Minuten verlassen. </li><li> Nach dem Injektor-Array wird langsam aus dem Gehirn extrahiert, die Hamilton-Pumpe eingestellt mit der gleichen Rate von 0,1 ml / min ziehen lassen, um für Verstopfungen in jedem Injektor überprüfen. </li><li> Dann werden die Injektoren sind durch Nachfüllen und Infusion von 1,5 ul Ethanol bei 2 ml / min gereinigt. </li><li> Schließlich sind die Injektoren mit Silikonöl gefüllt, um die 2 ul Pufferzone in jedem Hamilton-Spritze aufrecht zu erhalten. </li><li> Alle Geräte sollten vor und nach dem Eingriff sterilisiert werden, je nach Ihrer Institution Biosicherheit und Nutzung von Tieren Protokolle. </li></ol> 6. Repräsentative Ergebnisse Die parallel Injektor Array beschleunigt eine Operation etwa um den Faktor gleich der Anzahl von Injektoren, nicht mitgerechnet Setup-und Recovery-Zeit, auch wenn einzelne Mal von der Geschicklichkeit des Behandlers abhängig ist. Für eine 1 Mikroliter Injektion, wir in der Regel sah Lentivirus Ausdruck in eine Sphäre von ca. 1mm Durchmesser (Abb. 1E). Die Präzision der Injektion war so, dass die Variabilität in der Spitze positioniert, von Versuch zu Versuch, war etwa 45 Mikrometer (Standardabweichung der Abstand von der Spitze der Lage, die beabsichtigten Position der Spitze). <img src="/files/ftp_upload/1489/1489fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Design, Implementierung und Verwendung eines parallel Virus Injektor-Array. A, schematische Darstellung des parallel Injektor-Array-System, die eine Dreifach-Injektor-Konfiguration, für drei gleichzeitige Injektionen. B, Foto von einem dreifachen parallel Injektor Array als in A diagrammed . <strong&gt; C, stereotaktischen Klemme, in Umrissen von oben gezeigt, D, Illustration der Technik für die effiziente, Schaden-Minimierung, Öffnung der Löcher im Schädel für Injektor Einsetzen in Gehirn:. mit einem zahnärztlichen Bohrer, dünnen Schädel bis auf ~ 50 Mikron dick, dann verwenden Sie der Spitze einer spitzen Nadel eine kleine Kraniotomie öffnen. E-, Fluoreszenz-Bild zeigt Channelrhodopsin-2 (ChR2)-GFP-markierten Zellen in drei Maus-kortikalen Regionen, wie die Dreifach-Injektor Array gezielt in B gezeigt

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</ol>

Alle Arbeiten wurden in Übereinstimmung mit den NIH Leitfaden für Versuchstiere und vom MIT Animal Care und Nutzung und Biosafety Ausschüsse.

In den letzten Jahren haben eine Reihe von genetisch kodierten optischen Sensibilisatoren Neuronen aktiviert werden, damit aktiviert werden und zum Schweigen gebracht in vivo in einem zeitlich präzise Art und Weise, in Reaktion auf kurze Lichtimpulse (zB 1,4,5,6,7,8 , 11). Eine wichtige Methode, mit der Nervenzellen sensibilisiert worden, um in das Gehirn von Säugetieren Licht haben, wird über Viren, wie zB Lentiviren und Adeno-assoziierte Viren (AAV), die Gene, die für Opsine um Gehirne von Tieren reicht von Mäusen, Affen liefern können, in einem sichere und dauerhafte Art und Weise (zB 2,9,10). Viren ermöglichen schnellere Durchlaufzeiten, als sie Transgenik, vor allem für Organismen, die nicht genetische Modellorganismen wie Ratten und Affen, und für Opsine können hohe Expression, die nicht in transgenen Szenarien möglich ermöglichen kann. Hier zeigen wir eine parallele Injektor Array in der Lage zu schaffen, in einer schnellen Zeitskala, &quot;Circuit-Level-Transgenen,&quot; enabling gesamte 3-dimensionale Hirnstrukturen zu viral mit einem Gen gezielt in einem einzigen chirurgischen Schritt. Der Injektor Array besteht aus einer oder mehreren Verdrängerpumpen, dass jedes Laufwerk eine Reihe von Spritzen, von denen jeder in eine Polyimid / Fused-Silica-Feeds über eine Hochdruck-tolerant Anschluss Kapillare. Die Kapillaren sind so bemessen, und dann in, gewünschten Stellen durch individuelle Fräsen einer stereotaktischen Positionierung Bord angegebenen eingefügt, so dass Viren oder andere Reagenzien auf den gewünschten Satz an Hirnregionen geliefert werden. Zur Verwendung des Geräts, der Chirurg füllt zunächst die fluidische Subsystem vollständig mit Öl, Hinterfüllungen die Kapillaren mit dem Virus, fügt das Gerät in das Gehirn, und flößt Reagenzien langsam (&lt;0,1 ul / min). Diese Technologie ermöglicht eine Vielzahl neuer Arten von Experimenten, wie Millisekunden-Zeitskala Herunterfahren von komplex geformten Strukturen (wie dem Hippocampus) zu präzisen Zeitpunkten während Verhalten, zeitlich präzise Inaktivierung von bilateralen Strukturen, die redundant wirken können (z. B. der linken und rechten Amygdala), und die Störung mehrerer diskreter Hirnregionen (zB zum Antrieb von zwei verbundenen Regionen außer Phase zu untersuchen, wie Cross-Region synchron hängt Aktivität innerhalb jeder Region oder anregend Eingänge zu einer Region, während silencing eine Teilmenge von die Ziele, um zu verstehen, welche der verschiedenen Ziele sind entscheidend für die Vermittlung der Auswirkungen dieser Eingänge). Für große Gehirne wie die in den Primaten, bei denen wir vor kurzem optische Zelltyp spezifische neuronale Aktivierung 3, störende Tätigkeit in einem verhaltensgestörte relevanten Bereich können virale Kennzeichnung von großen, komplexen Strukturen erfordern demonstriert. Wir stellen fest, dass parallel Injektor-Arrays verwendet werden, um nahezu jede Nutzlast zu injizieren - Drogen, Neuromodulatoren, Neurotransmitter, oder sogar Zellen - in komplexe 3-D-Muster im Gehirn, in einer zeitlich präzise Art und Weise. Schließlich ist aus einer translatorischen Standpunkt aus ist es möglich, dass eine schnelle, Patienten-individuelle Gentherapie oder Drug-Delivery-Geräte können schnell werden individuell entworfen und gefertigt, um individuelle Gehirn Geometrien übereinstimmen, die Unterstützung neuer Behandlungsmöglichkeiten für eine Vielzahl von Erkrankungen, die möglicherweise durch den Einsatz von optische Kontrolle Moleküle. Der Injektor-Arrays wurden entwickelt, um genau zu sein, sowohl räumlich als auch volumetrisch. In der X-und Y-Richtung, ist dies durch Bohrungen sehr genau platziert Löcher mit einer kostengünstigen Mini-Mühle, mit den Löchern, die gerade groß genug, um die Injektoren, so dass Injektoren parallel zueinander statt fit erreicht, und in einer präzisen Standort. In der Z-Richtung sind die Injektoren getrimmt mit einem stereotaktischen Apparat, so dass ein Maß an Präzision entspricht, dass der stereotaktischen Operation. Die volumetrische Genauigkeit ergibt sich aus der Präzision der Hamilton-Pumpe, sowie die nahe null Totvolumen Anschlüsse, aus der Hochdruck-Flüssigchromatographie (HPLC) Gebiet angepasst. Die Injektoren sind aus Quarzglas Kapillarrohr, die stark und stabil genug, dass es genau die Form und den Abstand unter Druck hält gemacht wird, ohne größere Wandstärke von Alternativen wie z. B. Stahl Kanülen. Kleine Änderungen können leicht den parallel Injektor-Array an eine Vielzahl von Experimenten anzupassen. Zum Beispiel, wenn ein kleineres Volumen von Viren oder feiner Abstand erforderlich ist, können kleinere Kapillarrohr eingesetzt, zusammen mit einem entsprechenden kleineren Bohrer werden. Zukünftige Geräte können zu nutzen mikrofluidischen Kanälen und Pumpen, um die Anzahl der parallel Injektoren zu erhöhen, um die Größe zu minimieren (vielleicht die solche Bauteile auf die Köpfe der frei beweglichen Tieren montiert werden).

<table><tbody><tr><td>Dremel-Werkzeug</td><td>Werkzeug</td><td>Dremel</td><td>3956-02</td><td></td></tr><tr><td>Laser-Schneidemaschine</td><td>Werkzeug</td><td>Universal Laser Systems</td><td>VLS2.30</td><td></td></tr><tr><td>Heißklebepistole</td><td>Werkzeug</td><td>Stanley Bostitch</td><td>GR20</td><td></td></tr><tr><td>Spritzenpumpe für Injektion/Aspiration (Hamilton-Pumpe)</td><td>Werkzeug</td><td>Harvard Apparatus</td><td>702001</td><td></td></tr><tr><td>10 &amp;mu;l Hamilton-Spritzen</td><td>Werkzeug</td><td>Hamilton Co</td><td>701N</td><td>Eine pro Injektionsstelle benötigt</td></tr><tr><td>Maus-Stereotaxiegerät</td><td>Werkzeug</td><td>Stoelting Co.</td><td>51725D</td><td></td></tr><tr><td>Modela-Minifräse</td><td>Werkzeug</td><td>Roland</td><td>MDX-15</td><td></td></tr><tr><td>Bohrer mit 0,011&quot; Durchmesser für Minifräse</td><td>Werkzeug</td><td>McMaster-Carr</td><td>8915A12</td><td></td></tr><tr><td>Bohrer mit 1/32&quot; Durchmesser für Minifräse</td><td>Werkzeug</td><td>McMaster-Carr</td><td>8848A35</td><td></td></tr><tr><td>Hochgeschwindigkeits-Zahnbohrmaschine</td><td>Werkzeug</td><td>Lynx</td><td>333</td><td></td></tr><tr><td>Zubehör für Zahnbohrmaschine</td><td>Werkzeug</td><td>Pearson Assessments</td><td>F 35-08-25 F 35-07-10 P 86-02-38</td><td></td></tr><tr><td> </td><td> </td><td></td><td></td><td> </td></tr><tr><td>Edelstahl-Kanüle mit 1,5 mm Außendurchmesser (OD)</td><td>Material</td><td>Small Parts, Inc.</td><td>HTX-15R</td><td></td></tr><tr><td>1-72 Gewinde-Schlitzschraube</td><td>Material</td><td>Small Parts, Inc.</td><td>MX-0172B</td><td></td></tr><tr><td>1-72 Sechskantmutter</td><td>Material</td><td>Small Parts, Inc.</td><td>HNX-0172</td><td></td></tr><tr><td>PCB-Prototypenplatine, 1/32&quot; dick</td><td>Material</td><td>Digi-Key</td><td>PC57-T-ND</td><td></td></tr><tr><td>Acrylplatte, 1/8&quot; dick</td><td>Material</td><td>McMaster-Carr</td><td>8560K239</td><td></td></tr><tr><td>HPLC-Verbinder</td><td>Material</td><td>Upchurch Scientific</td><td>F-252, P-627, P-200, P-235, F-240 (einige dieser Artikel sind im 10er-Pack erhältlich; einfach ein &amp;#8216;x&amp;rsquo; an das Ende der Artikelnummer anhängen)</td><td>Eine pro Injektion und Stelle benötigt, außer F-252, P-627 und P-235, die wiederverwendet werden können</td></tr><tr><td>Schmelzsilikat-Kapillarrohr, OD: 245 &amp;mu;m, ID: 100 &amp;mu;m</td><td>Material</td><td>Polymicro Technologies</td><td>2000022-10M</td><td></td></tr><tr><td>Allzweck-Epoxidharz, Aushärtung in 5 Minuten</td><td>Material</td><td>Permatex</td><td>84101</td><td>Allzweck-Epoxidharz, Aushärtung in 5 Minuten</td></tr><tr><td>Polyethylen-Schlauch, 0,066 x 0,095 Zoll</td><td>Material</td><td>VWR international</td><td>63018-827</td><td></td></tr></tbody></table>

skalierbare fluidic injector arrays für viral targeting von intact 3-d schaltkreise im gehirn

Scalable Fluidic Injector Arrays for Viral Targeting of Intact 3-D Brain Circuits

Unser Verständnis von neuronalen Schaltkreisen - stark durch eine Technologie wäre für die schnelle Targeting Gene bis hin zu komplexen 3 erleichtert - wie sie die Berechnungen, dass subserve Empfindung, Denken, Fühlen und Handeln, und wie sie sich in neurologischer und psychiatrischer Erkrankungen beschädigte vermitteln - dimensionale neuronalen Schaltkreise, die die schnelle Entwicklung von &quot;Circuit-Level Transgenik.&quot; Vor kurzem haben wir Verfahren, bei denen Viren kodieren für lichtempfindliche Proteine ​​spezifischen Zelltypen zu Millisekunden-Zeitskala Aktivierung zu sensibilisieren und zum Schweigen im intakten Gehirn entwickelt. Wir stellen hier die Konzeption und Umsetzung eines Injektors Array der Lage ist, Viren (oder andere Flüssigkeiten), Dutzende von definierten Punkten innerhalb der 3-dimensionalen Struktur des Gehirns (<strong&gt; Abbildung. 1A, 1B</strong&gt;). Der Injektor Array besteht aus einer oder mehreren Verdrängerpumpen, dass jedes Laufwerk eine Reihe von Spritzen, von denen jeder in eine Polyimid / Fused-Silica-Feeds über eine Hochdruck-tolerant Anschluss Kapillare. Die Kapillaren sind so bemessen, und dann in, gewünschten Stellen durch individuelle Fräsen einer stereotaktischen Positionierung Bord angegebenen eingefügt, so dass Viren oder andere Reagenzien auf den gewünschten Satz an Hirnregionen geliefert werden. Zur Verwendung des Geräts, der Chirurg füllt zunächst die fluidische Subsystem vollständig mit Öl, Hinterfüllungen die Kapillaren mit dem Virus, fügt das Gerät in das Gehirn, und flößt Reagenzien langsam (&lt;0,1 Mikroliter / min). Die Parallelität der Injektor-Array ermöglicht eine schnelle, genaue und robuste Kennzeichnung des gesamten neuronalen Schaltkreise mit viralen Nutzlasten wie optische Sensibilisatoren, Licht-Aktivierung und Inaktivierung von definierten Schaltkreise im Gehirn zu aktivieren. Zusammen mit anderen Technologien wie Glasfaser-Arrays für Licht Lieferung an gewünschte Sätze von Hirnregionen, hoffen wir, einen Werkzeugkasten, dass die systematische Untersuchung von kausalen neuronalen Funktionen im intakten Gehirn aktiviert wird. Diese Technologie kann nicht nur öffnen, wie systematische Ansätze zur Schaltung fokussierten Neurowissenschaften in Säugetieren, und erleichtern die Kennzeichnung von Hirnregionen in großer Tiere wie Primaten, kann aber auch offen eine klinische translationale Pfad für Zell-spezifische optische Kontrolle der Prothetik können, deren Genauigkeit ermöglichen eine verbesserte Behandlung von hartnäckigen Störungen des Gehirns. Schließlich können solche Geräte, wie hier beschrieben zu erleichtern präzise getimten fluidische Lieferung von anderen Nutzlasten, wie Stammzellen und pharmakologische Mittel, um 3-dimensionale Strukturen, in einer leicht vom Benutzer individuell Mode.

Controlling und Analyse von neuronalen Schaltkreisen<em&gt; In vivo</em&gt; Würde durch eine Technologie zur Bereitstellung von Viren und anderen Reagenzien zu wünschen übrig 3-dimensional Sätze von Hirnregionen erleichtert werden. Wir zeigen, kundenspezifische Fluidik-Injektor Array Herstellung und Lieferung von viral codierte optische Sensibilisatoren, so dass optische Manipulation komplexer Schaltkreise im Gehirn.

Skalierbare Fluidic Injector Arrays für Viral Targeting von Intact 3-D Schaltkreise im Gehirn

Unser Verständnis neuronaler Schaltkreise – wie sie die Berechnungen vermitteln, die Empfindung, Denken, Emotion und Handeln unterstützen, und wie sie beeinträchtigt werden ...

Zwei rechteckige Acrylstücke werden mit einem Laser geschnitten und anschließend zusammengefügt, um die stereotaktische Klammer zu bilden, die dazu dient, die Injektoranordnung bezüglich der Stereoangriffe festzuhalten. Eine Spritzenpumpe wird mit Spritzen beladen, die über Polyethylenschläuche mit einem gewünschten Gehirnkreislauf verbunden sind. Eine Bohrmaschine dient zum Anfertigen von Löchern, durch die Fused-Silica-Schläuche eingeführt werden, wodurch sich die Injektoren bilden.Die Injektoren werden umkehrbar in der Klammer befestigt und anschließend so zurechtgeschnitten, dass sie die gewünschten Hirnschaltkreise ansteuern. Jeder Injektor ist mit einem einzelnen Polyethylenkanal verbunden. Die Vorbereitung des Systems für den Gebrauch umfasst das Befüllen des Systems über die Spritzen mit Silikonöl und das anschließende Einfüllen flüssiger Reagenzien in die Injektoren.Der parallele Injektor wird anschließend in die Zielregionen des Gehirns eingeführt und die Reagenzien infundiert. Hallo, ich bin Stephanie Chan von der Arbeitsgruppe für synthetische Neurobiologie am MIT. Bislang erforderte die Expression von Genen in räumlich komplexen Gehirnschaltkreisen entweder die langsame und kostspielige Erzeugung transgener Tiere oder den mühsamen Prozess viraler Injektionen, die jeweils nacheinander auf einer Seite durchgeführt werden mussten.Heute zeigen wir Ihnen, wie man eine parallele Injektoranordnung aufbaut und verwendet, um Flüssigkeiten gezielt in komplexe dreidimensionale Muster im Gehirn abzugeben. Mithilfe dieser Anordnung können wir schnell transgene Mausmodelle mit schaltungsspezifischen Viren erzeugen, indem wir Viren gleichzeitig über alle Injektoren verteilen und damit alle Zielregionen auf einmal ansprechen. Unser Injektor eignet sich zur Abgabe beliebiger flüssiger Reagenzien an eine komplexe Verteilung von Gehirnarealen.Unser heutiges Ziel ist es, Viren zu verabreichen, die für lichtempfindliche Proteine kodieren, sodass wir zeitlich präzise bestimmte Zelltypen in spezifischen Schaltkreisen gezielt aktivieren und deaktivieren können. In unserem Labor nutzen wir diese Technologie in Kombination mit Arrays aus optischen Fasern, die Licht auf schaltkreisspezifische Weise abgeben. Beginnen wir also.Zunächst stellen wir eine stereotaktische Halterung her, die die Injektionsvorrichtung aufnimmt und am Stereotaxiegerät befestigt werden kann. Für die Herstellung der Halterung werden folgende Gegenstände benötigt: Eine zwei Zoll lange Stahlführungshülse mit einem äußeren Durchmesser (OD) von 1,5 Millimetern, wobei ein Ende leicht abgeflacht ist, ein kleines Stück Leiterplatte (PCB Protoboard) von etwa 0,5 mal 0,5 Zentimeter Größe und zwei identische rechteckige Teile.Eine halbe mal drei Achtel Zoll große Aussparung aus einer Achtel-Zoll-Acrylplatte in jedem der beiden Acrylrechtecke. Schneiden Sie zwei runde Löcher an gegenüberliegenden Ecken aus. Das erste Loch sollte einen Durchmesser von 1,5 Millimetern haben und gerade groß genug sein, um die Metallkanüle festzuhalten.Das zweite Loch sollte einen Durchmesser von einem Sechzehntel Zoll haben. Führen Sie die Metallkanüle in das 1,5-Millimeter-Loch eines Rechtecks und anschließend durch das 1,5-Millimeter-Loch des zweiten Rechtecks ein, richten Sie das untere Ende der Kanüle mit der Unterseite des unteren Rechtecks aus, um die Form eines Eishockeyschlägers zu bilden, und platzieren Sie den Abstandshalter zwischen den beiden Rechtecken. Modellierknete ist hilfreich, um die Teile während dieses Vorgangs zusammenzuhalten und gleichzeitig den Abstandshalter fest zwischen den beiden Rechtecken zu fixieren.Verfestigen Sie diese Struktur, indem Sie heißen Kleber um die Kanüle und die 1,5-Millimeter-Bohrungen herum anbringen. Achten Sie darauf, den Abstandshalter nach dem Trocknen des Klebers nicht an den Rechtecken festzukleben. Setzen Sie eine 1/72-Sechskantmutter über die 1/16-Bohrung und schrauben Sie danach eine 1/72-Schraube von der gegenüberliegenden Seite der Rechtecke ein.Geben Sie kleine Mengen von Fünf-Minuten-Kleber an den Rändern der Mutter auf, um diese an dem Rechteck zu befestigen. Achten Sie darauf, dass der Kleber nicht in die Gewindegänge der Mutter oder der Schraube gelangt. Sobald der Kleber ausgehärtet ist, setzen Sie eine 1-72-Schraube in das Loch ein, das sich auf der Oberseite des Rechtecks befindet und ein Sechzehntel Zoll misst, und schrauben Sie sie in die Mutter hinein.Entfernen Sie die Modelliermasse und vergewissern Sie sich, dass der Abstandshalter durch Anziehen der Schraube fest gehalten werden kann. Das Injektor-Array-System kann praktisch an jedes Koordinatenset im Gehirn angepasst werden. Suchen Sie zunächst die Koordinaten der gewünschten Injektionsstellen in einem Gehirnatlas der interessierenden Spezies und konvertieren Sie sie in die entsprechenden Koordinaten, die von den Stereotaxiegeräten verwendet werden.In dieser Demonstration verwenden wir eine Maus, und es gibt drei Injektionsstellen und somit drei Gefäße für die Injektoren. Die X-, Y- und Z-Koordinaten entsprechen den mediale, laterale, anteriore, posteriore und bzw. ventrale Koordinaten eines Mausgehirn-Atlas. Als Nächstes platzieren Sie drei 10-Mikroliter-Hamilton-Spritzen in einer Injektions- und Entnahmespritzenpumpe, wie dieser von Harvard Apparatus, und befestigen Sie sicher drei einen Fuß langen Stücke aus Polyethylen-Schlauch an der Nadel jeder Hamilton-Spritze für jedes Stück Polyethylen-Schlauch.Schieben Sie eine F 2 52-Schlauchhülse über das offene Ende und befestigen Sie sie an einem P 6 27-Schlauchadapter unter Verwendung der P 2 35-Mutter und des P 200 fal. Um die angepasste Injektoranordnung herzustellen, verwenden Sie eine Modela-Mini-Fräse und einen Bohrer mit einem Durchmesser von 0,011 Zoll, um drei Löcher in einen 1/32 Zoll dicken PCB-Prototypen-Trägerplatinenabstand zu bohren. Die drei Löcher entsprechend den relativen X- und Y-Koordinaten der Injektionsstellen, bevor Sie die Platine von der Fräse entfernen, bohren Sie ein Rechteck um die kleinen Löcher herum, indem Sie einen Bohrer mit einem Durchmesser von 1/32 Zoll verwenden.Danach werden die einzelnen Injektoren zur Hälfte in jedes Loch eingeführt, sodass sie fest und parallel zueinander gehalten werden. Befestigen Sie sie mit Epoxidharz auf der Platine, um die Injektoranordnung zu bilden. Befestigen Sie die Injektoranordnung an der stereotaktischen Klammer.Platzieren Sie eine Ecke der Protoboard zwischen den Acrylrechtecken und ziehen Sie die Schraube der stereotaktischen Klammer fest. Danach befestigen Sie die Metallkanüle der Klammer mithilfe des Befestigungsmechanismus der Stereotaxie am Stereotaxiegerät. Die folgenden Schritte werden unter dem Mikroskop an einem der äußeren Injektoren durchgeführt, der seitlich mit einer geraden Kante angefahren werden kann, ohne mit einem der anderen Injektoren zu kollidieren.Schneiden Sie die Spitze ab, die über die Unterseite der Protoboard hinausragt. Glätten Sie die Spitze mit einem Dremel-Gerät. Wählen Sie anschließend einen stabilen Bezugspunkt innerhalb des Bereichs des stereotaktischen Arms und bewegen Sie die Injektionsanordnung, sodass die abgeflachte Spitze der äußeren Injektionsspitze an diesem Bezugspunkt liegt.Wählen Sie einen zweiten Injektor zusammen mit den entsprechenden Koordinaten aus. Bewegen Sie den Injektor-Array entlang der Z-Achse um die relative Höhendifferenz oder Z-Richtung zwischen den Koordinaten des ersten und zweiten Injektors. Kürzen Sie diesen zweiten Injektor so, dass die Spitze nun auf der Höhe des Bezugspunkts liegt, und glätten Sie sie mit einem Dremel-Werkzeug.Das Injektor-Array kann in X- und Y-Richtung bewegt werden, um den Vergleich der Injektorspitze mit dem Referenzpunkt zu erleichtern. Nachdem dieser Beschneidevorgang für die verbleibenden Injektoren wiederholt wurde, ist das Injektor-Array bereit, in das gesamte System eingebaut zu werden. Die Montage des gesamten Systems erfordert die zuvor konstruierte stereotaktische Klammer und das angepasste Injektor-Array.Nach der Sterilisation des Injektorarrays wird das hintere Ende jedes Injektors, also das nicht beschnittene Ende, in eine blaue F zwei 40 Schlauchhülse eingeführt. Mit einer P 2 35-Mutter und einer P 200-Freal wird das hintere Ende des Injektors an den Gewindeadapter befestigt, der bereits über einen Polyethylen-Schlauch mit der Hamilton-Pumpe verbunden ist. Mit einer 27-Gauge-Nadel wird steriles Silikonöl in das hintere Ende der Hamilton-Spritzen injiziert, sodass das gesamte System von den Hamilton-Spritzen bis zu den Injektorspitzen vollständig gefüllt ist.Seien Sie sehr vorsichtig, um keine Luftblasen einzuführen, da sonst das injizierte Virenvolumen falsch ist oder die Viren gar nicht injiziert werden. Wenn die Hamilton-Spritzen in der Hamilton-Pumpe ausgetauscht werden, wird das größtmögliche Volumen an Silikonöl in den Spritzen beibehalten. Falls das Experiment mehr als zwei Spritzen erfordert, können wie hier gezeigt Abstandshalter in die Hamilton-Pumpe eingesetzt werden.Alternativ kann ein Multischienen-Upgradekit von Harvard Apparatus erworben werden, um bis zu 10 Spritzen gleichzeitig aufzunehmen. Um das Virus in das Maushirn zu injizieren, verabreichen Sie zunächst analgetische Mittel gemäß Ihrem Tierversuchsprotokoll. Legen Sie die anästhetisierte Maus in den Stereotaxieapparat und überprüfen Sie durch einen Zehenquetschtest, ob das Tier ausreichend anästhesiert ist.Führen Sie dann einen einzelnen Schnitt entlang der Mittellinie der Haut von zwischen den Augen bis zwischen den Ohren durch. Ziehen Sie die Haut zurück, um den Schädel freizulegen, und entfernen Sie die Faszie. Befestigen Sie eine gezogene Glaspipette am Stereotaxiegerät.Passt die Position der Ohrstifte so lange an, bis bgma und Lambda auf gleicher Höhe liegen und die Verbindungslinie zwischen ihnen parallel zur Y-Achse des Stereotaxiegeräts verläuft. Nullt das Stereotaxiegerät, indem ihr die Spitze der Glaspipette auf bgma positioniert, und bringt die Spitze anschließend leicht oberhalb des Schädels an den X- und Y-Koordinaten einer der Injektionsstellen in Position. Bohrt mit einem Zahnarztbohrer vorsichtig den Schädel unterhalb der Spitze an, bis nur noch eine äußerst dünne Knochenlage verbleibt. Hebt mit einer Nadel der Stärke 30 Gauge vorsichtig ein winziges Stück dieser Schicht an den korrekten X- und Y-Koordinaten ab, um die Dura mater freizulegen.Dieses Loch sollte gerade groß genug sein, um einen der Injektoren auf diese Weise aufzunehmen. Kleine 0,25 Millimeter breite Löcher werden am Schädel an den x- und y-Koordinaten angefertigt, die den jeweiligen Injektionsstellen entsprechen. Nach Abschluss des Bohrens verwerfen Sie die Glasjustierpipette und befestigen die angepasste Injektoranordnung mithilfe der stereotaktischen Klammer am Stereotax. Um den Winkel des Injektorarrays korrekt einzustellen, wählen Sie zwei äußere Injektoren aus, die auf einen bestimmten Bezugspunkt kalibriert werden sollen. Nachdem einer der Injektoren mit dem Bezugspunkt übereinstimmt, berücksichtigen Sie die relativen X- und Y-Abstände zwischen den Injektionsstellen für diesen Injektor und dem anderen. Bewegen Sie das Injektorarray in X- und Y-Richtung um diese relativen Abstände. Falls der zweite Injektor nicht mit dem Bezugspunkt ausgerichtet ist, wird die Metallkanüle gelockert und gedreht.Wiederholen Sie diesen Vorgang iterativ, bis die Injektoranordnung korrekt ausgerichtet ist. Stellen Sie die Nachfüllrate der Hamilton-Pumpe auf einen Mikroliter pro Minute ein und füllen Sie die Injektoren mit Silikonöl nach, bis die Spritzen den Punkt von zwei Mikrolitern oder mehr erreichen. Dadurch wird eine Puffermenge an Öl bereitgestellt, sodass Luftblasen oder Verstopfungen an der Spitze leicht entfernt werden können, indem mit der Hamilton-Pumpe Öl vorwärts gedrückt wird, ohne das gesamte System wie zuvor beschrieben von der Rückseite der Spritzen aus erneut mit Silikonöl auffüllen zu müssen.Legen Sie ein sauberes Stück Paraform auf den Schädel und senken Sie vorsichtig die Injektoren auf das Paraform ab. Wenn pro Applikationsstelle ein Mikroliter Virus verabreicht werden soll, pipettieren Sie 1,5 Mikroliter Virus pro Stelle auf das Paraform mit derselben Nachfüllgeschwindigkeit von einem Mikroliter pro Minute. Füllen Sie jeden Injektor mit 1,2 Mikrolitern des Virus nach. Nullen Sie die Spitze des längsten Injektors an bgma und verschieben Sie dann das Injektor-Array auf die X- und Y-Koordinaten dieses Injektors. Senken Sie das Injektor-Array durch die kleinen Löcher, die mit den 30-Gauge-Nadeln gemacht wurden, um die korrekte Z-Tiefe einzustellen. Injizieren Sie ein Mikroliter Virus pro Injektor mit 0,1 Mikrolitern pro Minute oder langsamer.Lassen Sie die Injektionen 30 Minuten lang in Ruhe, damit sie sich verteilen können. Nach 30 Minuten entnehmen Sie langsam das Injektor-Array aus dem Gehirn. Stellen Sie dann die Hamilton-Pumpe so ein, dass sie mit derselben Rate von 0,1 Mikrolitern pro Minute infundiert, um eine Verstopfung jedes Injektors zu überprüfen.Anschließend reinigen Sie die Injektoren, indem Sie zwei µL Ethanol mit einer Geschwindigkeit von zwei µL pro Minute nachfüllen und infundieren. Füllen Sie die Injektoren abschließend mit Silikonöl auf, um die Pufferzone von zwei µL in jeder Hamilton-Spritze aufrechtzuerhalten. Diese Abbildung zeigt das Ergebnis der Anwendung des gerade dargestellten Injektorarrays, der aus drei Kanülen besteht, um virale Reagenzien gezielt in verteilte Bereiche des Maushirns zu bringen.In diesem Fall enth&auml;lt die genetische Last des Virus das fluoreszierende Molek&uuml;l GFP, wodurch in einem einzigen Schritt drei fluoreszierende Volumina markierter Zellen entstehen. Grunds&auml;tzlich kann eine beliebige Anzahl von Kan&uuml;len verwendet werden, um ein Virus-Injektor-Array aufzubauen. Hier ist beispielsweise ein Injektor-Array, das f&uuml;r eine beidseitige Zielregion im CA1-Bereich des Hippocampus mit 16 Injektoren geeignet ist.Mithilfe des Protokolls, das wir Ihnen heute gezeigt haben, können Sie ein Virus in einem dreidimensionalen Muster in das Gehirn einbringen und so effektiv transgene Schaltkreise erzeugen. Außerdem kann das parallele Injektor-Array verwendet werden, um jegliche flüssige Reagenzien in das Gehirn zu befördern, wodurch beispielsweise dopaminerge Agonisten gezielt in bestimmte neuronale Schaltkreise eines fixierten, verhaltensaktiven Tieres appliziert werden könnten. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.

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Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

In diesem Artikel zeigen wir eine Methode zur Glaskapillare Nadeln mit einem 50-um Lumen zu machen. Diese Technik reduziert die Schädigungen des Gehirns, minimiert passive Verbreitung von Drogen und ermöglicht eine genaue Ausrichtung in die Nager Gehirn.

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Hier präsentieren wir die intrakranielle Injektion von AAV-Vektoren für die Fluoreszenzmarkierung von Neuronen und Gliazellen in der Sehrinde.

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Quelle: Pereira, M. et. al., In vivo direkte Reprogrammierung von residenten Gliazellen in Interneuronen durch intrazerebrale Injektion viraler Vektoren. J. Vis. Exp. (2019)Dieses Video zeigt die stereotaktische Injektion eines Adeno-assoziierten Virus in die Großhirnrinde einer transgenen Maus, um Cre-abhängige neuronale Reprogrammierung und fluoreszierende Reportergene in Gliazellen zu bringen.

Stereotaktische Injektion von viralen Vektoren für die Reprogrammierung von Gliazellen in einem Mausmodell

Hier demonstrieren wir eine Technik zur weit verbreiteten neuronalen Transduktion durch intraventrikuläre Injektion von Adeno-assoziierten Viren in das neonatale Mausgehirn.  Diese Methode bietet eine schnelle und einfache Möglichkeit, eine lebenslange Expression von viral transportierten Transgenen zu erreichen.

Intracerebroventricular Viral Injektion der Neonatal Maus Gehirn für anhaltenden und verbreiteten Neuronale Transduction

Das Gehirn ist ein einzigartiger Ort mit Eigenschaften, die nicht gut durch in vitro-oder Eileiter Analysen dargestellt. Orthotopen Mausmodellen mit reproduzierbaren Lage und Wachstumseigenschaften zuverlässig mit intrakraniellen Injektionen mit einem stereotaktischen Fixierung Instrument und eine Niederdruckspritzenpumpe erzeugt werden.

Erstellen Anatomisch genaue und reproduzierbare intrakranielle Xenografts der Menschen Hirntumoren

Der CRISPR / Cas9 System bietet das Potenzial, um gezielte Genom Bearbeitung zugänglich und erschwinglich für die wissenschaftliche Gemeinschaft. Dieses Protokoll soll zeigen, wie Viren zu schaffen, die ein Gen von Interesse unter Verwendung des CRISPR / Cas9 System Knockout wird, und sie dann stereotaxically in die erwachsenen Maus Gehirn zu injizieren.

Planung, Verpackung und Lieferung von hohen Titern CRISPR Retro und Lentiviren über stereotaktische Injektion

Hier zeigen wir Magnetresonanz (MR)-geführte Konvektions-verstärkte Abgabe (CED) von viralen Vektoren in den Kortex als effizienten und vereinfachten Ansatz zur Erzielung optogenetischer Expression über große kortikale Bereiche im Makakenhirn hinweg.

Konvektion Verbesserte Lieferung von optogenetischen Adeno-assoziierten Viral vektor an den Cortex von Rhesus Macaque unter Anleitung von Online-MRT-Bildern

Hier wird ein stereotaktisches Verfahren beschrieben, das mit einem abgewinkelten koronalen Ansatz auf herausfordernde und schwer zugängliche Hirnregionen (aufgrund räumlicher Einschränkungen) abzielen kann. Dieses Protokoll ist sowohl an Maus- als auch an Rattenmodelle anpassbar und kann auf verschiedene neurowissenschaftliche Anwendungen angewendet werden, einschließlich Kanülenimplantation und Mikroinjektionen viraler Konstrukte.

Anpassbarer winkelster stereotaktischer Ansatz für vielseitige neurowissenschaftliche Techniken

Dieses Protokoll demonstriert den Einsatz einer Roboterplattform für die Mikroinjektion in einzelne neuronale Stammzellen und Neuronen in Hirnscheiben. Diese Technik ist vielseitig und bietet eine Methode zur Verfolgung von Zellen im Gewebe mit hoher räumlicher Auflösung.

Manipulation von einzelnen neuronalen Stammzellen und Neuronen in Gehirnscheiben mit Robotik-Mikroinjektion

Wie derzeit implementiert, erfordert die Optogenetik bei nichtmenschlichen Primaten die Injektion viraler Vektoren in das Gehirn. Eine optimale Injektionsmethode sollte zuverlässig sein und für viele Anwendungen in der Lage sein, einzelne Stellen beliebiger Tiefe anzuvisieren, die in der postmortalen Histologie leicht und eindeutig identifiziert werden können. Ein Injektionsverfahren mit diesen Eigenschaften wird vorgestellt.

Injektionen von AAV-Vektoren für die Optogenetik in anästhesiertem und wach verhaltendem nicht-menschlichem Primatengehirn

Miniscope in vivo Calcium-Bildgebung ist eine leistungsstarke Technik zur Untersuchung neuronaler Dynamik und Mikroschaltkreise in sich frei verhaltenden Mäusen. Dieses Protokoll beschreibt die Durchführung von Gehirnoperationen, um eine gute In-vivo-Kalziumbildgebung mit einem Miniskop zu erreichen.

Stereotaktische virale Injektion und Gradientenindex-Linsenimplantation für Deep Brain In Vivo Calcium Imaging

Erfahren Sie, wie skalierbare Fluidic Injector Arrays die parallele Viruslieferung zu komplexen neuronalen Schaltkreisen im Gehirn ermöglichen. Diese Methode erlaubt die optische Manipulation spezifischer Zelltypen in vivo.

Skalierbare Fluidic Injector Arrays für Viral Targeting von Intact 3-D Schaltkreise im Gehirn

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