Name: In-vivo-Imaging von Deep kortikalen Schichten mit einem MICROPRISMEN (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-08-27T16:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: Lernen Sie die In-vivo-Imaging-Methode mit Mikroprismen für tiefes kortikales Gewebe in Mäusen. Diese Technik ermöglicht die gleichzeitige Visualisierung aller sechs kortikalen Schichten mit hoher räumlicher Auflösung.

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Wir danken Anthony J. Koleske, PhD für die Bereitstellung der YFP Mäusen.

Teil 1: MICROPRISMEN Optik und Mikroskop-Setup <ol><li> Die Mikroprismen wir benutzen, sind 1-mm, Winkel-Prismen aus BK7 Glas aus dem Optosigma Corporation (Abbildung 1) erworben haben. Mikroprismen behandelt werden mit einer Pinzette, wenn möglich. </li><li> Die Hypotenuse des Mikroprismas ist mit erhöhter Silber beschichtet, um eine Reflektivität von mehr als 97% von 400 liefern - 2000 nm. Dies bietet interne Reflexion sowohl der Laser-Anregung Licht und die emittierte Fluoreszenz. </li><li> Mikroprismen sind immer behandelt mit einer Pinzette, wenn möglich. Handschuhe sind zu allen Zeiten getragen zu halten das Prisma sauber. </li><li> Wir verwenden eine custom-built Zwei-Photonen-Mikroskop in der Lage Kleintier-Bildgebung. Das Tier, an der stereotaktischen Gerät basiert auf einem 3-Achsen motorisierten Bühne platziert. </li><li> Das Mikroskop ist auf einem Windows-PC läuft scanimage-Software verbunden. Scanimage ist Bildaufnahmesoftware in Matlab durch Pologruto et al 1 geschrieben. </li><li> Für Mikroprismenring Bildgebung, sammeln wir Bilder mit einer Auflösung von 1024 x 1024 oder 512 x 512 Pixel. Darüber hinaus haben wir in der Regel bei 2 ms / Zeile oder 4 ms / Zeile zu scannen. </li><li> Zwei Arten von Zielen werden in den Experimenten verwendet: <ul><li> Ein niedrigerer numerischer Apertur (NA) Luft Ziel für weite Feld-of-view-Tomographie (siehe Tabelle der Reagenzien und Geräte). </li><li> Eine höhere NA Luft-Objektiv mit einem Glas Korrektur Kragen Lage Minimierung sphärischer Aberrationen durch 0 induzierte - 2 mm aus Glas (siehe Tabelle der Reagenzien und Geräte). </li></ul></li><li> Wenn das Tier bereit für die Bildgebung unter einer niedrigen Vergrößerung Ziel ist, richten Sie den quadratischen Rastern Muster des Lasers mit der Spitze des Mikroprismas. Dies wird dazu beitragen orientieren das Bild und machen die effiziente Nutzung der Laserleistung. </li><li> Mit einem höheren NA-Objektiv mit einem Glas Korrektur Kragen, setzen Sie die Korrektur Kragen für etwa 1 mm von Glas zu korrigieren. Sobald ein fluoreszierendes Bild erscheint während des Experiments kann man sorgfältig im Innern des Mikroskops zu erreichen, um die Korrektur Kragen zu optimieren, um die Bildauflösung zu optimieren. </li></ol> Teil 2: Nicht-Überleben Tiere Chirurgie und MICROPRISMEN Insertion <ol><li> Die gesamte Prozedur Länge, vom ersten Schnitt bis zum Abschluss der Bildgebung, hängt von den Zielen des Experiments. Allerdings kann die Nicht-Überleben chirurgischen Eingriff und Mikroprismenring Platzierung erwartet, dass etwa 30 nehmen - 40 Minuten dauern. </li><li> Mäuse (P30-P60) werden gewogen und anästhesiert entsprechend mit einer IP-Injektion von Ketamin (100 mg / kg) und Xylazin (10 mg / kg) auf eine Ebene, geeignet für chirurgische Eingriffe. </li><li> Während des gesamten Experiments, sollte das Tier alle 15-20 Minuten auf das Niveau der Anästhesie zu beurteilen überprüft werden. Wenn das Tier reagiert auf einen festen Fuß-und Zuziehen, eine zusätzliche Dosis von Ketamin / Xylazin ist nicht erforderlich. Typischerweise wird eine zusätzliche Dosis von einem Drittel der ursprünglichen Dosis und kann vor der Zeit in eine Spritze für den sofortigen IP Injektion vorbereitet werden, wenn nötig. </li><li> Sobald die Maus richtig betäubt, ist die Mehrheit der Haare auf dem Kopf des Tieres aus mit einem Trimmer mit einem # 40 Klinge rasiert. </li><li> Nair ® ist es, die verbleibenden Haare auf dem Kopf, zum Aufbau einer Oberfläche frei von Haaren, die im Wege des Mikroprismas während der Bildgebung bekommen kann angewendet werden. Nach 5 Minuten wird die Nair ® off ​​mit einem Wattestäbchen Wattestäbchen gereinigt. </li><li> Die narkotisierten Tier richtig in eine Maus stereotaktische Gerät platziert. Während des chirurgischen Eingriffen und Imaging-Sitzungen das Tier befindet sich auf einem mit Wasser gefüllten Heizkissen bei 36 Grad Celsius eingestellt gehalten. </li><li> Mit dem Kopf des Tieres richtig fixiert, ist eine saubere Schnitt erfolgt mit einem Skalpell auf der Mittellinie des Schädels, um die Haut zu trennen. </li><li> Eine kleine Menge von 3% Wasserstoffperoxid basiert auf einem Wattestäbchen Wattestäbchen platziert und auf den Schädel zu beseitigen Membranen zwischen dem Schädel und der Haut. </li><li> Das Wasserstoffperoxid hilft auch Bregma, ein Meilenstein in weiß, wo man die Kraniotomie durchführen und legen Sie die Mikroprismenring offenbaren. </li><li> Vor der Kraniotomie gestartet wird, werden die Ohren Bars und beißen bar richtig eingestellt, um die exponierte Schädel, so dass es im Grunde Ebene mit der Tabelle ist zu kippen. Dies bietet eine bessere Plattform für die Kraniotomie. Darüber hinaus macht das die Oberfläche des Prismas senkrecht mit dem eingehenden Anregungslicht. Dies wird dazu beitragen minimieren optische Aberrationen, während Bildgebung. </li><li> Eine kleine Zahn-Grat (~ 0,8 mm Kopfgröße) wird an einen Dremel ®-Tool mit Hilfe eines flexiblen Ausleger verbunden. Für Kraniotomien, setzen wir die Geschwindigkeit auf etwa 7.000 bis 10.000 rpms. </li><li> Die zahnärztliche Grat entlang des Schädels Magermilch, bis eine viereckige Nut in den Knochen hergestellt wird. Die Seiten des Quadrats sind ca. 2-3 mm in der Länge und zentriert 1,5 mm caudal und 1 mm lateral Bregma. </li><li> Continuing Ausdünnung der Knochen, bis eine kleine Öffnung durch den Schädel gemacht wird. Eine Pinzette ca.n Heben Sie den Knochendeckel vom Schädel. </li><li> Die Dura muss entfernt werden, bevor die Mikroprismen in die Rinde eingesetzt werden kann. Blutungen sind am besten, indem man das Blut an der Oberfläche für einige Minuten gerinnen gesteuert. Danach wird das geronnene Blut entfernt mit einem chirurgischen Schwamm vor dem Einsetzen der Mikroprismenring. </li><li> Um sie für die Unterstützung der Ausrichtung des Prismas mit der Hirnrinde, ist die vertikale Fläche des Mikroprismas up parallel an den Griffen an der Zange gefüttert. </li><li> Mit dem Prisma richtig gehalten wird, ist die gesamte Mikroprismenring eingeführt, bis die Spitze des Prismas ist bündig mit der Oberfläche Neokortex. </li><li> Wenn richtig eingesetzt, sollte die Mikroprismen in die richtige Position zu bleiben. Jede Blutung, die Ergebnisse ist minimal und kann mit einem kleinen chirurgischen Schwamm aufgenommen werden. Sobald das Prisma anstelle des Tieres ist bereit für die Bildgebung. </li><li> Nach einer Mikroprismenring hat in einem Tier verwendet wurde, kann es sein, mehrere Male wieder verwendet werden. Allerdings braucht es für richtig gereinigt werden, um alle verbleibenden biologischen Material zu entfernen. Dies kann durch Eintauchen des Prismas in einem kleinen Volumen HCl Säure, durch einen Sprung in Methanol erreicht werden. Das gereinigte Mikroprismenring können dann in der Linse Papier bis die zukünftige Verwendung gewickelt werden. </li></ol> Teil 3: Repräsentative Ergebnisse <img src="/files/ftp_upload/1509/1509fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1: Die Bilder des rechten Winkels Mikroprismenring. Prismen in diesem Experiment verwendet werden einen Millimeter, BK7 Glasprismen mit einer verbesserten Silberschicht auf der Hypotenuse die interne Reflexion der Anregungs-und Emissions Licht zu ermöglichen. <img src="/files/ftp_upload/1509/1509fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2: Bild der Schicht V YFP Pyramidenneuronen. Weitfeld-of-view-Bildgebung mit der Mikroprismenring zeigt eine große Population von pyramidenförmigen Zellkörper ~ 800 bis 900 um tief aus der kortikalen Oberfläche. Darüber hinaus apikalen Dendriten sich bis zur Schicht kann ich auch gelöst werden. Maßstab = 200 um. <img src="/files/ftp_upload/1509/1509fig3.jpg" alt="Abbildung 3" /> Abbildung 3: Eine höhere numerische Apertur Ziel in Verbindung mit dem Mikroprismenring bietet räumliche Auflösung ausreicht, um dendritischen Dornen auf der apikalen Dendriten auf der Schicht V Pyramidenneuronen lösen verwendet. Balken = 10 um. <img src="/files/ftp_upload/1509/1509fig4.jpg" alt="Abbildung 4" /> Abbildung 4: Ein Bild unter Verwendung des Mikroprismenring und einen Schwanz-Injektion von Fluoreszenzfarbstoff. Das Bild zeigt vertikale, großkalibrige Gefäße, die sich von tiefen Hirnregionen und kleineren Kapillaren abzweigen durch die kortikale Volumen. Maßstab = 200 um. <img src="/files/ftp_upload/1509/1509fig5.jpg" alt="Abbildung 5" /> Abbildung 5: Mit einer höheren numerischen Apertur Ziel, kann das Netzwerk von Kapillaren in den Neocortex mit detaillierter abgebildet werden. Balken = 50 um. <img src="/files/ftp_upload/1509/1509fig6.jpg" alt="Abbildung 6" /> Abbildung 6: Mikroprismen ermöglicht auch für die Bildgebung roten Blutkörperchen (Erythrozyten) fließen durch die Gefäße. Erythrozyten nicht absorbieren den Fluoreszenzfarbstoff und werden daher als dunkle Streifen auf dem Schiff gesehen. Durch Online-Scannen über das Schiff, bekommt man Messungen von RBC Fluss und die Geschwindigkeit. Balken = 10 um (horizontaler Balken oben und unten, Bild) und 250 ms (vertikaler Strich in Bild unten).

<ol><li>Pologruto, T. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ScanImage%3A+flexible+software+for+operating+laser+scanning+microscopes%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Eng+Online%22%5BJournal%5D)">ScanImage: flexible software for operating laser scanning microscopes.</a> Biomed Eng Online. 2, 13-13 (2003).</li>
<li>Feng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. 28 (1), 41-41 (2000).</li>
<li>Kleinfeld, D., Mitra, P. P., Helmchen, F., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluctuations+and+stimulus-induced+changes+in+blood+flow+observed+in+individual+capillaries+in+layers+2+through+4+of+rat+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Fluctuations and stimulus-induced changes in blood flow observed in individual capillaries in layers 2 through 4 of rat neocortex.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (26), 15741-15741 (1998).</li>
</ol>

Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien und Vorschriften her von der Yale University IACUC gesetzt durchgeführt.

Mit einem Mikroprismenring in einem bildgebenden Experiment ist relativ einfach und bietet viele Vorteile für in-vivo-Studien auf dem Neocortex. Repräsentative Beispiele mit dieser Technik gehören Bilder von transgenen Mäusen, die gelb fluoreszierenden Proteins in Schicht V kortikalen Neuronen übernommen. Mit Mikroprismen kann man sehen, eine Sammlung von großen Pyramidenzellen Zellkörper in Schicht V, fast 1 mm unterhalb der kortikalen Oberfläche. Ebenfalls zu sehen sind die apikalen Dendriten, dass durch all die oberf...

<table><tbody><tr><td>Mit verbesserter silberner reflektierender Beschichtung-(R77)</td><td>OptoSigma Corp. (Santa Ana, CA)</td><td>055-0010</td><td>Mit verbesserter silberner reflektierender Beschichtung-(R77)</td></tr><tr><td>Fluorescein-Dextran</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>FD70</td><td>70 kDa </td></tr><tr><td>0,28 NA, 4x-Luftobjektiv</td><td>Olympus Corporation</td><td>XLFLUOR 4x/340</td><td></td></tr><tr><td>0,60 NA, 40x-Luftobjektiv</td><td>Olympus Corporation</td><td>LUCPLFLN</td><td>Mit 0–2 mm Deckglas-Korrektur</td></tr></tbody></table>

in-vivo-imaging von deep kortikalen schichten mit einem microprismen

In vivo Imaging of Deep Cortical Layers using a Microprism

Wir präsentieren ein Protokoll für die in-vivo-Bildgebung der kortikalen Gewebe mit einem tiefen bildgebenden Sonde in der Form eines Mikroprismenring. Mikroprismen sind 1-mm groß und haben eine reflektierende Beschichtung auf der Hypotenuse die interne Reflexion der Anregungs-und Emissions Licht zu ermöglichen. Die Mikroprismen Sonde gleichzeitig Bilder multiple kortikale Schichten mit einer Perspektive in der Regel nur in Scheiben Vorbereitungen gesehen. Die Bilder werden mit einem großen gesammelt field-of-view (~ 900 um). Darüber hinaus bieten wir Informationen über die Nicht-Überleben chirurgischen Eingriff und Mikroskop-Setup. Repräsentative Ergebnisse sind Bilder von Schicht V Pyramidenneuronen von Thy-1 YFP-H-Mäuse zeigen ihre apikalen Dendriten, die sich durch die oberflächliche Rindenschicht und sich in Büscheln. Resolution war ausreichend, um Bild dendritischen Dornen in der Nähe des Soma der Schicht V Neuronen. Ein tail-Injektion von Fluoreszenzfarbstoff zeigt die komplizierte Netzwerk von Blutgefäßen in der Hirnrinde. Line-Scan von roten Blutkörperchen (Erythrozyten) fließt durch die Kapillaren zeigt RBC Geschwindigkeit und Flussraten erreicht werden kann. Dieser Roman Mikroprismenring Sonde ist ein elegantes und dennoch leistungsfähige neue Methode zur Visualisierung tiefe Zellstrukturen und kortikale Funktion in vivo.

Rechtwinklige Mikroprismen in die Maus gesteckt Neokortex ermöglicht tiefe Bildgebung von mehreren kortikalen Schichten mit einer Sicht in der Regel in Scheiben gefunden. Ein-Millimeter-Mikroprismen bieten ein weites Feld-of-view (~ 900 um) und räumliche Auflösungen ausreichen, um dendritischen Dornen zu lösen. Wir zeigen, Schicht V neuronalen Bildgebung und Neokortex Gefäßdarstellung mit Mikroprismen.

In-vivo-Imaging von Deep kortikalen Schichten mit einem MICROPRISMEN

Wir präsentieren ein Protokoll für die In-vivo-Bildgebung von kortikalem Gewebe unter Verwendung einer Deep-Brain-Imaging-Sonde in Form eines Mikroprismas. Mikroprismen haben eine Größe von 1 mm ...

Die Techniken der Fluoreszenzmikroskopie haben eine begrenzte Fähigkeit, Strukturen tief im Gewebe abzubilden, insbesondere in stark lichtstreuenden Materialien wie Gehirngewebe. Selbst bei der Zwei-Photonen-Mikroskopie kann es sehr schwierig sein, hochwertige In-vivo-Aufnahmen von neuronalen Strukturen anzufertigen, die tiefer als 500 Mikrometer unterhalb der Oberfläche der Neokortex liegen. Hier zeigt die grüne Linie eine Tiefe von 500 Mikrometer an.Im Allgemeinen liegen die neokortikalen Schichten vier, fünf und sechs mehr als 500 Mikrometer unterhalb der Oberfläche. Wir zeigen, wie ein ein Millimeter langer gläserner Mikroprisma, der in den Neokortex eingeführt wird, Licht in die oberflächlichen und tiefen kortikalen Schichten hinein- und aus ihnen herausleiten kann. Mithilfe dieser Technik ist es bei einer Maus möglich, ein ein Millimeter großes Sichtfeld zu erzielen und alle sechs kortikalen Schichten gleichzeitig aus einer Bildgebungsansicht zu visualisieren, die gewöhnlich nur in geschnittenem Hirngewebe zu finden ist.Mikroprismen bieten ein weites Sichtfeld, das es ermöglicht, die Zellkörper der parametralen Schicht Fünf mit ihren langen apikalen Dendriten sowie das komplexe Netzwerk der Blutgefäße im Neokortex abzubilden, und bewahren dabei eine räumliche Auflösung, die ausreicht, um dendritische Dornen und den Durchfluss roter Blutkörperchen durch Mikrokapseln aufzulösen. Mein Name ist Thomas Chia, und ich bin Doktorand im Labor von Professor Michael Levine an der Abteilung für Biomedizinische Technik der Yale University. Der Protokollablauf, den wir in diesem Video besprechen werden, beschreibt die Verwendung von ein Millimeter großen rechteckigen Glas-Mikroprismen, um Fluoreszenzbilder von Strukturen in einer Tiefe von einem Millimeter im Neokortex einer Maus zu erzeugen.Die verwendeten Mikroprismen sind ein Millimeter große Prisma mit rechtem Winkel, hergestellt aus BK7-Glas, das von der Firma Opto Sigma Corporation bezogen wurde. Mikroprismen werden nach Möglichkeit mit einer Pinzette gehandhabt. Die Hypotenuse des Mikroprismas ist mit einer verbesserten Silberschicht beschichtet, die eine Reflektivität von mehr als 97 % im Bereich von 400 bis 2000 Nanometern gewährleistet.Dadurch wird sowohl das Laseranregungslicht als auch die zugelassene Fluoreszenz intern reflektiert. Wir verwenden ein speziell angefertigtes Zweiphotonenmikroskop, das zur Bildgebung an kleinen Tieren in der Lage ist. Das Tier, das an einer stereotaktischen Vorrichtung befestigt ist, wird auf eine motorisierte Dreiaxen-Probenebene platziert.Das Mikroskop ist mit einem Windows-PC verbunden, auf dem die Software Scan Image läuft. Scan Image ist eine in MATLAB von Polo Gudo et al. geschriebene Software zur Bildaufnahme. Für die Mikroprismen-Aufnahmen sammeln wir Bilder mit einer Auflösung von 1024 × 1024 oder 512 × 512 Pixeln.Zusätzlich scannen wir typischerweise mit zwei Millisekunden pro Zeile oder vier Millisekunden pro Zeile. Ein wichtiger Aspekt dieses Protokolls ist die Art der Mikroskopobjektive, die in Verbindung mit den Mikroprismen verwendet werden. In den Experimenten kommen zwei Arten von Objektiven zum Einsatz.Das linke Objektiv ist ein Luftobjektiv mit niedriger numerischer Apertur für die Abbildung großer Bildfelder, in diesem Fall ein vierfach 0,28 NA Olympus-Objektiv. Das rechte Objektiv ist ein 40-fach 0,60 NA Luftobjektiv mit einem Glas-Korrekturkragen, der in der Lage ist, sphärische Aberrationen, die durch null bis zwei Millimeter Glas verursacht werden, zu minimieren. Um die Maus auf die Operation und die Implantation des Mikroprismas vorzubereiten, ist der erste Schritt, das Tier angemessen für chirurgische Eingriffe zu narkotisieren.Zunächst wird das Körpergewicht des Tieres gemäß der etablierten Dosierung erfasst. Eine geeignete Menge eines Ketamin-Xylazin-Cocktails wird in eine Spritze aufgezogen. Die anästhetischen Wirkstoffe werden mittels einer intraperitonealen Injektion mit einer 28-Gauge-Nadel verabreicht.Sobald sich die Maus in einer für chirurgische Eingriffe geeigneten Narkosetiefe befindet, wird der Großteil des Haares auf dem Kopf des Tieres mit einem Rasierapparat und einer Klinge der Größe 40 abrasiert. Anschließend wird Naar auf die verbliebenen Haare am Kopf aufgetragen, um eine haarfreie Oberfläche zu schaffen, die sicherstellt, dass keine Haare die Mikroprisma-Bildgebung stören. Während der Bildgebung wird nach fünf Minuten das Naar mit einem Wattestäbchen entfernt, und das anästhesierte Tier wird korrekt in eine stereotaktische Halterung für Mäuse eingespannt.Während der chirurgischen Eingriffe und Bildgebungssitzungen wird das Tier auf einer mit Wasser gefüllten Heizplatte gehalten, die auf 36 Grad Celsius eingestellt ist. Bei fest fixiertem Tierkopf wird ein sauberer Schnitt entlang der Mittellinie des Schädels durchgeführt. Um die Haut zu lösen, wird eine kleine Menge 3%igem Wasserstoffperoxid auf einen Wattestäbchen aufgetragen und auf den Schädel aufgebracht, um Membranen zwischen Schädel und Haut zu entfernen.Das Wasserstoffperoxid hilft ebenfalls, die BMA freizulegen, einen wichtigen Orientierungspunkt dafür, wo die Kraniotomie durchgeführt und das Mikroprisma eingesetzt werden soll. Vor Beginn der Kraniotomie werden die Ohrstifte und der Beißenhalter sorgfältig justiert, um den freigelegten Schädel so zu neigen, dass er im Wesentlichen bündig mit der Tischfläche abschließt. Dies schafft eine bessere Arbeitsgrundlage für die Kraniotomie.Ein kleiner Zahnarztbohrer wird für Kraniotomien an ein Dremel-Gerät angeschlossen. Wir stellen die Drehzahl auf etwa 7.000 bis 10.000 U/min ein. Der Zahnarztbohrer wird entlang des Schädels geführt, bis eine quadratische Nut im Knochen entsteht.Die Seiten des Quadrats sind ungef&auml;hr zwei bis drei Millimeter lang und zentriert. 1,5 Millimeter k&ouml;cheln und einen Millimeter lateral entfernen, w&auml;hrend man den Knochen weiter abschliff, bis eine kleine &Ouml;ffnung durch den Sch&auml;del entsteht. Eine Pinzette kann die Knochenlamelle anheben.Die Dura muss entfernt werden, bevor das Mikroprisma in den Cortex eingeführt werden kann. Blutungen werden am besten dadurch kontrolliert, dass man das Blut mehrere Minuten lang an der Oberfläche gerinnen lässt. Anschließend wird das geronnene Blut mit einem chirurgischen Schwamm entfernt, um die Ausrichtung des Prismas am Cortex zu erleichtern.Die vertikale Fläche des Mikroprismas wird parallel zu den Griffen der Pinzette ausgerichtet. Wenn das Prisma richtig gehalten wird, wird das gesamte Mikroprisma so eingeführt, bis die Oberseite des Prismas bündig mit der Oberfläche des Neokortex abschließt. Hier sehen wir das Prisma im Neokortex ruhend.Wenn der Mikroprisma korrekt eingesetzt ist, sollte er in der richtigen Position verbleiben. Eventuelle Blutungen sind minimal und können mit einem kleinen chirurgischen Schwamm absorbiert werden. Sobald der Prisma an Ort und Stelle ist, ist das Tier bereit für die Bildgebung mit dem Tier.Unter einem Objektiv mit niedriger Vergr&ouml;&szlig;erung kann man das Laserrastern &uuml;ber dem Mikroprisma auf der Oberfl&auml;che des Gehirns beobachten. Hier sind einige repr&auml;sentative Beispiele von Bildern, die von transgenen M&auml;usen stammen, die gelbes fluoreszierendes Protein exprimieren. In kortikalen Neuronen der Schicht f&uuml;nf unter Verwendung von Mikroprismen sind eine Ansammlung gro&szlig;er parapontiner Zellk&ouml;rper in Schicht f&uuml;nf, nahezu einen Millimeter unterhalb der kortikalen Oberfl&auml;che, sichtbar.Auch zu sehen sind die apikalen Dendriten, die sich durch alle oberflächlichen Schichten erstrecken, bevor sie sich in Büschel aufteilen. Mit einem Objektiv mit hoher numerischer Apertur und Glaskorrekturkragen ist es möglich, in diesem Fall die dendritischen Dornen aufzulösen. An den apikalen Dendriten der parametralen Neurone der Schicht fünf handelt es sich bei den dendritischen Dornen um submikronale Strukturen, von denen mehrere im Bild mit gelben Pfeilspitzen markiert sind. Man kann die kortikalen Blutgefäße auch mit einem fluoreszierenden Farbstoff wie Fluorescein-Dextran mithilfe etablierter Injektionstechniken in die Schwanzvene markieren.Mit dieser Technik lassen sich die größeren Gefäße aus tieferen Schichten verfolgen, die sich in Richtung der PIA erstrecken und verzweigen, um das Netzwerk der Mikrokapseln zu bilden. Dieses empfindliche Netzwerk aus Mikrokapseln im Neokortex wird am besten mit einem Objektiv mit hoher numerischer Apertur dargestellt. Außerdem ist es möglich, die Geschwindigkeit und den Fluss von roten Blutkörperchen in tiefen neokortikalen Kapillaren mittels Linienscanning zu messen.Die rote Linie zeigt das Zeilen-Scannen-Muster auf dem Kapillarbild durch das Mikroprisma an. Da rote Blutkörperchen den fluoreszierenden Farbstoff nicht aufnehmen, erscheinen sie als dunkle Streifen. Das untere Bild ist das Ergebnis eines Zeilenscans mit einer räumlichen Dimension in einem AE und einer zeitlichen Dimension in der anderen.AEs aus diesem können den Fluss und die Geschwindigkeit von roten Blutkörperchen durch das Kapillargefäß berechnen. Nachdem ein Mikroprisma an einem Tier verwendet wurde, kann es mehrmals wiederverwendet werden. Es muss jedoch ordnungsgemäß gereinigt werden, um verbliebene biologische Materialien zu entfernen.Dies kann erreicht werden, indem das Prisma in eine kleine Menge Salzsäure getaucht und anschließend in Methanol eingetaucht wird. Das gereinigte Mikroprisma kann dann bis zur weiteren Verwendung in Objektivpapier eingewickelt werden. Damit ist unser Protokoll zur Verwendung von Mikroprismen für die in-vivo-Kortexbildgebung bei Mäusen abgeschlossen.Die Verwendung von Mikroprismen in einem Bildgebungsversuch ist relativ unkompliziert und bietet zahlreiche Vorteile für In-vivo-Studien der Neokortex. Wir hoffen, dass Sie diese Technik als interessant empfunden haben und sie zukünftig in Ihrem Labor anwenden können. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg.

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Forschung

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Biology

Biologie

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