In-vivo-Imaging von Deep kortikalen Schichten mit einem MICROPRISMEN

Rechtwinklige Mikroprismen in die Maus gesteckt Neokortex ermöglicht tiefe Bildgebung von mehreren kortikalen Schichten mit einer Sicht in der Regel in Scheiben gefunden. Ein-Millimeter-Mikroprismen bieten ein weites Feld-of-view (~ 900 um) und räumliche Auflösungen ausreichen, um dendritischen Dornen zu lösen. Wir zeigen, Schicht V neuronalen Bildgebung und Neokortex Gefäßdarstellung mit Mikroprismen.

Fluoreszenzmikroskopie-Techniken sind nur begrenzt in der Lage, Strukturen tief im Gewebe abzubilden, insbesondere in stark lichtstreuenden Materialien wie Hirngewebe. Selbst bei der Zwei-Photonen-Mikroskopie kann es sehr schwierig sein, qualitativ hochwertige In-vivo-Bilder von neuronalen Strukturen zu erstellen, die tiefer als 500 Mikrometer von der neokortikalen Oberfläche entfernt sind. Hier zeigt die grüne Linie eine Tiefe von 500 Mikrometern an.

Im Allgemeinen sind die neokortikalen Schichten vier, fünf und sechs mehr als 500 Mikrometer von der Oberfläche entfernt. Wir werden zeigen, wie ein ein ein Millimeter großes Mikroprisma aus Glas, das in den Neokortex eingeführt wird, Licht in und aus oberflächlichen und tiefen kortikalen Schichten leiten kann. Mit dieser Technik in einer Maus ist es möglich, ein Sichtfeld von einem Millimeter zu haben und alle sechs kortikalen Schichten gleichzeitig aus einer bildgebenden Perspektive zu visualisieren, die normalerweise nur in geschnittenem Hirngewebe zu finden ist.

Mikroprismen bieten ein weites Sichtfeld, das in der Lage ist, die Parametall-Zellkörper der fünften Schicht mit ihren langen apikalen Dendriten und dem komplexen Netzwerk von Blutgefäßen im Neokortex zu visualisieren, während gleichzeitig räumliche Auflösungen beibehalten werden, die in der Lage sind, dendritische Stacheln und den Fluss roter Blutkörperchen durch Mikrokapillaren aufzulösen. Mein Name ist Thomas Chia und ich bin Doktorand im Labor von Professor Michael Levine am Department of Biomedical Engineering der Yale University. Das Protokoll, das wir in diesem Video besprechen werden, befasst sich mit der Verwendung von einem Millimeter rechtwinkligen Glasmikroprismen zur Erzeugung von Fluoreszenzbildern von Strukturen in einer Tiefe von einem Millimeter in einem Neokortex der Maus.

Bei den von uns verwendeten Mikroprismen handelt es sich um einen Millimeter rechtwinklige Prismen aus BK Seven Glas, das von der Opto Sigma Corporation gekauft wurde. Mikroprismen werden nach Möglichkeit mit einer Pinzette gehandhabt. Die Hypotenuse des Mikroprismas ist mit verbessertem Silber beschichtet, um ein Reflexionsvermögen von mehr als 97 % von 400 bis 2000 Nanometern zu erreichen.

Dies sorgt für eine interne Reflexion sowohl des Laseranregungslichts als auch der zugelassenen Fluoreszenz. Wir verwenden ein speziell angefertigtes Zwei-Photonen-Mikroskop, das für die Bildgebung von Kleintieren geeignet ist. Das Tier, das an einem stereotaktischen Gerät befestigt ist, wird auf einen dreiachsigen motorisierten Tisch gestellt.

Das Mikroskop ist mit einem Windows-PC verbunden, auf dem das Scanbild ausgeführt wird. Software Scan Image ist eine Bilderfassungssoftware, die von Polo Gudo et al. in MATLAB geschrieben wurde. Für die Mikroprismen-Bildgebung sammeln wir Bilder mit einer Auflösung von 10 24 x 10 24 oder fünf 12 x fünf 12 Pixeln.

Darüber hinaus scannen wir in der Regel mit zwei Millisekunden pro Zeile oder vier Millisekunden pro Zeile. Ein wichtiger Aspekt dieses Protokolls ist die Art der Mikroskopobjektive, die in Verbindung mit den Mikroprismen verwendet werden. In den Experimenten werden zwei Arten von Objektiven verwendet.

Das Objektiv auf der linken Seite ist ein Luftobjektiv mit niedriger numerischer Apertur für die Bildgebung mit weiten Sichtfeldern, in diesem Fall ein Olympus-Objektiv mit vier x 0,28 NA. Das Objektiv auf der rechten Seite ist ein 40 x 0,60 hohes NA-Luftobjektiv mit einem Glaskorrekturkragen, der in der Lage ist, sphärische Aberrationen zu minimieren, die durch null bis zwei Millimeter Glas induziert werden. Um die Maus auf die Operation und das Einsetzen des Mikroprismas vorzubereiten, besteht der erste Schritt darin, das Tier richtig zu betäuben, und zwar auf ein Niveau, das für chirurgische Eingriffe geeignet ist.

Zunächst wird das Gewicht des Tieres auf der Grundlage der festgelegten Dosierung erfasst. Ein entsprechendes Volumen eines Ketamin-Xylazin-Cocktails wird in eine Spritze gezogen. Die Anästhetika werden durch eine IP-Injektion mit einer 28-Gauge-Nadel verabreicht.

Sobald sich die Maus in einer für chirurgische Eingriffe geeigneten Anästhesieebene befindet, wird der Großteil der Haare auf dem Kopf des Tieres mit einem Tremor mit einer Klinge der Nummer 40 abrasiert. Dann wird Nare auf die verbleibenden Haare auf dem Kopf aufgetragen, um eine Oberfläche zu schaffen, die frei von Haaren ist, die dem Mikroprisma im Weg stehen könnten. Während der Bildgebung, nach fünf Minuten, wird die NA mit einem Wattestäbchen gereinigt und das betäubte Tier ordnungsgemäß in ein stereotaktisches Mausgerät gelegt.

Während der chirurgischen Eingriffe und der bildgebenden Verfahren wird das Tier auf einem mit Wasser gefüllten Heizkissen gehalten, das auf 36 Grad Celsius eingestellt ist. Wenn der Kopf des Tieres richtig fixiert ist, wird ein sauberer Schnitt entlang der medialen Linie des Schädels gemacht. Um die Haut zu trennen, wird eine kleine Menge 3%Wasserstoffperoxid auf ein Wattestäbchen gegeben und auf den Schädel aufgetragen, um die Membranen zwischen dem Schädel und der Haut zu entfernen.

Das Wasserstoffperoxid hilft auch dabei, BMA zu entlarven, ein wichtiger Meilenstein, wenn es darum geht, zu wissen, wo die Kraniotomie durchgeführt und das Mikroprisma eingeführt werden muss. Bevor mit der Kraniotomie begonnen wird, werden die Ohrbügel und die Beißstange richtig eingestellt, um den freiliegenden Schädel so zu kippen, dass er im Grunde auf gleicher Höhe mit dem Tisch ist. Dies bietet eine bessere Plattform für die Kraniotomie.

Ein kleiner Zahnfräser ist mit einem Dremel-Werkzeug für die Kraniotomie verbunden. Wir stellen die Drehzahl auf ca. 7.000 bis 10.000 U/min ein. Der Zahngrat wird entlang des Schädels geglitten, bis sich eine quadratische Rille im Knochen gebildet hat.

Die Seiten des Quadrats sind etwa zwei bis drei Millimeter lang und zentriert. 1,5 Millimeter verhätscheln und ein Millimeter seitliches Rema dünnen den Knochen weiter aus, bis eine kleine Öffnung durch den Schädel entsteht. Eine Pinzette kann den Knochenlappen anheben.

Die Dura muss entfernt werden, bevor das Mikroprisma in den Kortex eingeführt werden kann. Blutungen lassen sich am besten kontrollieren, indem man das Blut mehrere Minuten lang an der Oberfläche gerinnen lässt. Anschließend wird das koagulierte Blut mit einem chirurgischen Schwamm entfernt, um die Ausrichtung des Prismas auf den Kortex zu unterstützen.

Die vertikale Fläche des Mikroprismas ist parallel zu den Griffen an der Pinzette ausgerichtet. Wenn das Prisma richtig gehalten ist, wird das gesamte Mikroprisma eingesetzt, bis die Oberseite des Prismas bündig mit der neokortikalen Oberfläche abschließt. Hier sehen wir das Prisma, das im Neokortex ruht.

Bei korrektem Einsetzen sollte das Mikroprisma in der richtigen Position bleiben. Die daraus resultierende Blutung ist minimal und kann mit einem kleinen chirurgischen Schwamm aufgefangen werden. Sobald das Prisma an Ort und Stelle ist, ist das Tier bereit für die Bildgebung mit dem Tier.

Unter einem Objektiv mit geringer Vergrößerung kann man sehen, wie das Laserraster über das Mikroprisma auf der Oberfläche des Gehirns scannt. Hier sind einige repräsentative Beispiele für Bilder von transgenen Mäusen, die gelb fluoreszierendes Protein exprimieren. In den kortikalen Neuronen der fünften Schicht mit Mikroprismen kann man eine Ansammlung großer Parametall-Zellkörper in Schicht fünf sehen, fast einen Millimeter unter der kortikalen Oberfläche.

Zu sehen sind auch die apikalen Dendriten, die sich durch alle oberflächlichen Schichten erstrecken, bevor sie mit Hilfe eines Objektivs mit hoher numerischer Apertur in Tufts zerfallen. Mit dem Glaskorrekturkragen ist es in diesem Fall möglich, dendritische Stacheln aufzulösen. Auf den apikalen Dendriten der Parametall-Neuronen der fünften Schicht sind dendritische Dornen Submikron-Strukturen, und einige sind im Bild mit gelben Pfeilspitzen gekennzeichnet. Man kann die kortikalen Blutgefäße auch mit einem Fluoreszenzfarbstoff, wie z. B. Fluorescein-Dextran, unter Verwendung etablierter Schwanzvenen-Injektionstechniken markieren.

Mit dieser Technik kann man sehen, wie sich die großkalibrigen Gefäße aus tiefen Schichten in Richtung PIA erstrecken und sich verzweigen, um das Netzwerk der Mikrokapillaren zu bilden. Dieses empfindliche Netzwerk von Mikrokapillaren im Neokortex lässt sich am besten mit einem Objektiv mit hoher numerischer Apertur erkennen. Darüber hinaus ist es möglich, die Geschwindigkeit und den Fluss der roten Blutkörperchen aus tiefen neokortikalen Kapillaren durch Zeilenabtastung zu messen.

Die rote Linie zeigt das Zeilenabtastmuster auf dem Kapillarbild durch das Mikroprisma. Da rote Blutkörperchen den Fluoreszenzfarbstoff nicht aufnehmen, erscheinen sie als dunkle Streifen. Das Bild unten ist das Ergebnis eines Zeilenscan mit einer räumlichen Dimension in einem AEs und einer zeitlichen Dimension in dem anderen.

Daraus kann man den Fluss und die Geschwindigkeit der roten Blutkörperchen durch die Kapillare berechnen. Nachdem ein Mikroprisma bei einem Tier verwendet wurde, kann es mehrmals wiederverwendet werden. Es muss jedoch ordnungsgemäß gereinigt werden, um biologisches Material zu entfernen.

Dies kann erreicht werden, indem das Prisma in ein kleines Volumen Salzsäure getaucht wird, gefolgt von einem Eintauchen in Methanol. Das saubere Mikroprisma kann dann in Linsenpapier eingewickelt werden, bis es zum Einsatz kommt. Damit ist unser Protokoll zur Verwendung von Mikroprismen für die kortikale Bildgebung in vivo bei Mäusen abgeschlossen.

Die Verwendung von Mikroprismen in einem bildgebenden Experiment ist relativ einfach und bietet viele Vorteile, wenn es um In-vivo-Studien am Neokortex geht. Wir hoffen, dass Sie festgestellt haben, dass dies eine interessante Technik ist, die Sie in Zukunft in Ihrem Labor einsetzen können. Danke fürs Zuschauen und viel Glück.