Name: Eine quantitative Bewertung der Hefe Lipidome mit Elektrospray-Ionisation-Massenspektrometrie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-08-21T12:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 43 s
Description: Lernen Sie eine quantitative Lipidanalyse in Hefe mittels Elektrospray-Ionisations-Massenspektrometrie. Diese Methode ermöglicht schnelle Identifizierung und Quantifizierung zahlreicher Lipidspezies mit hoher Sensitivität.

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Wir sind dankbar, dass Alain Tessier für wertvolle Beratung, Diskussionen und technische Unterstützung. Wir erkennen das Zentrum für Biologische Anwendungen der Massenspektrometrie an der Concordia University für herausragende Leistungen. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus dem CIHR und der NSERC of Canada unterstützt. VIT ist ein CIHR New Investigator und Concordia University Research Chair in Genomics, Cell Biology and Aging.

Material und Methoden <ol><li> Hefestämme und Wachstumsbedingungen Der Wildtypstamm BY4742 (MATα his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0) wurde in den reichen YEPD Medium (1% Hefeextrakt, 2% Pepton, 2% Glucose). Die Zellen wurden bei 30 ° C mit Rotations-Schütteln bei 200 rpm in Erlenmeyer-Kolben bei einer &quot;Flasche Volumen / Medium Volume&quot;-Verhältnis von 5:1 kultiviert. </li><li> Lagerung von Hefezellen zur Lipidextraktion <ol><li> Eine 50 ml Kultur von Zellen wurde durch Zentrifugation bei 3000 xg für 5 Minuten geerntet. </li><li> Zweimal mit kaltem Wasser. <ol style=" list-style-type:lower-alpha;"><li> Pellet in 25 ml eiskaltem Wasser </li><li> Pellet-Zellen in der Zentrifuge bei 3000 xg für 5 Minuten </li></ol></li><li> Das Pellet und Transfer zum Eppendorf-Röhrchen </li><li> Pellet durch Zentrifugation, 16.000 xg für 2 Minuten, Überstand entfernen und frieren bei -80 ° C bis zur Verwendung. (Wir verwenden ein Becherglas mit Isopropylalkohol gehalten in dem -80 Gefrierschrank, flüssigem Stickstoff können ebenfalls verwendet werden) </li></ol></li><li> Reagenzien Biotech grade Chloroform und Methanol wurden von Sigma-Aldrich. Freie Fettsäuren und Triglyzeriden wurden aus Larodan (Malmö, Schweden) bezogen. Verschiedene Arten von Phospholipiden - einschließlich Phosphatidylcholin, Phosphatidylethanolamin, Phosphatidylinositol, Phosphatidylserin, Phosphatidsäure und Cardiolipine - wurden von Avanti Polar Lipid (Alabaster, AL, USA) erhalten. High-Speed-Glas-Zentrifugenröhrchen mit Teflon ausgekleideten Kappen wurden von Fisher. </li></ol> Lipidextraktion Dies ist eine Modifikation des Protokolls durch Bligh und Dyer 8 beschrieben. Alle Manipulationen mit extrahierten Lipide sollte mit Glas Pipetten oder Spritzen werden; Kunststoffen eine große Hintergrund-Signal zu erzeugen, wenn sie in Kontakt mit Chloroform zu kommen. Die genauen Mengen sind nicht kritisch, solange die Verhältnisse der 1:2:0.8 für Chloroform - Methanol - H 2 O in Schritt 3 und 2:2:1.8 für Chloroform - Methanol - H 2 O in Schritt 7 konserviert sind. <ol><li> Resuspendieren gefrorenen Zellen in 1,6 ml eiskaltem destilliertem H 2 O. </li><li> Übertragen 1,6 ml der Zellsuspension zu High-Speed-Glas-Zentrifugenröhrchen. </li><li> Add 6 ml Chloroform und MeOH (1:2) mischen und 0,8 ml Glasperlen zur Zellsuspension. </li><li> Vortex die Zellsuspension mit Glasperlen zweimal für 1 min. </li><li> 2 ml Chloroform und vorsichtig mischen. </li><li> Inkubieren für 5 min bei Raumtemperatur unter gelegentlichem Mischen. </li><li> 2 ml destilliertem H 2 O und vorsichtig mischen. </li><li> Inkubieren für 5 min bei Raumtemperatur unter gelegentlichem Mischen. </li><li> Zentrifugieren Sie für 5 min bei 3000 xg bei Raumtemperatur. </li><li> Sammeln Sie die gesamte flüssige Phase in ein neues High-Speed-Glas-Zentrifugenröhrchen. </li><li> Fügen Sie 3,2 ml Chloroform auf die Zellpellets aus Schritt 9. </li><li> Vortex zwei Mal für 1 min. </li><li> Zentrifugieren Sie für 5 min bei 3000 xg bei Raumtemperatur. </li><li> Fügen Sie den Überstand in der flüssigen Phase aus Schritt 10. </li><li> Zentrifugieren Sie für 5 min bei 3000 xg bei Raumtemperatur. </li><li> Entsorgen Sie die obere (wässrige) Phase und übertragen Sie die untere (organische) Phase in ein neues High-Speed-Glas-Zentrifugenröhrchen. </li><li> Zentrifugieren Sie für 5 min bei 3000 xg bei Raumtemperatur. </li><li> Geben Sie den gesamten Überstand in einem Glasfläschchen und trocken unter Stickstoff. </li><li> Lösen Sie den Lipidfilm in 500 ul Chloroform und bei -20 ° C. </li></ol> Analyse von Lipiden durch Massenspektrometrie Chloroform (1:1) mit 0,1% (v / v) Ammoniumhydroxid - Eine Aktie Mischung aus Lipid-Standards in Chloroform sollte vorher gemäß Tabelle 1 sowie einer Stammlösung von MeOH vorbereitet werden. <ol><li> Vor der Injektion kombinieren 10 ul einer Probe mit 10 ul der üblichen Mischung von Lipiden in Tabelle 1 angegeben. In 200 ul von 1:1 Chloroform: Methanol mit 0,1% NH 4 OH. <ul><li> Der Standard zur Probe Verhältnis kann bei Bedarf geändert werden. </li></ul></li><li> Resolve Lipide mit einem Micromass Q-TOF 2 Massen-Spektrometer mit einem Nano-Elektrospray-Source-Betriebssystem mit einer Flussrate von 1 ml / min ausgestattet. <ul><li> Exact Geräteparameter wird von Instrument zu Instrument unterschiedlich sein. Siehe Tabelle 2 für die Einstellungen für eine Micromass Q-ToF 2 (Waters, Milford, MA, USA) mit einem Nano-Elektrospray-Quelle ausgestattet. Obwohl wir den Vorteil der hohen Auflösung eines Q-TOF Art von Massenspektrometer aufgenommen haben, ist es nicht zwingend erforderlich. </li></ul></li><li> Nach dem Erwerb der Massenspektren werden geglättet, Hintergrund subtrahiert und zentriert, und dann die Peak-Liste nach Excel exportiert. Die Spitzen der einzelnen Lipid-Klasse werden dann in ihre internen Standard normalisiert. Je nach Anwendung kann es notwendig sein, nicht weiter Nachbearbeitung wie deisotoping und Entfaltung führen. </li></ol> Tabelle 1. Internal Lipid-Standards, deren Konzentrationen inder Standard-Mix und die MS-Modus für deren Analyse. <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td> Lipid-Klasse </td><td> Standard-Kette Zusammensetzung </td><td> Masse der Standard- </td><td> Konzentration (pg / ml) </td><td> MS-Modus </td></tr><tr><td> Phosphatidsäure </td><td> 14:0 / 14:0 </td><td> 591,40 </td><td> 100 </td><td> Negativ </td></tr><tr><td> Phosphatidylethanolamin </td><td> 14:0 / 14:0 </td><td> 634,45 </td><td> 200 </td><td> Negativ </td></tr><tr><td> Phosphatidylinositol </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> Negativ </td></tr><tr><td> Phosphatidylserin </td><td> 14:0 / 14:0 </td><td> 622,37 </td><td> 40 </td><td> Negativ </td></tr><tr><td> Cardiolipin </td><td> 4x14: 0 </td><td> 619,92 </td><td> 100 </td><td> Negativ </td></tr><tr><td> Freie Fettsäuren </td><td> 19.00 </td><td> 297,28 </td><td> 100 </td><td> Negativ </td></tr><tr><td> Phosphatidylcholin </td><td> 14:0 / 14:0 </td><td> 650,48 </td><td> 100 </td><td> Positiv </td></tr><tr><td> Triacylglycerole </td><td> 13:0 / 13:0 / 13:0 </td><td> 698,63 </td><td> 200 </td><td> Positiv </td></tr></tbody></table> Tabelle 2. Geräteeinstellungen für eine Micromass Q-ToF 2 (Waters, Milford, MA, USA) mit einem Nano-Elektrospray-Quelle ausgestattet. <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td></td><td> Durchfluss </td><td> Cone-Spannung </td><td> Kapillar-Spannung </td><td> Stoßgas </td></tr><tr><td> Positive Modus </td><td> 1μl/min </td><td> 28V </td><td> 3,0 kV </td><td> 10 </td></tr><tr><td> Negative Modus </td><td> 1μl/min </td><td> 30 v </td><td> -3,2 Kv </td><td> 10 </td></tr></tbody></table>

<ol><li>Cao, H., Gerhold, K., Mayers, J. R., Wiest, M. M., Watkins, S. M., Hotamisligil, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+lipokine%2C+a+lipid+hormone+linking+adipose+tissue+to+systemic+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Identification of a lipokine, a lipid hormone linking adipose tissue to systemic metabolism.</a> Cell. 134, 933-944 (2008).</li>
<li>Claypool, S. M., Oktay, Y., Boontheung, P., Loo, J. A., Koehler, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiolipin+defines+the+interactome+of+the+major+ADP%2FATP+carrier+protein+of+the+mitochondrial+inner+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cardiolipin defines the interactome of the major ADP/ATP carrier protein of the mitochondrial inner membrane.</a> J. Cell Biol. 182, 937-950 (2008).</li>
<li>Guo, T., Gregg, C., Boukh-Viner, T., Kyryakov, P., Goldberg, A., Bourque, S., Banu, F., Haile, S., Milijevic, S., San, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+signal+from+inside+the+peroxisome+initiates+its+division+by+promoting+the+remodeling+of+the+peroxisomal+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A signal from inside the peroxisome initiates its division by promoting the remodeling of the peroxisomal membrane.</a> J. Cell Biol. 177, 289-303 (2007).</li>
<li>Russell, S. J., Kahn, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocrine+regulation+of+ageing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Endocrine regulation of ageing.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8, 681-691 (2007).</li>
<li>Czabany, T., Athenstaedt, K., Daum, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis%2C+storage+and+degradation+of+neutral+lipids+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Synthesis, storage and degradation of neutral lipids in yeast.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1771, 299-309 (2007).</li>
<li>Br&uuml, gger, Erben, B., Sandhoff, G., Wieland, R., &amp, F. T., Lehmann, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+biological+membrane+lipids+at+the+low+picomole+level+by+nano-electrospray+ionization+tandem+mass+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of biological membrane lipids at the low picomole level by nano-electrospray ionization tandem mass spectroscopy.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94, 2339-2344 (1997).</li>
<li>Schneiter, R., Brügger, B., Sandhoff, R., Zellnig, G., Leber, A., Lampl, M., Athenstaedt, K., Hrastnik, C., Eder, S., Daum, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrospray+ionization+tandem+mass+spectrometry+%28ESI-MS%2FMS%29+analysis+of+the+lipid+molecular+species+composition+of+yeast+subcellular+membranes+reveals+acyl+chain-based+sorting%2Fremodeling+of+distinct+molecular+species+en+route+to+the+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Electrospray ionization tandem mass spectrometry (ESI-MS/MS) analysis of the lipid molecular species composition of yeast subcellular membranes reveals acyl chain-based sorting/remodeling of distinct molecular species en route to the plasma membrane.</a> J. Cell Biol. 146, 741-754 (1999).</li>
<li>Bligh, E. G., Dyer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+method+of+total+lipid+extraction+and+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Can.+J.+Biochem.+Physiol%22%5BJournal%5D)">A rapid method of total lipid extraction and purification.</a> Can. J. Biochem. Physiol. 37, 911-917 (1959).</li>
</ol>

Diese Methode ermöglicht eine schnelle quantitative Beurteilung der Hefe lipidome mit leicht verfügbaren, preiswerten Materialien. Die Methode erlaubt die Identifikation der meisten Lipidspezies in Hefezellen mit Ausnahme der Diacylglycerole, ergosterols und ergosteryl Ester gefunden, obwohl diese Lipide durch den Austausch Ammoniumhydroxid mit Lithiumhydroxid identifiziert werden kann. Das beschriebene Verfahren ermöglicht Lipid Identifizierung und Quantifizierung der Konzentrationen so niedrig wie pg / ml, wobei die K...

eine quantitative bewertung der hefe lipidome mit elektrospray-ionisation-massenspektrometrie

A Quantitative Assessment of The Yeast Lipidome using Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Lipide sind eine der wichtigsten Klassen von Biomolekülen und spielen eine wichtige Rolle Membran Dynamik, Energiespeicherung und-Signalisierung<sup&gt; 1-4</sup&gt;. Die Bierhefe<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt;, Ist eine genetisch und biochemisch manipulierbar einzelligen Eukaryoten mit annotierten Genom und sehr einfach lipidome, ein wertvolles Modell für die Untersuchung biologischer Funktionen der verschiedenen Lipid-Spezies in mehrzelligen Eukaryoten<sup&gt; 2,3,5</sup&gt;.<em&gt; S. cerevisiae</em&gt; Verfügt über 10 große Klassen von Lipiden mit Kettenlängen hauptsächlich von 16 oder 18 Kohlenstoffatomen und entweder Null oder Eins Unsättigungsgrad<sup&gt; 6,7</sup&gt;. Bestehende Verfahren zur Lipid-Identifizierung und Quantifizierung - wie Hochleistungs-Flüssigchromatographie, Dünnschichtchromatographie, Fluoreszenzmikroskopie, und Gaschromatographie mit MS gefolgt - gut etabliert sind, aber eine geringe Empfindlichkeit, unzureichend getrennte verschiedenen molekularen Formen von Lipiden, benötigen Lipid Derivatisierung vor zur Analyse, oder kann sehr zeitaufwendig sein. Hier präsentieren wir Ihnen eine detaillierte Beschreibung unserer experimentellen Ansatz, um diese inhärenten Einschränkungen durch Umfrage-scan ESI / MS zur Identifizierung und Quantifizierung des gesamten Ergänzung von Lipiden in Hefezellen zu lösen. Das beschriebene Verfahren erfordert keine chromatographische Trennung von komplexen Lipid-Mischungen aus Hefezellen gewonnen und damit erheblich beschleunigt den Prozess der Datenerfassung. Diese Methode ermöglicht Lipid Identifizierung und Quantifizierung der Konzentrationen so niedrig wie g / ml und wurde erfolgreich zur Beurteilung lipidomes der ganzen Hefezellen und ihre Organellen gereinigt angewendet. Lipids Extraktion aus ganzen Hefezellen für die Verwendung dieser Methode der Lipid-Analyse dauert zwei vor drei Stunden. Es dauert nur fünf Minuten vor zehn Minuten, um jede Probe extrahiert und getrocknet Lipide auf einem Q-TOF-Massenspektrometer mit einer Nano-Elektrospray-Quelle ausgestattet laufen.

Wir beschreiben eine neue quantitative Lipidomik Methode zur Identifizierung zahlreicher Lipidspezies in Hefe mit Umfrage-scan Elektrospray Massenspektrometrie (ESI / MS). Diese Methode überschreitet derzeit verfügbaren Methoden für die Lipid-Identifizierung und Quantifizierung in der Fähigkeit, verschiedene molekulare Formen von Lipiden, Empfindlichkeit und Geschwindigkeit zu lösen.

Eine quantitative Bewertung der Hefe Lipidome mit Elektrospray-Ionisation-Massenspektrometrie

Lipide gehören zu den Hauptklassen der Biomoleküle und spielen wichtige Rollen bei der Membrandynamik, der Energiespeicherung und der Signalübertragung1-4. Die Knosphefe ...

Dieses Protokoll ermöglicht eine schnelle Analyse der Hauptbestandteile der Hefelipide. Es beginnt mit der Gewinnung und dem Waschen von Hefezellen. Gewaschene Zellen werden in eine ein- bis zweifache Chloroform-Methanol-Mischung gegeben und mit Glasperlen lysiert.Die Zugabe von Chloroform und Wasser führt zur Trennung der beiden Phasen. Die organische Phase wird gesammelt, getrocknet, und der Lipidfilm anschließend in Chloroform zur Lagerung vor der Massenspektrometrie gelöst. Die extrahierten Lipide werden in Chloroform und Methanol mit Ammoniumhydroxid verdünnt, und eine Mischung interner Standards wird hinzugefügt.Die Lipidlösung kann nun direkt in das Massenspektrometer injiziert werden. Hallo, ich bin Simon Bork aus dem Labor von Vladimir Teco am Department für Biologie der Concordia University. Heute werde ich Ihnen eine Methode zur Quantifizierung von Hefelipiden mittels Massenspektrometrie zeigen.Wir verwenden dieses Verfahren in unserem Labor, um Veränderungen der Hefe-Lipide unter verschiedenen Wachstumsbedingungen zu untersuchen. Beginnen wir also. Um dieses Verfahren zu starten, resuspendieren Sie die zuvor hergestellten gefrorenen Hefe-Pellets in 1,6 Milliliter eiskal

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Biologie

Hier beschreiben wir eine neue quantitative Proteomik Verfahren zur Identifizierung von Protein-Komplexen in Saccharomyces cerevisiae. In dieser Studie haben wir die SILAC-Methode zusammen mit Affinitätsreinigung durch Tandem-Massenspektrometrie gefolgt, um mit hoher Spezifität zu identifizieren die Bindungspartner einer ER-Protein, Scs2p verwendet.

Identifizierung von Protein-Komplexen mit der quantitativen Proteomik in S. cerevisiae

Beschreibung eines quantitativen Phosphorylierung Verfahren mit cryolysis, Harnstoff solubilziation, HILIC Fraktionierung und IMAC Anreicherung von phosphorylierten Peptiden.

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae</em

Lipidtröpfchen sind wichtige Organellen für die Replikation von mehreren Erregern, einschließlich der Hepatitis C-Virus (HCV). Wir beschreiben ein Verfahren für die quantitative Lipidtröpfchen-Massenspektrometrie assoziierter Proteine ​​zu isolieren; es kann unter einer Vielzahl von Bedingungen, wie zum Beispiel Virusinfektion, Umweltstress, oder medikamentöse Behandlung verwendet werden.

Lipid Droplet Isolierung für die quantitative Massenspektrometrie-Analyse

Hier stellen wir eine MATLAB-Implementierung des automatisierten Nachweises und der quantitativen Beschreibung von Lipidtröpfchen in Fluoreszenzmikroskopiebildern von Spalt- und angehenden Hefezellen vor.

Analyse des Lipidtröpfchengehalts in Spalt- und Budding-Hefen mittels automatisierter Bildverarbeitung

Wir präsentieren ein Protokoll mit Flüssigchromatographie gekoppelt mit Tandem-Massenspektrometrie, um wichtige zelluläre Lipide in Saccharomyces cerevisiaezu identifizieren und zu quantifizieren. Die beschriebene Methode zur quantitativen Bewertung wichtiger Lipidklassen innerhalb einer Hefezelle ist vielseitig, robust und empfindlich.

Quantitative Analyse des Zelllipidoms von Saccharomyces Cerevisiae mit Flüssigchromatographie gekoppelt mit Tandem-Massenspektrometrie

Wir präsentieren ein Protokoll zur Identifizierung und Quantifizierung von Hauptklassen wasserlöslicher Metaboliten in der Hefe Saccharomyces cerevisiae. Die beschriebene Methode ist vielseitig, robust und sensibel. Es ermöglicht die Trennung von Strukturisomeren und stereoisomeren Formen wasserlöslicher Metaboliten voneinander.

Quantitative Metabolomik von Saccharomyces Cerevisiae mittels Flüssigkeitschromatographie gekoppelt mit Tandem-Massenspektrometrie

Hier wird ein Protokoll zur metabolischen Markierung von Hefe mit 14C-Essigsäure vorgestellt, das mit dünnschichtiger Chromatographie zur Abtrennung neutraler Lipide gekoppelt ist.

Analyse der neutralen Lipidsynthese in Saccharomyces cerevisiae durch metabolische Markierung und Dünnschichtchromatographie

Dieses Video demonstriert die Herstellung von ultra-dünnen Matrix / Analyt-Schicht für die Analyse von Peptiden und Proteinen durch Matrix-Assisted Laser Desorption Ionisation-Massenspektrometrie (MALDI-MS).

MALDI-Probenvorbereitung: Die Ultra Thin-Layer-Methode

Stabile Isotope Standards und Capture von Anti-Peptid-Antikörper (SISCAPA) Paare Affinitätsanreicherung von Peptiden mit Isotopenverdünnungsanalyse Massenspektrometrie (MRM-MS) zur quantitativen Messung von Peptiden als Ersatz für ihre jeweiligen Proteine ​​liefern. Hier beschreiben wir das Protokoll mit magnetischen Partikeln in einer teilautomatisierten Format.

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MALDI-TOF-Massenspektrometrie wurde erfolgreich genutzt, um die Amid-Wasserstoff / Deuterium-Austausch in Proteinkinase PAK2 Aktivierung überwachen.

Amid Wasserstoff / Deuterium-Austausch &amp; MALDI-TOF-Massenspektrometrie Analyse der PAK2 Activation

Lernen Sie eine quantitative Lipidanalyse in Hefe mittels Elektrospray-Ionisations-Massenspektrometrie. Diese Methode ermöglicht schnelle Identifizierung und Quantifizierung zahlreicher Lipidspezies mit hoher Sensitivität.

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