Eine quantitative Bewertung der Hefe Lipidome mit Elektrospray-Ionisation-Massenspektrometrie
21. August 2009
Wir beschreiben eine neue quantitative Lipidomik Methode zur Identifizierung zahlreicher Lipidspezies in Hefe mit Umfrage-scan Elektrospray Massenspektrometrie (ESI / MS). Diese Methode überschreitet derzeit verfügbaren Methoden für die Lipid-Identifizierung und Quantifizierung in der Fähigkeit, verschiedene molekulare Formen von Lipiden, Empfindlichkeit und Geschwindigkeit zu lösen.
Dieses Protokoll ermöglicht es, die Hauptbestandteile des Hefelipids schnell zu analysieren. Es beginnt mit der Ernte und dem Waschen von Hefezellen. Die gewaschenen Zellen werden in ein bis zwei Chloroform-Methanol-Gemisch gelegt und mit Glaskügelchen lysiert.
Durch Zugabe von Chloroform und Wasser werden die beiden Phasen getrennt. Die organische Phase wird gesammelt, getrocknet und der Lipidfilm dann in Chloroform aufgelöst, um sie vor der Massenspektroskopie zu lagern. Die extrahierten Lipide werden in Chloroform und Methanol mit Ammoniumhydroxid verdünnt und eine Mischung aus internen Standards zugesetzt.
Die Lipidlösung kann nun direkt in das Massenspektrometer injiziert werden. Hallo, ich bin Simon Bork aus dem Labor von Vladimir Teco am Fachbereich Biologie der Concordia Universität. Heute zeige ich Ihnen eine Methode zur Quantifizierung von Hefelipiden mittels Massenspektroskopie.
Wir verwenden dieses Verfahren in unserem Labor, um Veränderungen des Hefelipids unter verschiedenen Wachstumsbedingungen zu untersuchen. Also lasst uns loslegen. Um dieses Verfahren zu beginnen, suspendieren Sie die zuvor vorbereiteten gefrorenen Hefepellets in 1,6 Millilitern Eis und kaltem destilliertem Wasser und übertragen Sie 1,6 Milliliter der Zellsuspension in Hochgeschwindigkeits-Glaszentrifugenröhrchen.
Beachten Sie, dass während dieses Verfahrens alle Manipulationen mit extrahierten Lipiden mit Glaspipetten oder Spritzen durchgeführt werden. Da Kunststoffe ein großes Hintergrundsignal erzeugen, wenn sie mit Chloroform in Kontakt kommen, beginnen Sie die Lipidextraktion, indem Sie der Zellsuspension sechs Milliliter eines Chloroform-Methanol-Gemisches im Verhältnis eins zu zwei und 0,8 Milliliter Glasperlen, gemessen in einem Einor-Röhrchen, zusetzen. Die genauen Volumina sind unkritisch, solange das Verhältnis von eins zu zwei bis 0,8 für in Wasser suspendiertes Chloroform, Methanol und Hefe eingehalten wird. Wirbel.
Die Zellsuspension und die Glaskügelchen mischen sich zweimal für jeweils eine Minute, fahren mit der Zugabe von zwei Millilitern Chloroform fort und mischen vorsichtig, dann inkubieren Sie fünf Minuten lang bei Raumtemperatur mit gelegentlichem Mischen. Nach der fünfminütigen Inkubation zwei Milliliter destilliertes Wasser hinzufügen und vorsichtig mischen. Dann wieder fünf Minuten bei Raumtemperatur inkubieren und gelegentlich mischen.
Auch hier ist es wichtiger, das Verhältnis von zwei zu zwei zu 1,8 für Chloroform, Methanol und Wasser beizubehalten als ein bestimmtes Volumen. Wenn die zweite Inkubation abgeschlossen ist. Zentrifugieren Sie fünf Minuten lang bei 3000 g bei Raumtemperatur, sammeln Sie den gesamten Überstand dieser ersten Extraktion in ein neues Hochgeschwindigkeits-Glaszentrifugenröhrchen und fügen Sie 3,2 Milliliter Chloroform zu den verbleibenden Zellpellets hinzu, um eine zweite Lipidextraktion durchzuführen.
Wirbeln Sie die Zellpellets mit dem zugesetzten Chloroform zweimal für jeweils eine Minute vortexen. Dann fünf Minuten lang bei 3000 g zentrifugieren. Bei Raumtemperatur den Überstand aus dieser zweiten Extraktion zu dem Überstand hinzufügen, der nach der ersten Extraktion gesammelt wurde. Anschließend werden die gesammelten Überstände fünf Minuten lang zentrifugiert.
Bei 3000 g bei Raumtemperatur werden die extrahierten Lipide nun in der unteren organischen Phase gelöst. Die obere wässrige Phase wird verworfen und die untere Phase in ein neues Hochgeschwindigkeits-Glaszentrifugenröhrchen überführt. Um sauberere Spektren auf der Massenspektrometerzentrifuge zu erzeugen, wird die organische Phase fünf Minuten lang bei 3000 G bei Raumtemperatur ausgebildet und der gesamte Überstand in ein Glasfläschchen überführt.
Trocknen Sie die gelösten Lipide unter Stickstoff, lösen Sie den getrockneten Lipidfilm in 500 Mikrolitern Chloroform auf und lagern Sie ihn bei minus 20 Grad Celsius, bis die Proben massenspektrometrisch analysiert werden können. Beginnen Sie mit der Zubereitung einer Standardmischung der Lipide in Chloroform, wie in Tabelle eins im beigefügten schriftlichen Protokoll aufgeführt. Jedes Lipid repräsentiert eine andere Klasse.
Diese Lösung kann bei minus 20 Grad Celsius gelagert werden, um sie später vor der Injektion der extrahierten Lipide in das Massenspektrometer zu verwenden. Kombiniert 10 Mikroliter der Probe mit 10 Mikrolitern der Standardmischung von Lipiden. Beachten Sie, dass das Verhältnis von Norm zu Probe bei Bedarf geändert werden kann.
Lösen Sie die Mischung von Probe und Standardlipiden mit einem Mikromassenspektrometer Q bis F auf, das mit einer Nano-Elektrospray-Quelle ausgestattet ist, die mit einer Durchflussrate von einem Mikroliter pro Minute arbeitet. Die Einstellungen sind in Tabelle zwei des beigefügten schriftlichen Protokolls aufgeführt. Die Verwendung der hohen Auflösung eines Q bis F Massenspektrometers ist zwar vorteilhaft, aber keine zwingende Voraussetzung.
Die genauen Geräteparameter variieren zwischen den Massenspektrometern. Nach der Datenerfassung werden die Massenspektren geglättet, der Hintergrund subtrahiert und die Peaks zentriert. Exportieren Sie abschließend die Peakliste nach Excel.
Normalisieren Sie dann die Peaks jedes Lipidglases auf ihren internen Standard. Je nach Anwendung kann es notwendig sein, weitere Nachbearbeitungen wie z.B. de Isotope und Dekonvolution durchzuführen. Diese Methode ermöglicht eine schnelle und detaillierte Bestimmung der Hauptbestandteile des Hefelipids.
Hier haben wir ein Lipid hervorgehoben, das als Isotop entfaltet und auf seinen internen Standard normiert wurde. Wir haben Ihnen gerade gezeigt, wie man Hefelipide isoliert und wie man das Hefelipid mittels Elektro-Display-Ionisations-Massenspektroskopie bestimmt. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, die Verwendung von Kunststoffen zu vermeiden und Ihre Probe im linearen Konzentrationsbereich zu halten.
Diese Methode ist sehr flexibel und kann in vielen der Volumina nach Bedarf geändert werden. Dieses Extraktionsprotokoll eignet sich auch für andere Methoden der Lipidanalyse, wie z.B. die Dünnschichtchromatographie und die mehrdimensionale Massenspektroskopie. Das war's also.
Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.
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Übersicht
Dieser Artikel präsentiert eine neuartige quantitative Lipidomik-Methode zur Identifizierung verschiedener Lipidspezies in Hefe unter Verwendung von Survey-Scan-Elektrospray-Ionisations-Massenspektrometrie (ESI/MS). Diese Methode verbessert bestehende Techniken in Bezug auf Lipididentifikation, Quantifizierung, Empfindlichkeit und Geschwindigkeit erheblich.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Lipidomik
- Massenspektrometrie
- Hefebiologie
Hintergrund
- Lipidomik ist entscheidend für das Verständnis zellulärer Funktionen.
- Traditionelle Methoden zur Lipidanalyse haben Einschränkungen in Empfindlichkeit und Auflösung.
- Survey-Scan ESI/MS bietet eine vielversprechende Alternative.
- Diese Studie zielt darauf ab, die Lipididentifikation und -quantifizierung in Hefe zu verbessern.
Zweck der Studie
- Eine schnelle und effiziente Methode für die Lipidanalyse zu entwickeln.
- Die Auflösung der Lipidspezies-Identifizierung zu verbessern.
- Die Empfindlichkeit der Lipidquantifizierung zu erhöhen.
Verwendete Methoden
- Ernte und Waschen von Hefezellen.
- Lyse von Zellen mit Glasperlen in einer Chloroform-Methanol-Mischung.
- Trennung der Lipidphasen unter Verwendung von Chloroform und Wasser.
- Vorbereitung von Lipidproben für die Massenspektrometrie-Analyse.
Hauptergebnisse
- Die neue Methode ermöglicht die Identifizierung zahlreicher Lipidspezies.
- Sie zeigt eine überlegene Empfindlichkeit im Vergleich zu bestehenden Techniken.
- Die Analysegeschwindigkeit wird erheblich verbessert.
Schlussfolgerungen
- Diese Methode stellt einen bedeutenden Fortschritt in der Lipidomik dar.
- Sie kann auf verschiedene Forschungsbereiche angewendet werden, die eine Lipidanalyse beinhalten.
- Zukünftige Studien können ihre Anwendung auf andere Organismen ausweiten.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
Quantitative lipidomics using electrospray ionization mass spectrometry (ESI/MS) enables rapid, high-sensitivity profiling of yeast lipidomes, supporting mechanistic de-risking and target validation in early discovery. This workflow accelerates lipid identification and quantification, providing robust data for pathway interrogation and functional studies. The approach is directly relevant for biopharma teams seeking scalable, reproducible lipidomic analyses to inform discovery-stage decisions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables comprehensive profiling of lipid species to clarify metabolic pathways.
- Supports functional validation of lipid-related targets in genetically tractable yeast models.
- Facilitates mechanistic de-risking by quantifying lipid changes under different conditions.
- Provides quantitative data to inform go/no-go decisions in target selection.
Screening & Assay Development
- Delivers validated, reproducible lipid quantification suitable for assay standardization.
- Reduces sample preparation time by eliminating chromatographic separation steps.
- Supports high-throughput screening readiness with rapid sample analysis.
- Enables reliable comparison of compound effects on lipid profiles.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant lipidomic studies by enabling organelle-specific lipid analysis.
- Provides continuity from yeast model findings to higher eukaryotic systems.
- Supports risk-adjusted advancement by quantifying lipid biomarkers.
- Enhances predictive confidence in translational lipid biology research.
Pipeline & Workflow Integration
This ESI/MS lipidomics method fits from early discovery through lead identification, supporting both hypothesis-driven and screening workflows.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing and pathway clarification via quantitative lipid profiling.
- Screening: Provides assay-ready, reproducible lipid measurements for compound evaluation.
- Analytics: Generates normalized, quantitative outputs for robust statistical comparison.
- Translational Research: Facilitates biomarker alignment and preclinical continuity when extending findings beyond yeast.
- Enterprise Reuse: Offers a flexible, scalable platform adaptable to various lipidomic research needs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in lipid biology.
- Operational Value: Streamlines workflows with rapid, standardized sample processing and analysis.
- Strategic Value: Improves decision-making efficiency and reduces late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of lipid-targeted programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in mass spectrometry and lipid extraction protocols.
- Needs access to high-resolution mass spectrometry instrumentation and analytical software.
- Demands strict standardization of sample handling to ensure reproducibility.
- Adaptable to other model systems with protocol optimization.
- Plasticware must be avoided to prevent background signal interference.
