Name: Vorbereitung und Kultur der Rat Linsenepithelzellen Explantate für ein Studium der terminalen Differenzierung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-09-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 2 s
Description: Lernen Sie die Kultur von Linsenepithel-Explantaten aus Ratten für Studien zur terminalen Differenzierung. Diese Methode nutzt FGF-2 und Immunfluoreszenzmikroskopie zur Analyse von Genexpression und Signalwegen.

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Die Aufstellung von Linsenepithelzellen Explantate hat sich von Methoden im Labor von Dr. John McAvoy 9 entstanden angepasst. Diese Arbeit wird von der National Eye Institute, Intramural Research Program Z01-EY000238-22 finanziert

Teil 1: Entfernen von Objektiven Materialien und Reagenzien: <ol><li> Micro-Präparierscheren, gekrümmte, stumpfe Spitzen, (wie as.RS-5983, Roboz Surgical Instrument Co., Inc., Gaithersburg, MD), Mikro-Sezieren Pinzette, gebogene Spitze (wie Roboz # RS5137). </li><li> Suspensionsmedium: Medium 199 mit 0,1% Rinderserumalbumin, 100 Einheiten / ml Penicillin, 100μg/ml Streptomycin, 2,5 ug / ml Amphotericin B. Die Reagenzien sind von Invitrogen, Carlsbad, CA zur Verfügung. </li></ol> Vorgehensweise: <ol><li> Euthanize neugeborenen Ratten (Alter 2-4 Tage) in Übereinstimmung mit den Richtlinien von den National Institutes of Health, Bethesda, MD zur Verfügung gestellt. </li><li> Entfernen Sie die Augenlider mit chirurgischer Schere. Drücken Sie vorsichtig mit gebogenen Pinzette auf den gegenüberliegenden Seiten der Augenhöhle auf das Auge zu wölben nach außen gerichtete Kraft. Machen Sie einen kleinen Schnitt an der hinteren Seite des Auges mit der Schere. Durch Drücken mit der Pinzette an der Seite des Auges gegenüber dem Schnitt kann das Objektiv und eine kleine Menge der angeschlossenen Glaskörper dann durch den Bruch erzwungen werden, so dass das Objektiv mit gebogenen Pinzette abgeholt werden. Es sollte darauf geachtet werden, dass die Linsenkapsel zu brechen. </li><li> Verwenden Sie die gebogene Pinzette, um die Linsen zu einem 60mm Kunststoff Gewebekultur Schale mit 5 ml warme, sterile Suspension Medium zu übertragen. </li></ol> Teil 2: Mikrodissektion von Explantaten Materialien und Reagenzien: <ol><li> Micro Dissecting Pinzette, 0,1 mm Spitzen, (wie Roboz RS-4976). Wir verwenden Dumostar Legierung wegen der Flexibilität der Spitze, aber auch andere Stahllegierungen sind auch akzeptabel. Pinzetten mit Spitzen dünner als 0,1 mm sind nicht empfehlenswert, da sie zu brechen oder während dieses Vorgangs Kurve neigen. </li><li> Suspensionsmedium (siehe Teil 1) </li><li> Unsupplementierte Ham &#39;s F12 Medium oder Medium 199 (Invitrogen, Carlsburg, CA) </li></ol> Vorgehensweise: <ol><li> Die folgenden Schritte sollten in einem sauberen, zugfreien Umgebung mit sterilen Sezieren Werkzeuge und sterile Medium durchgeführt werden. </li><li> Mit einem Stereo-Binokular, reinigen Sie die Linsen eventuell anhaftende Gewebe mit der 0,1 mm Spitze Pinzette und übertragen Sie sie auf eine zweite 60mm Kulturschale mit 5 ml sterile Suspensionsmedium (dieser Schritt hilft, zur Verringerung der Kontaminierung). Mit der Pinzette, übertragen Sie die gewünschte Anzahl von Linsen zu einer 35-mm Kulturschale mit 5 ml sterile, unsupplementierte Medium. (Wir verwenden oft Ham &#39;s F12 (Invitrogen) für diesen Schritt, weil die untere Farbstoffkonzentration macht Dissektion leichter, jedoch ist Medium 199 auch akzeptabel Keine Antibiotika oder andere Zusätze in diesem Schritt benötigt werden..) Bis zu 12 Explantate gemacht werden können in der Mitte eines Tellers dieser Größe. Allerdings sollte eine 35 mm-Schale verwendet, auch wenn weniger Explantate gemacht werden, da die Zerlegung-Werkzeuge können nicht einfach in eine kleinere Schüssel manipuliert werden sollen. Übertragen Sie die Schale mit den restlichen Linsen zu einer Gewebekultur-Inkubator bei 37 ° C, bis sie benötigt werden. </li><li> Identifizieren der hinteren Seite der Linse. Es gibt viele Wege, dies zu erkennen: 1) Die hintere ist runder als die vorderen, die leicht abgeflacht ist, 2) neugeborenen Ratte Linsen bilden kalte Grauen Star, wie sie auf Raumtemperatur abkühlen während der Präparation. Wenn die kalte Grauen Star hat nicht ganz die Linse gefüllt ist, wird die hintere Seite die Seite aus dem opaken Bereich am weitesten. Wenn Sie die Deckkraft hat die Linse gefüllt, Erwärmung der Schüssel auf 37 ° C für ein paar Minuten wird es umgekehrt. Die hintere Seite kann als die Katarakt-Reformen beim Abkühlen identifiziert werden. 3) Spuren der Tunica vasculosa lentis kann sichtbar auf der hinteren Seite. 4) Die hintere Naht sichtbar sein an der hinteren Seite. Die Ermittlung der hinteren Seite korrekt ist wichtig, da hier die Kapsel geöffnet werden. Eröffnung der Linse auf der Vorderseite reißt das Epithel. </li><li> Sobald der hinteren Seite identifiziert worden ist, schalten Sie ihn nach oben und greifen die Linse in der linken Pinzette (für einen Rechtshänder Arbeiter). Dann klemmen Sie das hintere Kapsel mit der rechten Pinzette, eine kleine Falte zu erzeugen. </li><li> Halten Sie die hintere Kapsel mit der rechten Pinzette fassen die Falte der Kapsel mit der linken Pinzette und ziehen Sie die beiden Pinzetten in entgegengesetzte Richtungen, um einen kleinen Riss in der Kapsel zu machen. </li><li> Fassen Sie den Rand des Zurückziehen Kapsel mit der Pinzette, ziehen Sie es nach unten, zuerst auf der einen Seite, dann auf der anderen, Einpressen in den Kunststoff der Schale mit der Pinzette. Wiederholen Sie dies einige Male, bewegt rund um den Äquator der Linse, bis die Kapsel ist fest mit der Platte an vielen Stellen angebracht. Halten Sie die Kapsel in Ort mit der linken Pinzette, schaukeln die Fasermasse mit der rechten Pinzette die Bindung zwischen der Faser und Epithelzellen an der Linsenäquator brechen. Dann drücken Sie die Fasermasse entfernt, rollt ihn aus der Kapsel / Epithel, das an der Unterseite der bleibtGericht. Setzen Sie diesen Vorgang mit allen Objektiven in die Schüssel. Entfernen und Entsorgen der Fasermassen (oder speichern Sie sie als eine Quelle der Linsenproteinen für weitere Untersuchungen eingefroren). </li></ol> Teil 3: Mikrodissektion und Kultur von zentraler Explantate Materialien und Reagenzien: <ol><li> Sterile Einweg-Skalpell Nr. 15 Klinge, (Cincinnati Surgical Co. Cincinnati, OH) </li><li> Sterile Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung mit Calcium und Magnesium (Invitrogen, Carlsbad, CA) </li><li> Kulturmedium: Suspension Medium mit 100ng/ml FGF-2 (Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO). </li></ol> Vorgehensweise: <ol><li> Mit einem sterilen Skalpell, wegschneiden der peripheren Epithel (PE), die Zellen enthält in den frühen Stadien der Differenzierung (Abbildung 1A), so dass ein zentraler Platz ca. 2,0 mm auf einer Seite, bestehend aus zentralen Epithelzellen nur (CE) (Abbildung 1B). </li><li> Übertragen Sie die Schale mit dem zentralen Explantate eine Biosicherheitswerkbank. 3 x waschen mit sterilem PBS mit Calcium und Magnesium und einmal mit 1 ml frisch, äquilibriert (37 ° C, 5% CO 2) Suspensionsmedium. Diese wäscht erheblich reduzieren die Wahrscheinlichkeit einer Kontamination. </li><li> Add 2 ml Kulturmedium zu einer Differenzierung 1 zu induzieren, und legen die Explantate in einem befeuchteten, Gewebekultur-Inkubator bei 37 ° C, 5% CO 2. Kultur Perioden kann so kurz wie ein paar Stunden oder zu verlängern, solange zwei vor drei Wochen, je nach Parameter untersucht. Medium sollte alle zwei vor drei Tagen sein. </li></ol> Teil 4: Die Ernte der Explantate für die Analyse von Ereignissen mit der Differenzierung verbunden 1. Harvesting Explantate für die Analyse von Protein-oder RNA Materialien: <ol><li> Microdissecting Pinzette </li><li> SDS-Lysepuffer oder RNA-später </li></ol> Vorgehensweise: <ol><li> Am Ende der Inkubationszeit, entfernen Sie das Kulturmedium. </li><li> Mit dem Stereo-Binokular, sanft lockern die Kanten der einzelnen Explantation. </li><li> Heben Sie jedes Explantat mit der Pinzette und überträgt es auf ein Rohr mit etwa 100 &amp;mgr; SDS Lysepuffer (für Protein-Analyse) oder RNA-später (für RNA-Analyse). Man schüttelt die Spitze der Pinzette in die Lösung, um sicherzustellen, dass die Explantation nicht die Pinzetten-Stick. </li></ol> 2. Harvesting Explantate für Immunfluoreszenz Materialien und Reagenzien: <ol><li> Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung mit Calcium und Magnesium (Invitrogen, Carlsbad, CA) </li><li> Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (ohne Calcium und Magnesium) (Invitrogen, Carlsbad, CA) </li><li> 4% Paraformaldehyd (Boston Bioproducts, Worcester, MA) </li><li> Microdissecting Pinzette </li><li> Hydrophobe Markierstift </li><li> Glasobjektträger </li><li> 0,25% Triton X-100 in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung. </li></ol> Vorgehensweise: <ol><li> Spülen Explantate kurz in PBS mit Calcium und Magnesium. </li><li> Fix Gewebe durch Zugabe von 4% Paraformaldehyd für 30 Minuten bei Raumtemperatur. </li><li> Entfernen Sie das Fixativ und ersetzen mit Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung. Feste Explantate werden etwas steif, so dass sie aufgehoben und übertragen werden Glasträger für Immunfärbung. </li><li> Legen Sie einen kleinen Tropfen PBS (ohne Calcium und Magnesium) auf der Folie in die richtige Position des Gewebes und verhindern, Eisstockschießen. Mit microdissecting Pinzette, heben Sie die Explantation und fügen Sie ihn in die Tropfen auf dem Objektträger. Ohne Berührung der Explantation, entfernen Sie vorsichtig die Flüssigkeit mit einem Papiertuch Docht auf dem Explantat auf dem Glas flach und lassen das Gewebe trocknen an der Luft bei Raumtemperatur für 3 bis 5 Minuten. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1519/fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1 A. Die periphere Epithel drückt Differenzierungs-spezifischen Proteinen. Das Explantat gezeigt wurde für N-Cadherin unmittelbar nach Mikrodissektion immungefärbt. Expression ist in einem Band von Zellen im peripheren Epithel zu sehen, was darauf hinweist, dass die Zellen in dieser Region haben damit begonnen, zu unterscheiden. B. Die periphere Epithel weg getrimmt werden kann, um Zellen zu entfernen, die zum Ausdruck N-Cadherin und andere Differenzierungs-spezifischen Proteinen. Der rote Ring steht für die Lage von Zellen, die zum Ausdruck N-Cadherin, während das kleine Quadrat in grau skizzierte die Quadranten des Epithels in Panel 1A gezeigt ist. Die periphere Epithel kann durch vier Skalpell Schnitte entfernt werden, wobei ein zentraler Platz, dass nur Zellen, die noch nicht begonnen haben, zu unterscheiden, enthält.

<ol><li>McAvoy, J. W., Chamberlain, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast+growth+factor+%28FGF%29+induces+different+responses+in+lens+epithelial+cells+depending+on+its+concentration%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Fibroblast growth factor (FGF) induces different responses in lens epithelial cells depending on its concentration.</a> Development. 107 (2), 221-228 (1989).</li>
<li>Campbell, M. T., McAvoy, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Onset+of+fibre+differentiation+in+cultured+rat+lens+epithelium+under+the+influence+of+neural+retina-conditioned+medium%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Onset of fibre differentiation in cultured rat lens epithelium under the influence of neural retina-conditioned medium.</a> Exp Eye Res. 39 (1), 83-94 (1984).</li>
<li>Lovicu, F. J., McAvoy, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+analysis+of+lens+epithelial+explants+induced+to+differentiate+into+fibres+by+fibroblast+growth+factor+%28FGF%29%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Structural analysis of lens epithelial explants induced to differentiate into fibres by fibroblast growth factor (FGF).</a> Exp Eye Res. 49 (3), 479-494 (1989).</li>
<li>Golestaneh, N., Fan, J., Fariss, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lens+major+intrinsic+protein+%28MIP%29%2Faquaporin+0+expression+in+rat+lens+epithelia+explants+requires+fibroblast+growth+factor-induced+ERK+and+JNK+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Lens major intrinsic protein (MIP)/aquaporin 0 expression in rat lens epithelia explants requires fibroblast growth factor-induced ERK and JNK signaling.</a> J Biol Chem. 279 (30), 31813-31822 (2004).</li>
<li>Saravanamuthu, S. S., Gao, C. Y., Zelenka, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch+signaling+is+required+for+lateral+induction+of+Jagged1+during+FGF-induced+lens+fiber+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Notch signaling is required for lateral induction of Jagged1 during FGF-induced lens fiber differentiation.</a> Dev Biol. 332 (1), 166-176 (2009).</li>
<li>Lovicu, F. J., McAvoy, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FGF-induced+lens+cell+proliferation+and+differentiation+is+dependent+on+MAPK+%28ERK1%2F2%29+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">FGF-induced lens cell proliferation and differentiation is dependent on MAPK (ERK1/2) signalling.</a> Development. 128 (24), 5075-5084 (2001).</li>
<li>Dirks, R. P., Kraft, H. J., Van Genesen, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cooperation+between+two+silencers+creates+an+enhancer+element+that+controls+both+the+lens-preferred+and+the+differentiation+stage-specific+expression+of+the+rat+beta+B2-crystallin+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Biochem%22%5BJournal%5D)">The cooperation between two silencers creates an enhancer element that controls both the lens-preferred and the differentiation stage-specific expression of the rat beta B2-crystallin gene.</a> Eur J Biochem. 239 (1), 23-32 (1996).</li>
<li>Yang, Y., Stopka, T., Golestaneh, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+alphaA-crystallin+via+Pax6%2C+c-Maf%2C+CREB+and+a+broad+domain+of+lens-specific+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+journal%22%5BJournal%5D)">Regulation of alphaA-crystallin via Pax6, c-Maf, CREB and a broad domain of lens-specific chromatin.</a> The EMBO journal. 25 (10), 2107-2118 (2006).</li>
<li>McAvoy, J. W., T, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+retinas+promote+cell+division+and+fibre+differentiation+in+lens+epithelial+explants%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Neural retinas promote cell division and fibre differentiation in lens epithelial explants.</a> Curr Eye Res. 3 (6), 827-834 (1984).</li>
</ol>

Die Ratte Objektiv Explantation System wurde erfolgreich durch eine Reihe von Labors zur terminalen Differenzierung der Linse Epithelzellen zu Linsenfasern 21,3,4,5 Studie verwendet. Wenn an FGF-2 bei 100ng/ml ausgesetzt die Explantate werden beginnen, Veränderungen in Signalisierung innerhalb weniger Minuten 6 zeigen, mit den Veränderungen in der Morphologie und Genexpression erscheinen nacheinander über mehrere Tage 3,4,5. Die Kulturen bleiben für 2-3 Wochen lebensfähig, wenn darauf geachtet wird, um eine Kontamination zu verhindern. Die zentrale Explantate in diesem Protokoll beschriebenen sind besonders nützlich für die Untersuchung der Abfolge der Ereignisse mit der Differenzierung verbunden, da sie wenige oder gar keine Zellen, die Differenzierung Marker vor FGF-2 Express 1,5 hinzugefügt wird enthalten. Die Zellen werden dann synchron zu differenzieren, wie eine Kohorte, die es ermöglicht, den zeitlichen Verlauf der Signalisierungs-und Transkriptions-Veranstaltungen mit der Differenzierung verbundene folgen. Die Kultivierung Explantate für unterschiedliche Zeitspannen somit genaue zeitliche Informationen über die Reihenfolge Ereignisse. Spezifische Inhibitoren kann zum Kulturmedium zugegeben werden, um relevante Signalwege zu identifizieren. Explantate verwendet werden, um die Proteinexpression durch SDS-Gelelektrophorese und Immunoblot analysieren oder Expression spezifischer mRNAs mittels RT-PCR analysiert werden. Protein liefert Bereich von 20-50 g / Explantation und RNA-Ausbeute ist etwa 200 bis 600 ng / Explantation, abhängig von der Länge der Kulturzeit. Wir in der Regel feststellen, dass 5-6 Explantate pro Gericht wird ausreichend Protein oder RNA für mehrere Untersuchungen liefern. RNA aus Explantaten kann auch verwendet werden, um cDNA für die Beurteilung der Genexpression durch Microarray-Analyse, die neue Gene, die entscheidend für die Differenzierung kann identifizieren können vorbereitet werden. Explantate können auch transfiziert werden. Obwohl Transfektionseffizienz generell gering ist, genügt es für die Bestimmung von Reportergene 4; 7; 8. Immunfluoreszenzmikroskopie der Explantate bietet eine sinnvolle Ergänzung zu biochemischen Methoden durch die Bestimmung der subzellulären Lokalisation der Proteine ​​von Interesse. Somit stellt die Vorbereitung und die Kultur der Ratte Objektiv Explantate ein leistungsfähiges System für die Untersuchung Terminal Linse Differenzierung bei Säugetieren, die in vivo-Techniken, wie zB Erzeugung von transgenen und knock-out Mäuse ergänzen können.

vorbereitung und kultur der rat linsenepithelzellen explantate für ein studium der terminalen differenzierung

Preparation and Culture of Rat Lens Epithelial Explants for Studying Terminal Differentiation

Die vordere Fläche der Augenlinse wird durch eine Monolage von Epithelzellen, die in einer ringförmigen Zone zugrunde liegenden Ziliarkörper vermehren abgedeckt. Nach Division, diese Zellen nach hinten wandern, wo FGF diffundieren aus der Retina induziert sie in eine hintere Reihe von länglichen Linse Faserzellen, die den Großteil der Linse komponieren zu unterscheiden. Die Differenzierung der Linsen-Epithel-Zellen in Linsenfasern kann in vitro durch Kultivierung von Explantaten der zentrale Bereich des vorderen Epithels in Gegenwart von FGF-2 induziert werden. Explantate aus Linsen neugeborenen Ratten durch das Entfernen der Linse aus dem Auge und Greifen der Linsenkapsel an der hinteren Seite mit Sezieren einer Pinzette vorbereitet. Die hintere Kapsel wird dann vorsichtig aufgerissen und ab in die Kunststoff-Unterseite eines Gewebes Kulturschale gedrückt. Die peripheren Regionen der Explantation sind mit einem Skalpell entfernt und der zentrale Bereich wird dann in Anwesenheit von 100ng/ml FGF-2, solange 2-3 Wochen kultiviert, abhängig von der zu untersuchenden Parameter. Da Epithelzellen in kultivierten Explantate in annähernd synchron zu differenzieren über einen Zeitraum von Tagen bis Wochen kann der zeitliche Verlauf der Signalisierung und die Genexpression anhand molekulare, biochemische und pharmakologische Techniken. Immunfluoreszenz-Mikroskopie ist eine leistungsstarke Ergänzung zu diesen Methoden, wie sie die subzelluläre Lokalisierung von Proteinen von Interesse zeigt, und können die physiologischen Folgen der experimentellen Manipulationen der Signalwege zu offenbaren.

Explantate der zentralen Region von Ratten Objektiv Epithelien synchron zu unterscheiden, wenn in Gegenwart von FGF-2 kultiviert. Immunfluoreszenzmikroskopie solcher Kulturen stellt neue Informationen über Genexpression und Signaltransduktion mit der terminalen Differenzierung verbunden.

Vorbereitung und Kultur der Rat Linsenepithelzellen Explantate für ein Studium der terminalen Differenzierung

Die Vorderseite der Augenlinse ist von einer Monoschicht aus Epithelzellen bedeckt, die in einer ringförmigen Zone unterhalb des Ziliarkörpers proliferieren.

Dieses Verfahren beginnt mit dem Entfernen der Linsen von zwei bis vier Tage alten Ratten und deren Reinigung von anhaftendem Gewebe. Die hintere Seite der Linse wird identifiziert, und ein kleiner Riss wird in die Kapsel gemacht. Anschließend wird die Kapsel nach unten abgezogen und auf den Boden der Petrischale gedrückt.Dieser Vorgang wird rund um die gesamte Linse wiederholt. Die Linsenfasermasse wird durch seitliches Schaukeln entfernt. Das periphere Epithel wird abgeschnitten und anschließend kultiviert.Schließlich werden sie für die biochemische Analyse in ein Reagenzglas überführt oder auf einen Objektträger für die Mikroskopie gegeben. Hallo, ich bin Peggy Lanka im Labor für Molekulare und Entwicklungsbiologie am National Eye Institute des NIH. Hallo, ich bin Al Tu, ebenfalls aus dem Labor für Molekulare und Entwicklungsbiologie am National Eye Institute.Ich bin Chung Ga, ebenfalls aus demselben Labor am NEI. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Explantation und Kultivierung von Linsenepithelzellen aus neugeborenen Ratten. Wir werden Ihnen zeigen, wie man den peripheren Bereich des Epithels entfernt, der Zellen in frühen Differenzierungsstadien enthält.Dann zeigen wir Ihnen, wie man die verbleibenden zentralen Linsenepithelzellen durch Exposition gegenüber FGF zur Differenzierung in Linsenfasern anregt. Wir verwenden dieses Verfahren in unserem Labor, um den zeitlichen Ablauf von Ereignissen während der terminalen Differenzierung zu untersuchen. Wir gewinnen die EXPLAN zu verschiedenen Zeitpunkten nach Zugabe von FGF zum Kulturmedium.Dann analysieren wir die Proteinausprägung mittels Western Blotting, die RNA-Ausprägung mittels RT-PCR oder Mikroarrays und führen eine Immunfärbung des Explants durch, um die subzelluläre Lokalisation der Proteine von Interesse zu bestimmen. Beginnen wir damit, Linsen von neugeborenen Ratten zu entnehmen. Verwenden Sie zu Beginn mikrochirurgische Scheren, um die Linsen aus den Augen euthanasierter zwei- bis vier Tage alter Ratten zu entfernen, indem Sie einen kleinen hinteren Schnitt ansetzen und auf die gegenüberliegende Seite drücken.Überführen Sie die Linsen mit Hilfe von Pinzetten mit 0,1 mm Spitze in eine 60 mm große Kunststoffkulturschale, die fünf Milliliter warmes steriles Suspensionsmedium enthält. Entfernen Sie anhaftendes Gewebe von den Linsen und überführen Sie sie in eine zweite 60 mm große Kulturschale, die fünf Milliliter steriles Suspensionsmedium enthält. Dies trägt dazu bei, Kontaminationen durch die Pinzette zu reduzieren.Überführen Sie die gewünschte Anzahl an Linsen in eine 35 Millimeter große Kulturschale, die zwei Milliliter steriles, unzusätzliches Medium enthält. In der Mitte einer Schale dieser Größe können bis zu 12 x explan hergestellt werden. Überschüssige Linsen können in der zuvor verwendeten zweiten 60 Millimeter großen Schale aufbewahrt und bis zu einer Stunde vor der Herstellung von X explan in einen Zellkulturinkubator bei 37 Grad Celsius gestellt werden.Identifizieren Sie nun die hintere Seite der Linse. Bei diesen beiden hier erkenne ich, dass sie mit ihrer vorderen Seite nach oben liegen. Ich werde sie jetzt seitlich drehen, damit Sie entlangblicken können, und Sie werden den Katarakt im Kältezustand sehen, also einen undurchsichtigen Bereich in der Mitte.Die dem undurchsichtigen Zentrum am weitesten entfernte Seite ist die hintere Seite. Daher drehe ich sie auf die hintere Seite um. Auf der hinteren Seite sind außerdem diese Streifungen sichtbar, die Überreste einer tenalen Vaskulitis darstellen.Es handelt sich um ein Blutgefäßerstermuster am Rand der Linse, das auch die hintere Seite markiert. Korrekt. Die Identifizierung ist entscheidend, da hier die Kapsel geöffnet wird. Ein Öffnen der Linse auf der vorderen Seite würde das Epithel einreißen.Es gibt mehrere Möglichkeiten, die hintere Seite zu identifizieren. Erstens ist sie runder als die vordere Seite, die leicht abgeflacht ist. Zweitens bilden die Linsen neugeborener Ratten Kältekatarakte, wenn sie während der Dissektion auf Raumtemperatur abkühlen.Wenn sich der kalte Katarakt noch nicht vollständig über die Linse ausgebreitet hat, ist die hintere Seite diejenige, die am weitesten von der undurchsichtigen Region entfernt liegt. Wenn die Undurchsichtigkeit die Linse bereits vollständig ausgefüllt hat, kann das Erwärmen der Schale auf 37 Grad Celsius für einige Minuten diesen Zustand rückgängig machen. Die hintere Seite kann identifiziert werden, indem man beobachtet, wie sich der Katarakt beim Abkühlen erneut bildet.Ein drittes Überbleibsel der Tunica VASIs kann auf der Rückseite sichtbar sein. Schließlich kann die hintere Naht auf der Rückseite sichtbar sein. Sobald die Rückseite identifiziert wurde, drehen Sie sie nach oben und stützen Sie die Linse mit der linken Pinzette ab.Drücken Sie dann mit der rechten Pinzette die hintere Kapsel zusammen, um eine kleine Falte zu erzeugen. Während Sie die hintere Kapsel weiterhin mit der rechten Pinzette festhalten, greifen Sie die Kapselfalte mit der linken Pinzette und ziehen beide Pinzetten in entgegengesetzte Richtungen, um einen kleinen Riss in der Kapsel zu erzeugen. Greifen Sie dann den Rand der sich zurückziehenden Kapsel mit der Pinzette, ziehen Sie ihn zuerst auf einer Seite nach unten, dann auf der anderen Seite und drücken Sie ihn mit der Pinzette in den Kunststoff der Petrischale. Wiederholen Sie diesen Vorgang mehrmals, indem Sie sich schrittweise entlang des Äquators der Linse bewegen, bis die Kapsel fest am Objektträger befestigt ist. An zahlreichen Stellen halten Sie die Kapsel mit der linken Pinzette fest und bewegen vorsichtig mit der rechten Pinzette die Fasermasse hin und her, um die Verbindung zwischen den Faserzellen und den Epithelzellen am Linsenäquator zu lösen.Ziehen Sie nun vorsichtig die Fasermasse ab, indem Sie sie von der Kapsel abrollen, die am Boden der Schale verbleibt. Wiederholen Sie diesen Vorgang mit allen Linsen in der Schale. Die Fasermassen können entsorgt oder eingefroren und als Quelle für Linsenproteine für andere Studien mit Mikrodissektion des gesamten epithelialen Explantats aufbewahrt werden.Sehen wir uns das mikrochirurgische Präparieren und Kultivieren des zentralen Explants an. Mit einem sterilen Skalpell wird das periphere Epithel entfernt, das Zellen in frühen Differenzierungsstadien enthält. Dabei bleibt ein zentrales Quadrat von etwa zwei Millimetern Kantenlänge erhalten, das aus zentralen Epithelzellen besteht.Überführen Sie die Schale mit dem zentralen x-Explant nur in einen Sicherheitswerkbank. Waschen Sie die Auberginen dreimal mit steriler PBS und einmal mit einem Milliliter frischem, äquilibriertem Suspensionsmedium. Geben Sie anschließend zwei Milliliter Kulturmedium hinzu, um die Differenzierung zu induzieren, und stellen Sie das Explant in einen befeuchteten Gewebekultur-Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid.Die Kulturzeit kann je nach dem untersuchten Parameter wenige Stunden bis zwei bis drei Wochen betragen. Das Medium sollte alle zwei bis drei Tage gewechselt werden, wobei eine Mikrodissektion und Turing-Vollständigkeit erfolgen. Beginnen wir damit, die Explantate zur Analyse zu gewinnen.Am Ende der Inkubationszeit entfernen Sie das Kulturmedium mit mikrochirurgischen Pinzetten. Lockern Sie vorsichtig die Ränder jedes Explants. Greifen Sie jedes Explant mit der Pinzette und überführen Sie es in ein Reagenzglas, das etwa 100 Mikroliter SDS-Lysepuffer für die Proteinanalyse oder RNA later für die RNA-Analyse enthält. Bewegen Sie die Spitze der Pinzette in der Lösung, um sicherzustellen, dass das Explant nicht an der Pinzette haften bleibt.Die Exemplare sind nun bereit zur Analyse von Protein oder RNA; die Exemplare können außerdem mittels Immunfluoreszenz analysiert werden. Spülen Sie die Exemplare zunächst kurz in PBS. Fixieren Sie das Gewebe durch Zugabe von 4 % Paraformaldehyd für 30 Minuten.Entfernen Sie bei Raumtemperatur das Fixativ und ersetzen Sie es durch PBS. Die fixierten Explants werden etwas steifer, wodurch sie angehoben und auf Objektträger zur Immunfärbung übertragen werden können. Geben Sie einen kleinen Tropfen PBS ohne Calcium und Magnesium auf den Objektträger, um die Positionierung des Gewebes zu erleichtern und ein Aufrollen zu verhindern. Heben Sie mit mikrochirurgischen Pinzetten den Explant vorsichtig an und legen Sie ihn in den Tropfen auf dem Objektträger, wobei Sie den Explant nicht berühren. Verwenden Sie anschließend vorsichtig einen Papierdocht, um die Flüssigkeit zu entfernen und den Explant auf dem Objektträger abzuflachen.Lassen Sie das Gewebe bei Raumtemperatur drei bis fünf Minuten an der Luft trocknen. Die Implantate sind nun bereit für die Immunfluoreszenzanalyse. Gezeigt ist hier ein Beispiel für ein mikrodisseziertes, ganzes epitheliales Explantat, das gegen NCOA3, einen Marker für Zellen, immungefärbt wurde.In den frühen Differenzierungsstadien zeigen nur die Zellen im peripheren Bereich des Epithels eine positive Färbung für diesen Proteinschnitt. Wie in diesem Protokoll beschrieben, bleibt beim peripheren Epithel ein zentrales Explant zurück, das nur wenige oder keine Zellen enthält, die und kohärent exprimieren. Dies wird durch Western-Blot-Analysen gezeigt, bei denen zentrale und periphere epitheliale Gewebe sowie kohärente Western-Blot-Analysen für GA.DH verwendet wurden, um zu bestätigen, dass die Proteinaufgaben gleichmäßig beladen waren.Der Zeitpunkt von mit der Differenzierung assoziierten Ereignissen kann durch Kultivierung zentraler Explantate über unterschiedliche Zeiträume bestimmt werden. Zentrale Explantate wurden 2, 5, 24 und 48 Stunden in Medium mit oder ohne 100 Nanogramm pro Milliliter FGF kultiviert. Die X-Explantate wurden zu den angegebenen Zeitpunkten gewonnen und zur Analyse mittels Western Blotting in SDS-Probelösungspuffer überführt.Die Ergebnisse zeigen, dass der endgültige, kohärente Proteinausdruck nach 24 bis 48 Stunden in der Kultur induziert wird. Die Western-Blot-Analyse für GA-DH zeigt, dass die Proteinproben gleichmäßig aufgetragen wurden.Immunfärbung von Zentralexplantaten, die vier Tage lang in Abwesenheit oder Anwesenheit von 100 Nanogramm pro Milliliter FGF kultiviert wurden, zeigt, dass die N-Kadherin-Immunfluoreszenz in Explantaten, die FGF ausgesetzt waren, stark erhöht ist. Die Immunfluoreszenz zeigt außerdem die subzelluläre Lokalisation von N-Kadherin an den Zell-zu-Zell-Grenzen.Wir haben Ihnen soeben gezeigt, wie man Linsenepithelzellen in Kultur vorbereitet, um die Differenzierung zu untersuchen. Der Hauptvorteil dieses Systems besteht darin, dass sich die Zellen synchron differenzieren. Dies ermöglicht es, die Abfolge der Ereignisse zu bestimmen.Außerdem können wir dem Medium spezifische Wachstumsfaktoren oder Inhibitoren hinzufügen, um bestimmte Signalwege zu aktivieren oder zu blockieren. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, darauf zu achten, Kontaminationen vorzubeugen, indem die Präparation und das sterile Medium in einer sauberen Umgebung durchgeführt werden und indem das Explantat vor der Kultivierung gründlich überprüft wird. Das war's also.Vielen Dank fürs Zuschauen. Viel Erfolg bei Ihrem Experiment. Tschüss. Tschüss.

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Biology

Biologie

Aus Stammzellen gewonnene retinale Pigmentepithelzellen (RPE) können für mehrere Anwendungen verwendet werden, einschließlich zellbasierter Therapien für Netzhautdegeneration, Krankheitsmodellierung und Medikamentenstudien. Hier stellen wir ein einfaches Protokoll zur reproduzierbaren Gewinnung von RPE aus Stammzellen vor.

Effiziente Ableitung von Retinapigmentepithel-Zellen aus Stammzellen

Angiogenese beinhaltet Interaktionen zwischen mehreren Zellen und mehreren Systemen, die in einer physiologisch relevanten Umgebung untersucht werden müssen. Das Ziel dieser Studie ist es, die Fähigkeit des Rattenmesenterienkulturmodells zu demonstrieren, Zeitraffervergleiche von intakten mikrovaskulären Netzwerken während der Angiogenese durchzuführen.

Ein<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Methode für Time-Lapse-Imaging von kultivierten Ratten Mesenteriale mikrovaskuläre Netzwerke

Wir beschreiben eine Methode um eine netzhautgewebe bestehend aus retinalen Pigment epithelialen Zellen aus menschlichen pluripotenten Stammzellen gezüchtet auf menschliche amniotic Membranen und deren Vorbereitung für die Verpflanzung in Tiermodellen zu konstruieren.

Engineering-Transplantation geeignet retinalen Pigment Epithel Gewebe abgeleitet aus humanen embryonalen Stammzellen

Wir präsentieren ein In-vitro-Modell zur Beurteilung der olfaktorischen Ensheathing Glia (OEG) neuroregenerativen Kapazität, nach neuronalen Verletzungen. Es basiert auf einer Kokultur von axotomisierten adulten retinalen Ganglion neuronen (RGN) auf OEG-Monolayer und anschließende Studie der axonalen Regeneration, durch die Analyse von RGN axonalen und somatodendritischen Markern.

Cokultur von Axotomized Rat Retinal Ganglion Neurons mit olfactory Ensheathing Glia, als In-Vitro-Modell der erwachsenen axonalen Regeneration

Das Protokoll beschreibt organotypische Explanten der Maus NeuroRetina, kultiviert zusammen mit seinem retinalen Pigment epithel (RPE), in R16 definierten Medium, frei von Serum und Antibiotika. Diese Methode ist relativ einfach durchzuführen, im Vergleich zu In-vivo-Experimenten kostengünstiger und zeitaufwändigund und kann an zahlreiche experimentelle Anwendungen angepasst werden.

Langfristige, serumfreie Kultivierung organotypischer Maus-Retina-Explanten mit intaktem retinalen Pigmentepithel

Diese Studie zielt darauf ab, ein neuartiges humanes organotypisches Netzhautkulturmodell (HORC) zu entwickeln, das eine Beeinträchtigung der Netzhautintegrität während der Behandlung mit Explanten verhindert. Dies wird erreicht, indem die Netzhaut mit dem darüber liegenden Glaskörper und dem darunter liegenden retinalen Pigmentepithel-Choroid (RPE-Choroid) und Sklera kultiviert wird.

Charakterisierung einer neuartigen humanen organotypischen Netzhautkulturtechnik

Dieses Protokoll, das ursprünglich von Fernandez-Godino et al. im Jahr 20161berichtet wurde, beschreibt eine Methode zur effizienten Isolierung und Kultur von Maus-RPE-Zellen, die innerhalb einer Woche auf Transwell-Platten eine funktionelle und polarisierte RPE-Monoschicht bilden. Das Verfahren dauert ca. 3 Stunden.

Effiziente Dissektion und Kultur der primären Maus retinalen Pigmentepithelzellen

Dieses Protokoll stellt und beschreibt Schritte zur Isolierung, Dissektion, Kultivierung und Färbung von Netzhautexplantaten, die aus einer erwachsenen Maus gewonnen wurden. Diese Methode ist als Ex-vivo-Modell für die Untersuchung verschiedener neurovaskulärer Netzhauterkrankungen wie der diabetischen Retinopathie von Vorteil.

Netzhautexplantat der adulten Mausnetzhaut als Ex-vivo-Modell zur Untersuchung neurovaskulärer Netzhauterkrankungen

Dieses Manuskript skizziert ein detailliertes Videoprotokoll für die Kultivierung von primären Linsenepithelzellen (LECs), das darauf abzielt, die Reproduzierbarkeit zu verbessern und die Forschung bei Katarakten und hinterer Kapseltrübung (PCO) zu unterstützen. Es bietet Schritt-für-Schritt-Anleitungen zur Linsendissektion, LECs-Isolierung und Validierung und dient insbesondere für Neueinsteiger auf diesem Gebiet als wertvoller Leitfaden.

Optimierung der Epithelzellkultur der Maus-Primärlinse: Ein umfassender Leitfaden zur Trypsinisierung

Wir haben ein Rattenmodell für schwere Hornhautentzündungen durch Hornhautepithelkürettage in Kombination mit Hornhautnähten entwickelt. Die Studie untersuchte Entzündungsmuster der Hornhaut, die epitheliale Proliferation und Veränderungen der limbalen Stammzellen unter entzündlichen Bedingungen.

Etablierung eines Modells für schwere Hornhautentzündungen bei Ratten auf der Grundlage einer Hornhautepithelkürettage in Kombination mit Hornhautnähten

Dieses Protokoll beschreibt die Trennung des Epithels der Maus-Augenlinse und der Volumenmasse der Faserzelle, gefolgt von der RNA-Isolierung und der qPCR-Analyse. Diese Methode ermöglicht die Trennung von Linsenzellkompartimenten für eine detailliertere Analyse des Transkriptoms und der biologischen Prozesse in Epithelzellen im Vergleich zu differenzierten Faserzellen.

RNA-Isolierung aus dem Epithel der Augenlinse der Maus und den Massenmassen von Faserzellen

Lernen Sie die Kultur von Linsenepithel-Explantaten aus Ratten für Studien zur terminalen Differenzierung. Diese Methode nutzt FGF-2 und Immunfluoreszenzmikroskopie zur Analyse von Genexpression und Signalwegen.

Vorbereitung und Kultur der Rat Linsenepithelzellen Explantate für ein Studium der terminalen Differenzierung

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