Name: Kultur der Maus Neural Stem Cell Precursors (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-02-25T00:00:00.000+00:00
Duration: 27 min 44 s
Description: Lernen Sie die Isolierung von Neuralvorläuferzellen aus dem embryonalen Kortex der Maus für die Entwicklungsbiologie. Diese Methode ermöglicht die Kultivierung von Zellen zur Untersuchung neuronaler Entwicklungsprozesse.

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<ol><li> Maus neuralen Vorläuferzellen (NPCs) aus E12.5 Embryos Cortex isoliert. </li><li> Haut-und mesenchymale Schichten wurden von seziert telencephalic Vesikel entfernt. </li><li> Die Vesikel wurden in 0,05% Trypsin mit 0,02% EDTA und 0,2% BSA in HBSS für 20 Minuten bei 37 ° C inkubiert </li><li> Trypsinierung wurde von einem gleichen Volumen von 1 mg / ml Sojabohnen-Trypsin-Inhibitor (Sigma # T6522) in HBSS gestoppt. </li><li> Tissue verdaut wurden dissoziiert über mehrere Runden Verreiben mit feuerpolierte Pasteur Pipetten. </li><li> Die Zellen wurden einmal mit 0,2% BSA in HBSS gewaschen und plattiert bei 50.000 Zellen / ml auf Laminin-beschichtete Deckgläser in Medien mit 20 ng / ml EGF, 10 ng / ml FGF2 (R &amp; D Systems oder PeproTech) und 2 ug / ml Heparin ( Sigma). </li></ol>

<ol><li>Currle, D., Cheng, X., Hsu, C., Monuki, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+and+indirect+roles+of+CNS+dorsal+midline+cells+in+choroid+plexus+epithelial+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Direct and indirect roles of CNS dorsal midline cells in choroid plexus epithelial formation.</a> Development. 132 (15), 3549-3559 (2005).</li>
<li>Flanagan, L., Rebaza, L., Derzic, S., Schwartz, P., Monuki, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+human+neural+precursor+cells+by+laminin+and+integrins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Regulation of human neural precursor cells by laminin and integrins.</a> J Neurosci Res. 83, 845-856 (2006).</li>
</ol>

Große Fortschritte in unserem Verständnis der Entwicklung des ZNS und Stammzellbiologie wurden möglich durch unsere Fähigkeit zu ernten, zu isolieren und Kultur embryonalen neuralen Stammzellen. Dieses Video zeigt die Zerlegung von E12.5 Maus Großhirnrinde und die anschließende Zerlegung und Kultivierung von embryonalen neuralen Stammzellen. Viele andere ähnliche Methoden wurden erfolgreich von anderen Forschern eingesetzt.

<table><tbody><tr><td>Gerade Iris-Scheren</td><td>Werkzeug</td><td>Fine Science Tools</td><td>14060-11</td><td></td></tr><tr><td>Mittlere Scheren</td><td>Werkzeug</td><td>Fine Science Tools</td><td>15024-10</td><td></td></tr><tr><td>Mikroscheren</td><td>Werkzeug</td><td>Fine Science Tools</td><td>15002-08</td><td></td></tr><tr><td>Abgewinkelte Pinzette</td><td>Werkzeug</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-35</td><td></td></tr></tbody></table>

kultur der maus neural stem cell precursors

Culture of Mouse Neural Stem Cell Precursors

Primäre neuronale Stammzellen Kulturen sind nützlich für die Untersuchung der Mechanismen des zentralen Nervensystems Entwicklung. Die Stammzellforschung wird unser Verständnis des Nervensystems und kann es uns ermöglichen, Therapien für bisher unheilbare Krankheiten und Verletzungen des Gehirns zu entwickeln. Darüber hinaus sollten Stammzellen für die Stammzellenforschung an die detaillierte Untersuchung von Mechanismen der neuronalen Differenzierung und Transdifferenzierung und die genetischen und umweltbedingten Signale unterstützt werden sollen, dass die direkte Spezialisierung der Zellen in bestimmten Zelltypen. Dieses Video zeigt eine Technik verwendet, um Zellen aus dem Embryonaltag 12,5 Maus dorsalen Vorderhirn aufzuschlüsseln. Die Dissektion Verfahren schließt die Gewinnung E12.5 Maus Embryonen aus der Gebärmutter, die Beseitigung der &quot;Haut&quot; mit feinen Pinzette und schließlich isoliert Stücke Großhirnrinde. Nach der Präparation wird das Gewebe verdaut und mechanisch dissoziiert. Die resuspendierten dissoziierten Zellen werden dann in &quot;Stammzelle&quot; Medien, die das Wachstum von neuralen Stammzellen bevorzugt kultiviert.

Dieses Video beschreibt die Methode zur Isolierung von neuroprecursors aus den Entwicklungsländern Kortex embryonaler Mäuse verwendet. Das Verfahren zur Entfernung von Embryonen aus der Gebärmutter, sezieren die kortikale Gewebe und verdauen die isolierten Hirnrinde dargestellt.

Kultur der Maus Neural Stem Cell Precursors

Primäre neurale Stammzellkulturen sind nützlich für die Untersuchung der Mechanismen, die der Entwicklung des zentralen Nervensystems zugrunde liegen. Die Stammzellforschung wird ...

Dies ist also der erste Schritt bei der Isolierung, Dissoziation und Kultivierung von neuralen Vorläuferzellen. Zunächst werde ich eine 24-Loch-Platte beschichten. Diese ist nicht für die Zellkultur behandelt.Ich werde es mit Laminin beschichten, damit die Zellen haften. Zuerst werde ich es mit einer Mischung aus Wasser und Poly-D-Lysin beschichten. Ich werde etwa 450 Mikroliter pro Vertiefung hinzufügen.Ich habe also die Hälfte der Platte, diese beiden Reihen hier, mit der Poly-D-Lysin-Lösung beschichtet. Anschließend werde ich sie fünf Minuten bei Raumtemperatur im Sicherheitswerkbank-Inkubator inkubieren. Die Inkubation dauert nun bereits fünf Minuten.Ich werde die PDL-Lösung hier mit einem Vakuum entfernen. Haushaltsvakuumanwendung. Nun werde ich die Vertiefungen erneut mit Wasser spülen, etwa 450 µL.Wirklich keine Inkubationszeit beim Spülen mit Wasser. Ich werde das Wasser einfach sofort abpipettieren. Nun werde ich die Laminatlösung hinzufügen.Das Laminate wird in EM-EM-Medium bei zwei Mikrogramm pro Milliliter gelöst. Ich werde also 450 Mikroliter der Laminat-Lösung zu jedem hinzufügen; im Moment beschichte ich Kunststoff. Man könnte aber auch Deckgläser in diese Vertiefungen gelegt haben.Ich werde die Zellen mindestens vier Stunden lang bei 37 Grad in einem Zellkultur-Inkubator inkubieren. Ich habe zwei feine Pinzetten, die in einem 45-Grad-Winkel gebogen sind. Außerdem habe ich eine feine Schere, die ebenfalls in einem 45-Grad-Winkel gebogen ist.Einige stumpfe Pinzetten für die anfängliche Dissektion der Gebärmutter und eine große Schere zum Zerschneiden bei der weiblichen Maus. Gut, dies ist eine CD1, normale weibliche Maus. Sie ist trächtig mit Embryonen vom embryonalen Tag 12,5.Ich habe sie bereits durch CO2-Vergasung und Halswirbelverrenkung getötet. Nun werde ich die Gebärmutter und anschließend die Embryonen entfernen. Zuerst muss ich den Bauchbereich mit 70 % Ethanol desinfizieren.Meine große Pinzette greife ich in der Mitte des Abdomens und in Richtung untere Hälfte, führe einen Schnitt durch, lege meine Instrumente ab und reiße einfach die Haut auf, wodurch ich erneut das Abdomen freilege, wobei ich an derselben Stelle anfasse. Führe einen weiteren Schnitt in der Mitte durch und schneide seitlich, um das Weibchen zu öffnen. Nun bringe ich die Embryonen zum Vorschein.Hier ist ihr mit Embryonen vergrößerter Uterus. Ich führe daher den ersten Schnitt direkt unterhalb der Eierstöcke durch, entferne entlang des Weges das Fettgewebe und ziehe nach oben. Ich lege diese Seite nach unten und greife nur zwischen den Embryonen hindurch.Offensichtlich könnte das Greifen auf die Embryonen das Gewebe beschädigen. Und das ist offensichtlich. Sie sehen aus wie eine Traube von Weintrauben.Greifen Sie erneut zwischen die Trauben, schneiden Sie auf der anderen Seite oberhalb des Fruchtknotens und entfernen Sie das Fett. Der endgültige Schnitt erfolgt hier in der Mitte. Nochmals entferne ich das Fett.Da ist der Uterus mit Embryonen. Mein Dissektionsmedium ist PBS mit 0,6 % Glucose sowie Penicillin-Streptomycin. Ich werde die Embryonen zuerst einfach im Dissektionsmedium spülen, um das Blut zu entfernen.Meine Präparation ist also sauber. Ich werde nun entlang der Länge der Gebärmutter auf der gegenüberliegenden Seite des Fettgewebes schneiden, um die Embryonen freizulegen. Wo ist das Fett?Es befindet sich auf der anderen Seite, weil man es nicht sehen kann. Hier liegt also ein freiliegender Embryo vor. Ich kann Ihnen zeigen, wie das im Mikroskop aussieht.So sieht es unter dem Mikroskop aus. Ich werde entlang dieser Seite des Uterus schneiden. Auf der gegenüberliegenden Seite befindet sich das Fettgewebe.Man sieht hier das Fett, ich kann das Fett deutlich erkennen. Ich werde also entlang der oberen Länge nach unten schneiden. Und Sie können sehen, wie die Embryonen heraustreten, während ich den Uterus weiter nach unten verlängere.Etwas weiter nördlich. Oh, da ist einer. Herrlich. Sie schneiden also entlang der Seite gegenüber den fetten Embryonen, die gerade herausspringen.Ja, das sind sie alle. Einige hier muss man manchmal zurückgehen und etwas öffnen, falls man es verpasst hat. Das ist also das Amnion oder ist das das Chorion und das, das ist das Chorion.Das Amnion befindet sich innen und ist eng mit dem Embryo verbunden. Sie können das Amnion von hier aus kaum erkennen. Sobald ich den Embryo herausgenommen habe, werden Sie sehen, dass diese kleiner sind, und ich werde diese nicht verwenden.Doch, jetzt liegen alle Embryonen frei. Nun habe ich hier die freigelegten Embryonen vorliegen. Ich werde die Schichten vom Embryo ablösen und den Embryo anschließend in eine saubere Schale überführen, um die feine Präparation durchzuführen.Also gibt es die erste Schicht. Sobald ich diese entfernt habe, suche ich normalerweise nach der Nabelschnur. Das ist ein ziemlich zähes Gewebe.Und ich kann das Tier tatsächlich mit der Nabelschnur anheben. Genau dort. Können Sie darauf zeigen?Ja, genau dort. Sehen Sie, ja, das rote Gefäß, das merkwürdige Ding. Ja. Das ist die Nabelschnur, und sie ist am Bauch befestigt. Ich greife normalerweise einfach hinein und packe sie. So, jetzt werde ich die Haut vom Kopf des Embryos entfernen. Dadurch wird der Zerebralkortex freigelegt, wo ich die Zellen entnehmen werde.Also werde ich mit meiner linken Hand einfach durch die Rückseite des Embryos stechen, um ihn genau so festzuhalten. Ich halte ihn gegen den Boden der Platte gedrückt. Mit meiner rechten Hand werde ich nun mit der Pinzette unter das Auge, unter die Haut fahren, diese durchstechen und dann abreißen.Jetzt habe ich hier eine Kante, die ich greifen kann. Gut. Und dann greife ich mit den anderen vier Fingern die gegenüberliegende Kante und ziehe die Haut ab, wobei normalerweise das darunterliegende Mesenchym mitabgelöst wird. Nun können Sie die rechte Hemisphäre freigelegt sehen, ein Mal nach Norden.Ich werde das Embryo umdrehen und versuchen, eine andere Kante zu fassen. Hier ist also eine weitere Hautkante. Umdrehen und weiter schälen.So, jetzt wird das Großhirn freigelegt. Ich werde nun einfach den Kopf abquetschen, um eine bessere Position zum Entfernen von Teilen des Großhirns zu erhalten.Ich greife also einfach mit meiner Pinzette zu, reibe mit der anderen Pinzette darunter und schneide es ab. Und hier ist eine dorsale Ansicht. Hier können Sie eine dorsale Ansicht des Vorderhirns sehen, der beiden Hemisphären der Großhirnrinde, des Diencephalons und dann in diesem Bereich das Mittelhirn.Hier wird die Entnahme der Gewebestücke für die neuronale Stammzellkultur durchgeführt. Nun halte ich das Embryo mit der linken Pinzette fest, um es in dieser Weise zu fixieren. Dadurch erhalte ich eine günstige Position und einen geeigneten Winkel, um Stücke des Cortex auszuschneiden.Jetzt gehe ich mit meinem feinen Skalpell vor und schneide einfach die vordere Großhirnrinde wie folgt ab. Ich schaffe mir eine Öffnung, um den seitlichen Schnitt anzulegen, und führe einen Schnitt nahe der dorsalen Mittellinie durch, vermeide dabei jedoch die Zellen der Mittellinie, um die Neurovorläuferzellen oder Neuropräkursoren, die im Kortex liegen, gezielt zu isolieren. Dies ist also ein Stück aus der Großhirnrinde.Und wie Sie sehen können, befindet sich hier auf der rechten Seite eine Verdickung. Das ist tatsächlich der Beginn der lateralen GIC-Eminenz, den wir in unserer Präparation nicht benötigen, da wir uns für die Vorläuferzellen des dorsalen Kortex interessieren. Daher werde ich diese einfach abschneiden.Ich überlasse Ihnen nur Zellen aus dem dorsalen Kortex. Jetzt gehe ich zur anderen Seite über. Gleiche Methode.Es ist etwas umständlicher, da ich rechts-handed bin, aber machen Sie erneut den vorderen Schnitt und führen Sie die Schere in das Loch ein. Schneiden Sie entlang der dorsalen Seite, der lateralen Seite. Dieses Mal werde ich versuchen, die ganglionäre Manik zu vermeiden.Hier sind also die beiden Stücke aus den Hemisphären des dorsalen Kortex. Nun werde ich eine abgeschnittene P-1000-Pipettenspitze verwenden, um die Kortizes in ein 15-ml-Konischgefäß zu überführen, das Dissektionsmedium enthält, in dem sie verbleiben, während ich den Rest des Wurfes dissekiere. Ich sauge jetzt einfach ein Stück auf.Jetzt übertrage ich die Kortizes aus der Schale in das 15-ml-Kegelröhrchen, das Dissektionsmedium enthält, wo sie verbleiben, während ich den Rest des Wurfes dissekiere. Ich habe den gesamten Wurf dissekiert und werde nun das überschüssige Dissektionsmedium abpipettieren, wobei eine geringe Menge Flüssigkeit und die Kortizes zurückbleiben. Nun werde ich etwa 500 Mikroliter Trix und EDTA hinzufügen und das Röhrchen für 20 Minuten in ein 37 °C warmes Wasserbad stellen.Nach der 20-minütigen Inkubation gebe ich 500 Mikroliter Sojabohnen-Trypsininhibitor hinzu. Nun werde ich die Zellen mechanisch aufbrechen oder dissoziieren, indem ich eine flammenglasierte Pasteurpipette mit sehr geringem Durchmesser verwende. Ich möchte nicht allzu viele Luftblasen einführen, aber falls dies geschieht, ist das ebenfalls in Ordnung.Sie gehen etwa fünf bis zehn Mal auf und ab, und die Zellen sollten sich zu einer Wolke verteilen. Nun werde ich die Zellen bei 1000 U/min und 25 Grad für eine Minute zentrifugieren. Nach dem Zentrifugieren entferne ich die überschüssige Flüssigkeit durch Absaugen, wobei ein kleines, kaum sichtbares Pellet zurückbleibt.Es sieht aus wie ein kleiner SA-Abstrich am Boden dieses kegelförmigen Reaktionsgefäßes. Ich glaube, nur eine kleine Menge Flüssigkeit, wobei ich sehr vorsichtig bin, um das Pellet nicht abzusaugen. Offensichtlich gebe ich jetzt Waschlösung zum Pellet hinzu.In Ordnung, ein weiterer Schritt bei 1.000 U/min, 25 Grad für eine Minute. Auch diesmal werde ich die überschüssige Flüssigkeit abpipettieren, wobei nur das Zellpellet und eine sehr geringe Menge Flüssigkeit nach dem Abpipettieren verbleiben. Ich werde nun mein gewünschtes Wachstumsmedium mit Wachstumsfaktoren hinzufügen.Abhängig natürlich vom jeweiligen Kulturversuch variiert das Volumen, das ich hinzufüge, je nach Anzahl und Alter der präparierten Embryonen. Typischerweise können für einen gesamten Wurf von E12,5-Embryonen bis zu etwa 700 Mikroliter hinzugegeben werden. In diesem Fall werde ich etwa 300 Mikroliter hinzufügen, um meine Zellen etwas stärker zu konzentrieren, bevor ich meine lamininbeschichtete Platte aus dem Inkubator nehme.Es sind mindestens vier Stunden vergangen. Nun werde ich das Laminatmedium abaspirieren. Anschließend führe ich eine Spülung mit meinem Wachstumsmedium durch.Ich spüle mit etwa 300 Mikrolitern und werde anschließend aspirieren und 400 Mikroliter des Wachstumsmediums hinzufügen. Ich habe meine Zellen mit einem Hema-Zytometer gezählt und werde etwa 100.000 Zellen pro Vertiefung ausplattieren. In dieser 24-Loch-Platte.Jedes Experiment erfordert eine unterschiedliche Anzahl von Zellen pro Vertiefung. Für meinen speziellen Assay hat sich eine Menge von 100.000 Zellen bewährt. Ich gebe die Zellen in den Zellkultur-Inkubator bei 37 Grad und 5 % CO2 und lasse sie etwa einen Tag lang kultivieren.Sie heften sich an die Laminatbeschichtung und breiten sich innerhalb von 24 Stunden aus. Ich werde je nach meinem spezifischen Assay die gewünschten Wachstumsfaktoren hinzufügen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Hier zeigen wir unsere Methode zur Maus epidermalen Neuralleiste Stammzellen (EPI-NCSC) zu isolieren. Technik beinhaltet Mikro-Sezieren Whisker Follikel, die Isolierung des Bulge und Silber reflektiert sie in Gewebekultur. EPI-NCSC beginnen mit Ausbuchtung Explantate auf das Substrat innerhalb von 3 auswandern - 4 Tage.

Maus Epidermal Neural Crest Stem Cell (EPI-NCSC) Kulturen

Dieses Video-Protokoll zeigt die Anwendung der Neurosphäre Assay für die Isolierung und Expansion von neuronalen Stammzellen, die aus den Ganglien-Eminenzen der embryonalen Tag 14-Maus-Gehirn.

Gründung Embryonale Maus Neural Stem Cell Culture Mit dem Neurosphäre Assay

Isolierung von embryonalen Neuralleiste vom Neuralrohr erleichtert die Verwendung...

Isolierung und Kultivierung von Zellen der Neuralleiste aus embryonalen murinen Neuralrohr

Dieses Video zeigt ein detailliertes Protokoll zur Isolierung der lateralen Ventrikelwände aus dem erwachsenen Mausgehirn und zur Durchführung einer enzymatischen Gewebedissoziation, um einzelne Zellen zu erhalten. Diese Zellen werden dann spezifischen Kulturbedingungen ausgesetzt, die die Proliferation von neuralen Stammzellen selektiv fördern und ihre Differenzierung in Co-Kulturen von Oligodendrozyten und Astrozyten fördern.

Gewinnung einer gemischten Oligodendrozyten- und Astrozytenkultur aus adulten neuralen Stammzellen der Maus

Dieses Video demonstriert eine Methode zur in vitro Erzeugung von neuralen Vorläuferzellen (NPCs) aus embryonalen Stammzellen (mESCs) der Maus. Die mES-Zellen werden in Suspension kultiviert, um Embryoidkörper (EBs) zu bilden, die dann durch Retinsäurebehandlung in einer adhärenten Kultur zur Differenzierung in NPCs geführt werden.

Eine Technik zur Erzeugung neuraler Vorläuferzellen aus embryonalen Stammzellen der Maus

Hier beschreiben wir eine detaillierte Protokoll für die gleichzeitige Erzeugung von neuralen Vorläuferzellkulturen, entweder als Mono-oder haftNeuroSphären, aus der Subventrikularzone und Gyrus dentatus der einzelnen erwachsenen Mäusen.

Eine Maus, zwei Kulturen: Isolierung und Kultur von adulten neuralen Stammzellen aus dem Zwei Neurogene Zonen der einzelnen Mäuse

Dieses Protokoll beschreibt detailliert die Methode zur Erzeugung von neuralen Vorläuferzellen aus embryonalen Stammzellen unter Verwendung einer serumfreien Monolayer-Methode. Diese Vorläuferzellen können verwendet werden, um reife neuronale Zelltypen abzuleiten oder den Prozess der neuronalen Spezifikation zu untersuchen, und sind für die Skalierung im Multiwell-Format für das Screening von Verbindungen zugänglich.

Neuronale Differenzierung von embryonalen Stammzellen der Maus in Serum-freiem Monolayer-Kultur

Die Etablierung von Kultursystemen für die Expansion adulter neuraler Stammzellen (aNSCs) ermöglicht die Untersuchung und Anwendung von aNSCs für die Therapie. Die subkallosale Zone (SCZ) wurde kürzlich als neuartige Neuroblasten-bildende Region bei erwachsenen Mäusen erkannt. Hier werden Methoden zur Isolierung, Expansion und Differenzierung von SCZ-aNSCs beschrieben.

Isolierung und Kultur von adulten neuralen Stammzellen aus der Maus subcallosa Zone

Hier stellen wir eine neuartige mikrochirurgische Technik für die Isolierung von neuralen Stammzellen aus E13 Maus Embryo ganglionic Eminenz.

Isolation und Kultur der embryonalen Maus neurale Stammzellen

Wir beschreiben das Verfahren zur In-vitro-Differenzierung von embryonalen Stammzellen der Maus in neuronale Zellen mit der Hanging-Drop-Methode. Darüber hinaus führen wir eine umfassende phänotypische Analyse durch RT-qPCR, Immunfluoreszenz, RNA-seq und Durchflusszytometrie durch.

Differenzierung und Charakterisierung neuronaler Vorläufer und Neuronen aus embryonalen Stammzellen der Maus

Lernen Sie die Isolierung von Neuralvorläuferzellen aus dem embryonalen Kortex der Maus für die Entwicklungsbiologie. Diese Methode ermöglicht die Kultivierung von Zellen zur Untersuchung neuronaler Entwicklungsprozesse.

Kultur der Maus Neural Stem Cell Precursors

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