Reinigung von spezifischen Zellpopulation durch Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)

Hallo, ich bin Hope Campbell, Spezialistin für Durchflusszytometrie am Blood Research Institute des Blood Center of Wisconsin. Hallo, ich bin STR Baso, Doktorand im Labor von Dr. Bonnie Dieter. Ich bin ebenfalls am Blood Research Institute des Blood Center of Wisconsin tätig.

Heute werden wir eine Methode zur Isolierung von Zellen mittels fluoreszenzaktivierter Zellsortierung durchführen. In einem Labor verwenden wir dieses Verfahren, um die Funktion von Lymphozyten und myeloischen Zellpopulationen zu untersuchen. Beginnen wir.

Bei diesem Verfahren werden B- und CD4-T-Zellen aus Mauszellen gereinigt. Die Ausgangszahl der Zielzellen sollte basierend auf der benötigten Zellenanzahl und der Wiederfindungsrate des Geräts bei Verwendung dieser Methode berechnet werden. Die typische Wiederfindungsrate für B- und CD4-T-Zellen liegt bei 85 bis 90 %. Die Ausgangspopulation der SP-Zellen besteht zu etwa 60 bis 70 % aus B-Zellen und zu 20 bis 30 % aus T-Zellen.

Somit können Sie bei einem Ausgangsvolumen von 100 mal 10 hoch 6 Zellen 50 bis 60 Millionen B-Zellen und 20 bis 30 Millionen T-Zellen vor Beginn der FACS-Analyse gewinnen. Die für das Protokoll benötigten Lösungen und Reagenzien sollten auf Eis gebracht werden. Dazu gehören ein Färbepuffer, bestehend aus phosphatgepufferter Kochsalzlösung mit 3 % Fötales Rinderserum, ein Suspensionspuffer, bestehend aus 25 Millimolar HEPES in Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) mit 3 % Fötales Rinderserum, eine 25 Millimolar Hepes-B-Lösung in Fötales Rinderserum, Färbeantikörper und Kompensationsperlen.

Dieses Protokoll erfordert außerdem die folgenden Hilfsmittel und Reagenzien. Konische 15-Milliliter-Röhrchen, 12 mal 75 Millimeter große Polystyrol- oder Polypropylen-Flussröhren. Ein Nylon-Zellsieb, Trypanblau und ein Hämozytometer sowie Sortier- und Sammelröhrchen sollten ebenfalls im Voraus vorbereitet werden, um dies durchführen zu können.

Gebe 300 Mikroliter der HEPES FCS-Lösung in Fließröhren oder ein Milliliter der HEPES FCS-Lösung in 15-Milliliter-Konischröhren. Diese sollten gekühlt auf Eis gehalten werden, bis der Sammelprozess beginnt. Beginnen Sie mit der Herstellung einer Einzelzell-Suspension der gewünschten Zellpopulation.

Wenn die mit diesem Verfahren isolierten Zellen kultiviert werden sollen. Die gesamte Zellpräparation sollte in einer Zellkulturbank durchgeführt werden. Unter Verwendung steriler Technik die Zellen einmal mit eiskaltem Färbepuffer waschen und durch mehrmaliges Umstülpen des Röhrchens die Zellen resuspendieren.

Anschließend die Zellen sieben bis acht Minuten bei etwa 250 ×g und 4 °C zentrifugieren. Die Waschbedingungen können je nach Zelltyp und -konzentration variieren. Für Zellen waschen Sie bis zu 200 × 10⁶ Zellen mit 10 Milliliter Markierungspuffer.

Entfernen Sie vorsichtig den Überstand durch Absaugen, sodass das Zellpellet intakt bleibt. Resuspendieren Sie die Zellen anschließend in eiskaltem Färbe-Puffer in einer Konzentration von bis zu 50 × 10⁶ pro 100 µl. Lösen Sie das Zellpellet durch vorsichtiges Klopfen oder sanftes Vortexen des Röhrchens.

Überführen Sie anschließend 0,25 bis 1 × 10⁶ Zellen in ein neues 12 × 75 mm großes Polystyrol- oder Polypropylen-Flussröhrchen auf Eis. Stellen Sie dieses beiseite, um es später als unbelastete Kontrollprobe zu verwenden. Geben Sie in das erste Röhrchen primäre Antikörper zur Zellsuspension, um die gewünschte Endkonzentration zu erreichen. Hier werden mit PE-Texas-rot konjugierte anti-B220-Antikörper zur Färbung von B-Zellen verwendet, während mit ZI konjugierte anti-TCR-β- und/oder mit 700 konjugierte anti-CD4-Antikörper zur Färbung von T-Zellen dienen. Mischen Sie durch leichtes Antippen des Röhrchenbodens oder durch vorsichtiges Schwenken.

Vortexen Sie die Zellen, stellen Sie sie dann auf Eis und inkubieren Sie sie 20 bis 30 Minuten im Dunkeln. Nach der Inkubation waschen Sie die markierten Zellen durch Resuspendierung in 10 Milliliter eiskaltem Suspensionspuffer und zentrifugieren wie zuvor. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand. Wiederholen Sie diesen Schritt, um die Zellen ein zweites Mal zu waschen.

Schließlich die Zellen in eiskaltem Suspensionspuffer resuspendieren. Wenn die primären Antikörper nicht direkt mit einem Fluorophor konjugiert sind, markierte sekundäre Antikörper oder Strep AVID im Konjugat zur Zellsuspension hinzufügen und die Zellen erneut 20 bis 30 Minuten lang im Dunkeln auf Eis inkubieren. Die Zellen zweimal mit eiskaltem Suspensionspuffer waschen.

Nach dem Resuspendieren der Zellen in eiskaltem Suspensionspuffer. Bestimmen Sie die Zellkonzentration und -viabilität mithilfe eines vitalen Farbstoffs wie Trypanblau und eines Hämozytometers. Stellen Sie die Zellkonzentration auf 10 bis 20 × 10⁶ Zellen pro Milliliter ein, indem Sie Suspensionspuffer hinzufügen, um ein Verstopfen des Sortiergeräts durch Zellaggregate zu vermeiden, die während der Isolierung abgestorben sein könnten.

Verfahren und Färbung. Filtern Sie die Zellen unmittelbar vor Beginn des Sortierprotokolls durch ein Trichtersieb. Die Porengröße des Siebs sollte je nach Zelltyp gewählt werden; für Zellen wird ein Sieb mit einer Porengröße von 40 Mikrometer verwendet.

Sammeln Sie die gefilterten Zellen in einem kegelförmigen 15-Liter-Gefäß oder in 12 mal 75 Millimeter großen Durchflussröhren, abhängig vom Volumen. Stellen Sie die Zellen auf Eis, während das Cytometer für den Sortiervorgang eingerichtet wird. Wenn BD-Kompensationsperlen als einfarbige positive Kontrollen verwendet werden, bereiten Sie je eine Kontrollröhre für jede im Assay verwendete Farbe sowie eine unbelastete negative Kontrollröhre vor.

Nach gründlichem Vortexen der Bead-Suspensionen jeweils einen Tropfen der negativen und positiven Bead-Suspensionen zu 100 Mikroliter Suspensionspuffer für jede verwendete Farbe und die negative Kontrolle hinzufügen. Anschließend je einen Mikroliter des markierten Antikörpers zu jedem positiven Kontrollröhrchen zugeben. In diesem Experiment wird ein Röhrchen unter Verwendung von PE Texas'Red B zwei 20 Antikörpern vorbereitet.

Einmal mit ETCR-Beta-Antikörpern und einmal mit LOR-700-CD4-Antikörpern, die durch Vorsichtiges Antippen des Röhrchenbodens gemischt werden; 15 bis 30 Minuten im Dunkeln bei Raumtemperatur inkubieren. Die Kügelchen einmal mit zwei Millilitern Färbe-Puffer waschen und bei 200 × g 10 Minuten zentrifugieren. Den Überstand durch Absaugen entfernen und das Kügelchenpellet in 200 bis 500 Mikrolitern Färbe-Puffer resuspendieren.

Die Pufferkonfiguration des Durchflusszytometers variiert je nach Hersteller und sollte nur von entsprechend geschultem Personal durchgeführt werden. Das Zellsortierverfahren hier wird mit dem BD defects aria durchgeführt. Wählen Sie vor der Sortierung die geeignete Düse in Abhängigkeit vom zu sortierenden Zelltyp aus.

Die verfügbaren Größen für die FACS-Aria betragen 70 Mikrometer, 100 Mikrometer und 130 Mikrometer. Die Düsenöffnung sollte mindestens das Dreifache der Größe der zu sortierenden Zelle betragen; für Lymphozyten wird daher die 70-Mikrometer-Düse gewählt. Eine aseptische Zellsortierung kann mithilfe der aseptischen Sortieroption des Geräts durchgeführt werden.

Mit dieser Option wird der gesamte Mantelweg gemäß den Anweisungen des Herstellers mit 70 %igem Ethanol dekontaminiert. Stellen Sie sicher, dass Sie die Mantelfilter ersetzen und PBS durch steriles PBS austauschen. Sobald das Durchflusszytometer betriebsbereit ist, stellen Sie die vorab gekühlten Sammelröhrchen, die hohe Mengen FCS enthalten, in die entsprechende Sammeleinrichtung.

Verfügbare Sammelgefäße können bis zu zwei kegelförmige 15-Milliliter-Röhrchen, vier 12 × 75-Millimeter-Röhrchen oder vier Mikroröhrchen aufnehmen. Verwenden Sie 12 × 75-Millimeter-Röhrchen zum Sammeln von weniger als 1,5 × 10⁶ Zellen und 15-Milliliter-Kegelröhrchen zum Sammeln von 1,5 × 10⁶ bis 4,5 × 10⁶ Zellen.

Platzieren Sie das geeignete Sammelgefäß in die Sortier-Sammelkammer. Leiten Sie die Seitenströme für Mehrfarbsortierungen in das installierte Sammelgefäß. Das Durchflusszytometer muss zunächst kalibriert werden, um den spektralen Überlappungseffekt zwischen den Detektoren auszugleichen.

Das hier gezeigte Beispiel veranschaulicht die Überlappung zwischen den Emissionsspektren von FIT E und PE. Diese in der dunkel schattierten Fläche dargestellte Überlappung wird als Spillover bezeichnet. Hier würde der PE-Spillover im FIT E-Kanal und der FIT E-Spillover im PE-Kanal detektiert werden.

Dieser Spillover muss korrigiert werden, um die Restfluoreszenz eines Farbstoffs in einem anderen Kanal zu eliminieren. Der Vorgang der Korrektur des Spillvers ist als Kompensation bekannt, um eine manuelle Kompensation durchzuführen. Verwenden Sie Zytometriesoftware, um eine Vorlage einzurichten, die ein bivariates Diagramm zur Anzeige des Vorwärtsstreulichts (FSC) und des Seitwärtsstreulichts (SSC) sowie ein Histogramm für jeden verwendeten Farbstoff enthält.

Die Methode zur Einrichtung dieser Diagramme variiert je nach Software. Platzieren Sie das Negativkontroll-Rohr in die Ladeöffnung des Durchflusszytometers und beginnen Sie mit der Datenaufnahme, während die Probe durchläuft. Stellen Sie FSC und SSC so ein, dass die Population von Interesse im sichtbaren Bereich liegt.

Danach die Fluoreszenz-PMT-Einstellungen anpassen, um die negative Population oder Autofluoreszenz im äußersten linken Bereich des Histogramms darzustellen. Das negative Kontrollröhrchen aufzeichnen. Das negative Kontrollröhrchen aus der Ladeöffnung des Durchflusszytometers entfernen und durch das erste positive Kontrollröhrchen ersetzen.

Beginnen Sie nun mit der Datenaufnahme. Wiederholen Sie diesen Vorgang für jedes der positiven Kontrollröhrchen und nehmen Sie die Daten für jedes Röhrchen auf. Zeichnen Sie für jede positive Kontrolle ein Intervalltor oder ein Rechteck um die auf dem Histogramm erfassten Ereignisse.

Zeichnen Sie dann ein weiteres Intervalltor im negativen Bereich des Histogramms. Berücksichtigen Sie bei der manuellen Kompensation jeden im Experiment verwendeten Farbstoff, indem Sie den Median der Positiven so anpassen, dass er dem Median der Negativen entspricht. Um den Median anzupassen, verändern Sie die Werte der spektralen Überlappung entweder nach oben oder unten, bis die Mediane jedes fluoreszierenden Parameters so genau wie möglich übereinstimmen.

Unter Verwendung der Einstellungen, die mit den positiven und negativen Kontrollproben festgelegt wurden, bereiten Sie den Sortiervorgang vor, indem Sie die Gating-Einstellungen für die Versuchsprobe bestimmen. Platzieren Sie die Röhre mit den zu sortierenden Zellen in die Ladeöffnung des Durchflusszytometers und beginnen Sie die Datenaufnahme mit einer Geschwindigkeit von neun bis 10.000 Ereignissen pro Sekunde. Wählen Sie ein Punktediagramm aus, um Streuung in Vorwärtsrichtung gegen Seitwärtsstreuung darzustellen.

Der Vorwärtsstreulichtsignal ist ein allgemeiner Indikator für die Zellgröße und wird auf der X-Achse abgetragen, während das Seitwärtsstreulichtsignal ein Indikator für die Zellgranularität ist und auf der Y-Achse abgetragen wird. Gehen Sie nun zur Auswahl der Population von Interesse über. Sobald die Gatter definiert sind, überprüfen Sie, ob die Temperatur des Ladeports des Durchflusszytometers auf vier Grad Celsius eingestellt ist.

Bringen Sie dann das Probengefäß in die Ladeöffnung ein. Drücken Sie die Sortieroption und beginnen Sie die Datenerfassung; Sammelgefäße sollten auf Eis gestellt werden, sobald sie befüllt sind. Setzen Sie das Sortieren fort, bis die gewünschte Anzahl an Zellen gesammelt wurde oder bis das Probengefäß leer ist.

Stoppen Sie dann die Sortierung, indem Sie erneut die Sortiertaste auswählen, und entfernen Sie die Probe aus dem Ladeanschluss. Danach setzen Sie das Samplenröhrchen direkt auf den Ladeanschluss des Zytometers und erfassen 500 bis 1000 Ereignisse. Unter Verwendung derselben Einstellungen wie für die T-Zell-Sortierung erhöhte sich die Reinheit von 21 auf 99 %. Für B-Zellen stieg der anfängliche B-Zell-Anteil von 5 % nach der Sortierung auf 98 %.

Wir haben Ihnen soeben gezeigt, wie man B- und T-Zellpopulationen von Zellen mittels FACS reinigt. Denken Sie daran, dass FACS verwendet werden kann, um jede Zellpopulation zu reinigen, sofern eine Einzelzell-Suspension erzeugt werden kann und geeignete Antikörper verfügbar sind. Außerdem können Zellen, die genetisch mit fluoreszierenden Markern ausgestattet sind, problemlos ohne Verwendung von Antikörpern gereinigt werden.

Denken Sie außerdem immer daran, die geeigneten Kontrollen für Ihre Experimente zu verwenden, und überprüfen Sie stets Ihre Konfiguration der Durchflusszytometrie-Laser, um sicherzustellen, dass Sie die richtigen Fluorochrome einsetzen. Achten Sie zudem darauf, geeignete Tore zu verwenden, sodass diese korrekt um Ihre Zellpopulationen liegen. Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.