Reinigung von spezifischen Zellpopulation durch Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)

Hallo, ich bin Hope Campbell von der Spezialistin für Durchflusszytometrie vom Blutforschungsinstitut am Blood Center of Wisconsin. Hallo, ich bin STR Baso, ein Doktorand im Labor von Dr. Bonnie Dieter. Ich bin auch am Blutforschungsinstitut des Blutzentrums von Wisconsin.

Heute werden wir ein Verfahren durchführen, bei dem Zellen mit Hilfe der fluoreszenzaktivierten Zellsortierung isoliert werden. Wir verwenden dieses Verfahren in einem Labor, um die Funktion von Lymphozyten und myeloischen Zellpopulationen zu untersuchen. Fangen wir an.

In diesem Verfahren werden B- und CD-Zellen vier T-Zellen aus Mauszyten aufgereinigt. Die Startanzahl der Zielzellen sollte auf der Grundlage der Anzahl der benötigten Zellen und der Wiederherstellungsrate der Maschine mit dieser Methode berechnet werden. Die typische Wiederfindungsrate für B- und CD-Vier-T-Zellen beträgt 85 bis 90 %Die anfängliche SP-Zytenpopulation beträgt etwa 60 bis 70 % B-Zellen und 20 bis 30 % T-Zellen.

Wenn Sie also mit 100 mal 10 bis sechs Zellen beginnen, können Sie 50 bis 60 Millionen B-Zellen und 20 bis 30 Millionen T-Zellen zurückgewinnen, bevor Sie mit den Fakten beginnen. Die für das Protokoll benötigten Lösungen und Reagenzien sollten auf Eis gelegt werden. Dazu gehören Färbepuffer, bestehend aus phosphatgepufferter Kochsalzlösung mit 3 %igem fötalem Kälberserumsuspensionspuffer, bestehend aus 25 millimolaren HEPs, hergestellt in Hanks ausgewogener Salzlösung, oder HBSS, bestehend aus 3 %fötalem Kälberserum A, 25 millimolare Hep B-Lösung, hergestellt in fötalem Kälberserum, Färbekörpern und Kompensationskügelchen.

Für dieses Protokoll sind auch die folgenden Verbrauchsmaterialien und Reagenzien erforderlich: 15 Milliliter konische Röhrchen, 12 x 75 Millimeter große Durchflussröhrchen aus Polystyrol oder Polypropylen. Zu diesem Zweck sollten auch ein Nylon-Zellsieb Trien Blue und ein Hämozytometer für die Sortierung von Sammelröhrchen im Voraus vorbereitet werden.

Bei 300 Mikrolitern der he's FCS-Lösung auf Fließröhrchen oder einem Milliliter der HEPs FFC S-Lösung auf 15 Milliliter konische Röhrchen. Diese sollten bis zum Beginn des Sammelvorgangs auf Eis gelegt werden. Beginnen Sie mit der Erzeugung einer Einzelzellsuspension der gewünschten Zellpopulation.

Wenn die Zellen isoliert werden, wird mit diesem Verfahren kultiviert. Die gesamte Zellvorbereitung sollte in einer Gewebekulturhaube durchgeführt werden. Waschen Sie die Zellen mit steriler Technik einmal, fügen Sie eiskalte Färbepuffer und Wiederbelebung hinzu und suspendieren Sie die Zellen, indem Sie das Röhrchen mehrmals umdrehen.

Dann zentrifugieren Sie die Zellen sieben bis acht Minuten lang bei etwa 250 GS vier Grad Celsius. Die Waschbedingungen können je nach Zelltyp und Konzentration variieren. Bei Zyten bis zu 200 mal 10 bis zu den sechs Zellen mit 10 Millilitern Färbepuffer waschen.

Entfernen Sie den Überstand vorsichtig durch Aspiration, so dass das Zellpellet intakt bleibt. Anschließend werden die Zellen in eiskaltem Färbepuffer in einer Konzentration von bis zu 50 mal 10 bis zum Sechstel pro 100 Mikroliter resuspendiert. Resuspendieren Sie das Zellpellet, indem Sie das Rohr schnippen oder leicht wirbeln.

Übertragen Sie dann 0,25 bis eins mal 10 der sechs Zellen in ein neues 12 mal 75 Millimeter großes Durchflussrohr aus Polystyrol oder Polypropylen auf Eis. Legen Sie diese beiseite, um sie später als ungefärbte Kontrollprobe in das erste Röhrchen zu verwenden, und fügen Sie der Zellsuspension Primärantikörper hinzu, um die gewünschte Endkonzentration zu erreichen. Hier werden die roten konjugierten Anti-B-20-Antikörper von PE Texas zur Färbung von B-Zellen verwendet, während ZI-konjugierte Anti-TCR-R-Beta- und/oder 700-konjugierte Anti-CD-4-Antikörper zur Färbung von T-Zellen verwendet werden, die durch Schnippen am Boden des Röhrchens oder durch Licht gemischt wurden.

Anschließend werden die Zellen auf Eis gelegt und 20 bis 30 Minuten im Dunkeln inkubiert. Nach der Inkubation werden die markierten Zellen mit Resus gewaschen und wie zuvor in 10 Millilitern eiskalter Suspension, Puffer und Zentrifusion suspendiert, nachdem der Überstand vorsichtig entfernt wurde. Wiederholen Sie diesen Schritt, um die Zellen ein zweites Mal zu waschen.

Zum Schluss resuspendieren Sie die Zellen in eiskaltem Suspensionspuffer. Wenn die primären Antikörper nicht direkt an ein Fluoro-Four konjugiert sind, fügen Sie markierte Sekundärantikörper oder Streptokokken-AVID in Konjugat zur Zellsuspension hinzu und inkubieren Sie die Zellen nach der Inkubation erneut 20 bis 30 Minuten lang im Dunkeln auf Eis. Waschen Sie die Zellen zweimal mit eiskaltem Suspensionspuffer.

Nach der Reanimation werden die Zellen in eiskaltem Suspensionspuffer suspendiert. Bestimmen Sie die Zellkonzentration und Lebensfähigkeit mit einem lebenswichtigen Farbstoff wie Trianblau und Hämozytometer. Stellen Sie die Zellkonzentration auf 10 bis 20 mal 10 bis sechste Zellen pro Milliliter ein, indem Sie Suspensionspuffer hinzufügen, um zu vermeiden, dass das Faxgerät mit Zellclustern verstopft wird, die während der Isolierung möglicherweise abgestorben sind.

Verfahren und Färbung. Filtern Sie die Zellen unmittelbar vor Beginn des Sortierprotokolls durch ein Tropfsieb. Die Porengröße des Siebes sollte je nach Zelltyp gewählt werden, für Cyten wird ein Sieb mit einer Porengröße von 40 Mikrometern verwendet.

Sammeln Sie die gefilterten Zellen je nach Volumen in einem konischen 15-Liter-Röhrchen oder 12 x 75 Millimeter großen Durchflussröhrchen. Und legen Sie die Zellen auf Eis, während das Zytometer für den Sortiervorgang eingerichtet wird. Wenn Sie BD-Comp-Kügelchen als einfarbige Positivkontrollen verwenden, bereiten Sie ein Kontrollröhrchen für jede im Assay verwendete Farbe sowie ein ungefärbtes Negativkontrollröhrchen vor.

Nachdem Sie die Bead-Suspensionen gründlich vortexiert haben, fügen Sie eine hinzu und lassen Sie jede der negativen und positiven Bead-Suspensionen auf einen 100-Mikroliter-Suspensionspuffer für jede verwendete Farbe und die Negativkontrolle fallen. Geben Sie anschließend einen Mikroliter des markierten Antikörpers in jedes Positivkontrollröhrchen. In diesem Experiment wird ein Röhrchen mit PE Texas'Red B zwei 20-Antikörpern hergestellt.

Einer mit fitten ETCR-Beta-Antikörpern und einer mit lor 700 CD vier Antikörper, die durch Schnippen des Bodens der Röhrchen gemischt und 15 bis 30 Minuten im Dunkeln bei Raumtemperatur inkubiert werden. Waschen Sie die Kügelchen einmal mit zwei Millilitern Fleck, puffern Sie sie und zentrifugieren Sie sie 10 Minuten lang bei 200 g. Entfernen Sie den Überstand durch Aspiration und resuspendieren Sie das Kügelchen in einer Färbung von 200 bis 500 Mikrolitern.

Die Puffereinrichtung des Durchflusszytometers variiert je nach Hersteller und sollte nur von entsprechend geschultem Personal durchgeführt werden. Die Zellsortierung wird hier mit Hilfe der BD-Defekt-Arie durchgeführt. Wählen Sie vor dem Sortieren die passende Düse je nach zu sortierendem Zelltyp aus.

Die verfügbaren Größen für die Faktenaria sind 70 Mikrometer, 100 Mikrometer und 130 Mikrometer. Die Düsengröße sollte mindestens dreimal so groß sein wie die Zelle, die nach Lymphozyten sortiert werden soll, wobei die 70-Mikrometer-Düse gewählt wird. Die aseptische Zellsortierung kann mit der aseptischen Sortieroption des Geräts durchgeführt werden.

Bei dieser Option wird der gesamte Mantelweg gemäß den Anweisungen des Herstellers mit 70 % Ethanol dekontaminiert. Achten Sie darauf, die Mantelfilter auszutauschen und PBS durch steriles PBS zu ersetzen. Sobald das Zytometer einsatzbereit ist, legen Sie die vorgekühlten Entnahmeröhrchen mit den FCS-Haufen in die entsprechende Entnahmevorrichtung.

Die verfügbaren Sammelvorrichtungen können bis zu zwei konische 15-Milliliter-Röhrchen aufnehmen. Vier 12 x 75 Millimeter große Röhren oder vier Mikroröhrchen. Verwenden Sie 12 x 75 Millimeter große Röhrchen zum Sammeln von weniger als 1,5 mal 10 bis zur sechsten Zellen und 15 Milliliter konische Röhrchen zum Sammeln von 1,5 mal 10 bis sechs bis 4,5 mal 10 bis zur sechsten Zellen.

Setzen Sie die entsprechende Auffangvorrichtung in die Sortierauffangkammer ein. Leiten Sie die Nebenströme in die installierte Sammelvorrichtung für mehrfarbige Sortierungen. Das Zytometer muss zunächst kalibriert werden, um die spektrale Überlappung zwischen den Detektoren zu berücksichtigen.

Das hier gezeigte Beispiel verdeutlicht die Überlappung zwischen den Emissionsspektren von Fit E und pe. Diese Überlappung, die im dunkel schattierten Bereich angezeigt wird, wird als Spillover bezeichnet. Hier würde ein PE-Spillover im Fit-E-Kanal und ein Fit-E-Spillover im PE-Kanal erkannt werden.

Dieser Spillover muss korrigiert werden, um die Restfluoreszenz einer Etage vier in einem anderen Kanal zu eliminieren. Der Prozess der Korrektur des Spillovers wird als Kompensation bezeichnet, um eine manuelle Kompensation durchzuführen. Verwenden Sie die Zytometrie-Software, um eine Vorlage einzurichten, die ein bivariates Diagramm zur Anzeige von Forward Scatter FSC und Side Scatter SSC sowie ein Histogramm für jeden verwendeten Fluro enthält.

Die Methode zum Einrichten dieser Diagramme variiert je nach Software. Setzen Sie das Negativkontroll-Com-Rohr in die Ladeöffnung des Zytometers ein und beginnen Sie mit der Datenerfassung, während die Probe läuft. Passen Sie FSC und SSC an, um die interessierende Grundgesamtheit auf der Skala zu platzieren.

Passen Sie dann die Fluoreszenz-PMT-Einstellungen an, um die negative Population oder Autofluoreszenz im linken Teil des Histogramms zu platzieren. Nehmen Sie das negative Kontrollrohr auf. Entfernen Sie das Negativkontrollröhrchen aus der Zytometer-Ladeöffnung und ersetzen Sie es durch das erste Positivkontrollröhrchen.

Beginnen Sie nun mit der Akquise. Wiederholen Sie diesen Vorgang für jedes der positiven Kontrollröhrchen und zeichnen Sie die Daten für jedes Röhrchen auf. Zeichnen Sie für jede Positivkontrolle ein Intervall-Gate oder einen Kasten um die im Histogramm aufgezeichneten Ereignisse.

Zeichnen Sie dann ein weiteres Intervall-Gate in den negativen Teil des Histogramms. Berücksichtigen Sie bei der manuellen Kompensation jeden im Experiment verwendeten Fluro, indem Sie den Median der Positiven anpassen, bis er dem Median der Negativen entspricht. Um den Median anzupassen, passen Sie die Werte für die spektrale Überlappung entweder höher oder niedriger an, bis die Mediane für die einzelnen Fluoreszenzparameter so weit wie möglich übereinstimmen.

Bereiten Sie sich unter Verwendung der Einstellungen für die Positiv- und Negativkontrollproben auf das Sortierverfahren vor, indem Sie die Gangeinstellungen für die Versuchsprobe bestimmen. Platzieren Sie das zu sortierende Röhrchen mit den zu sortierenden Zellen in der Zytometer-Ladeöffnung und beginnen Sie mit der Erfassung mit einer Geschwindigkeit von neun bis 10.000 Ereignissen pro Sekunde. Wählen Sie ein Punktdiagramm aus, um die Vorwärts- und die Seitenpunktzahl anzuzeigen.

Die Vorwärtsstreuung ist ein allgemeiner Indikator für die Zellengröße und wird auf der X-Achse platziert, während die Seitenstreuung ein Indikator für die Zellengranularität ist und auf der Y-Achse platziert wird. Nun die Population von Interesse. Sobald die Gates bestimmt wurden, stellen Sie sicher, dass die Temperatur der Ladeöffnung des Zytometers auf vier Grad Celsius eingestellt ist.

Setzen Sie dann das experimentelle Probenröhrchen in die Ladeöffnung ein. Drücken Sie die Sortieroption und beginnen Sie mit der Erfassung. Die Sammelröhrchen sollten beim Befüllen auf Eis gelegt werden. Fahren Sie mit der Sortierung fort, bis die gewünschte Anzahl von Zellen gesammelt wurde oder bis das Probenröhrchen leer ist.

Stoppen Sie dann die Sortierung, indem Sie die Sortiertaste erneut auswählen und die Probe aus der Ladeöffnung entnehmen. Platzieren Sie anschließend das Entnahmeröhrchen direkt auf der Ladeöffnung des Zytometers und erfassen Sie 500 bis 1000 Ereignisse. Unter Verwendung der gleichen Einstellungen wie bei der Sortierung nach T-Zellen erhöhte das Sortierverfahren die Reinheit von 21 auf 99 %Für B-Zellen wurde die anfängliche B-Zellpopulation von 5 % nach der Sortierung auf 98 % erhöht.

Deshalb haben wir Ihnen gerade gezeigt, wie Sie die b- und t-Zellpopulation aus Zyten per Fax aufreinigen können. Denken Sie daran, dass Fakten zur Aufreinigung jeder Zellpopulation verwendet werden können, wenn eine Einzelzellsuspension erzeugt werden kann und geeignete Antikörper verfügbar sind. Darüber hinaus können Zellen, die genetisch mit fluoreszierenden Markern gestapelt sind, ohne den Einsatz von Antikörpern leicht aufgereinigt werden.

Denken Sie auch immer daran, die richtigen Kontrollen für Ihre Experimente zu verwenden, und überprüfen Sie immer die Konfiguration Ihres Durchflusszytometrie-Lasers, um sicherzustellen, dass Sie die richtigen Fluorochrome verwenden, und stellen Sie sicher, dass Sie geeignete Gates verwenden, damit sie sich richtig in der Nähe Ihrer Populationen befinden. Das war's also. Danke fürs Zuschauen und viel Glück bei Ihren Experimenten.