Name: Reinigung von spezifischen Zellpopulation durch Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-07-10T18:30:00.000+00:00
Duration: 15 min 29 s
Description: Lernen Sie die FACS-Methode zur Reinigung spezifischer Zellpopulationen wie B- und CD4-T-Zellen aus Mauszellen. Dieses Protokoll zeigt effektive Techniken für hochreine Zellisolierungen in der Immunologie.

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Wir möchten Dr. Bill Cashdollar für seine Unterstützung in der Verwendung der Durchflusszytometrie Core-danken.

<ol><li> Vor Beginn des Prozesses, müssen die folgenden Punkte zu sein, gesammelt und aufbereitet: <ol style="list-style-type:lower-roman;"><li> Eis </li><li> 15 ml konische Röhrchen zum Färben von Zellen und 12 x 75 mm Strömungsrohre zur Färbung einfarbig steuert. </li><li> Färbepuffer: Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) + 3% fötalem Kälberserum (FCS) </li><li> Pipetten </li><li> Fc-Block (falls erforderlich) und Färbung Antikörper. Antikörper müssen für eine optimale Färbung titriert werden. </li><li> Compensation Perlen </li><li> Suspensionspuffer: Hank Balanced Salt Solution (HBSS) + 25 mM HEPES + 3% FCS </li><li> Trypanblau und Hämozytometer </li><li> Zellsieb (40 um Nylon) </li><li> Sammlung Röhren: Zwei Arten von Sammelröhrchen können a) 12 x 75 mm Polystyrol-Röhrchen (mit 300 ul FCS und 25 mM HEPES) oder b) 15 ml konische Röhrchen (mit 1 ml FCS + 25 mM HEPES) werden. Jeder reiche Medium mit hoher Konzentration im Serum kann für die Sammlung von sortierten Zellen verwendet werden. </li></ol></li><li> Generieren Sie eine einzelne Zelle Aussetzung der ab-Zell-Population. </li><li> Optional: Bereichern Sie für die gewünschte Zellpopulation durch eine Bulk-Reinigungsverfahren wie Komplement Erschöpfung oder magnetische Sortierung. Der wesentliche Vorteil der Anreicherung Schritt ist, dass es die Art der Zeit reduziert. </li><li> Wash Zellen einmal mit Färbepuffer. </li><li> Überstand verwerfen und Zellen in Färbepuffer in einer Konzentration bis zu 50 x 10 6 zur effizienten Färbung. </li><li> Optional: Für Zellen, die ein hohes Maß an FcR, blockieren die Rezeptoren mit einem geeigneten Blocking-Methode. Eine Methode der Wahl ist die Verwendung eines mAb, die auf Eis für 10-15 min FcyR bindet. Diese Antikörper sind kommerziell erhältlich. </li><li> Fügen Sie die entsprechenden mAb (in einer vorbestimmten Konzentration) auf die gewünschte Zellpopulation Fleck und inkubieren für 20-30 min auf Eis im Dunkeln, durch zwei Waschungen mit Färbepuffer gefolgt. Optional: Die Färbung mit einem vitalen Farbstoff, wie Propidiumiodid kann enthalten, um tote Zellen (5) zu erkennen sein. Wenn Multi-Color-Färbung verwendet werden soll, sind einfarbig Kontrollen erforderlich. Wir verwenden BD CompBeads einzelne Farbe Kontrollen vorzubereiten mit dem Protokoll des Herstellers. </li><li> Wenn nicht mit direkt konjugierten Antikörpern, wiederholen Sie Schritt 7 mit den entsprechenden Sekundär-Antikörper oder Streptavidin-Konjugat. </li><li> Nach dem Waschen die Zellen in Kulturmedium und bestimmen die Zellkonzentration mit einem vitalen Farbstoff wie Trypanblau. </li><li> Passen Sie die Zellkonzentration auf 15-20 x 10 6 / ml. Für Zellpopulationen, die Cluster bilden, die das Instrument bei der Sortierung können verstopfen, die Zellen-Filter durch ein Sieb. </li><li> Einrichten und optimieren die Zell-Sorter. Der Prozess der Einrichtung eines Durchflusszytometer variiert in Abhängigkeit von der Herstellung und muss von entsprechend geschultem Personal durchgeführt werden. Die allgemeinen Empfehlungen lauten wie folgt: <ol style="list-style-type:lower-roman;"><li> Wählen Sie die gewünschte Düse je nach Zelltyp, die sortiert werden. </li><li> Für sterile Sorten, sterilisieren das Instrument. </li><li> Führen Instrument der Qualitätskontrolle mit Perlen, um zu überprüfen Laser funktionieren, und es ist genau sortieren. </li><li> Installieren Sie die erforderlichen Auffangvorrichtung und richten Sie die Seite Streams. </li><li> Schauen Sie sich das Instrument der Laser und Detektor bis zum fluoreszierenden Markierungen, die verwendet werden (unser BD FACS Aria hat drei Lasern und können bis zu neun Farben zu erkennen) kann bestimmen, festgelegt. </li><li> Sobald festgestellt wird, was fluoreszierenden Markierungen auf der Zell-Sorter verwendet wird, kann Entschädigung durchgeführt werden (wie unten beschrieben) werden. </li></ol></li><li> Führen Ausgleich mit der negativen Kontrollprobe und die einzige positive Kontrollen. Kompensation ist notwendig, um das Spektrum Überschneidungen zwischen beiden Detektoren zu entfernen. Es muss darauf hingewiesen werden, dass eine Entschädigung nicht narrensicher und wird negativ durch, wie hell bestimmte Marker Fleck, und die Fluoreszenz der Zellen, die geringe Autofluoreszenz, die zu einer schlechten Auflösung zwischen dunkel und negativen Populationen führen kann betroffen sind. Für beste Ergebnisse sollte das experimentelle Design umfassen die Verwendung von hellen Fluorochrome mit Markern, die geringe Expression haben oder die nicht über ein bekanntes Fluoreszenzmuster. Marker, die eine gute Trennung zwischen Zellpopulationen und sind hoch exprimiert bieten sollte mit Dimer Fluorochrome wie diejenigen von roten oder violetten Laser angeregt werden. <ol style="list-style-type:lower-roman;"><li> Eine Entschädigung kann mit Kompensation Perlen, die Polystyrol-Mikropartikel, die mit einem Antikörper spezifisch für die Kappa leichten Kette des Ig aus Maus, Ratte, Ratte oder / Hamster wurden gekoppelt sind, ausgeführt werden. Die Perlen sind leicht zu färben, haben ein robustes Signal und bieten eine einfache Möglichkeit zur Herstellung von einzelnen Flecken Steuerelemente, die die gleichen Fluorophor wie die experimentellen Proben. </li><li> Richten Sie eine Vorlage, die eine bivariate Plan, forward scatter (FSC) und Seitwärts-Streulicht (SSC), und ein Histogramm zur Anzeige umfasstjedes Fluorochrom, die verwendet werden. </li><li> Führen Sie die negative Kontrolle Röhre und stellen Sie die forward scatter (FSC) und Seitwärts-Streulicht (SSC), um die Bevölkerung von Interesse auf der Skala statt. </li><li> Passen Sie die Fluoreszenz PMT-Einstellungen, um die negativen Bevölkerung oder Autofluoreszenz im äußersten linken Teil des Histogramms Platz. </li><li> Notieren Sie sich die negative Kontrolle Röhre. </li><li> Führen Sie das einzige positive Kontrolle Rohre und notieren Sie die Daten für jede Röhre. </li><li> Zeichnen Sie ein Intervall Schutzzaun um den positiven Teil der Daten auf das Histogramm, und ein anderes Intervall Tor auf der negativen Teil des Histogramms. </li><li> Manuelle Kompensation wird durch die Einstellung erfolgt der Median (Median ist eine bessere Schätzung der zentralen Tendenz als der Mittelwert auf einer logarithmischen Skala) des Positiven, bis er gleich dem Median der Negative ist. Dies muss für jeden der Fluorochrom-Etiketten in dem Experiment verwendete durchgeführt werden. </li><li> Zur Einstellung der Median, passen Sie die spektrale Überlappung Werte höher oder niedriger, bis die Mediane für die einzelnen fluoreszierenden Parameter entsprechen so genau wie möglich. </li><li> Eine Entschädigung kann auch automatisch mit Analyse-Software geschehen. Automatische Kompensation verwendet die erfassten Daten von der Entschädigung Kontrollen eine algebraische Matrix für alle Fluorophore in dem Experiment verwendete berechnen. Diese Werte werden verwendet, um zu subtrahieren aus den Beiträgen der nicht-primären Farben, die in einer Grundfarbe des Detektors Blutungen sind. </li></ol></li><li> Notieren Sie sich die experimentelle Probe, die sortiert werden und die Nutzung Gating-Tools und subsetting Methoden, um die Bevölkerung von Interesse zu definieren. <ol style="list-style-type:lower-roman;"><li> Richten Sie die experimentelle Vorlage mit einem Punkt-Diagramm, dass FSC vs SSC-Displays und einen Gating-Werkzeug, Polygon, Rechteck-, Intervall-oder Quadranten zu Tor der Bevölkerung von Interesse. Das Streudiagramm zeigt die physikalischen Eigenschaften der Zelle, die verschiedene auf den jeweiligen Zelltyp ist. </li><li> Der beste Weg, um die Fluoreszenz-Gating-Strategie zu bestimmen, ist die Fluoreszenz minus eins (FMO)-Steuerelemente verwenden. In einem FMO Steuerrohr alle Reagenzien, die in dem Experiment verwendet werden, sind mit Ausnahme des einen von Interesse enthalten. Die FMO hilft zu unterscheiden zwischen schwach gefärbte Populationen und breiten negativen Populationen. </li><li> Verwenden Sie die Daten aus FMO Rohren aufgenommen, um festzustellen, wo man Tore in die Röhre statt. </li></ol></li><li> Nach Toren bestimmt worden sind, können die Tore für die Sortierung in externe Sammelröhrchen ausgewählt werden. Bis zu vier Toren (oder Populationen) kann zu einem Zeitpunkt in Abhängigkeit von der Instrumentierung zur Verfügung sortiert werden. </li><li> Führen Sie die experimentelle Probe-Röhrchen bei 4 ° C, auf Ablenkplatten drehen und Art der Probe. 5 x 10 5 -1,5 x 10 6 Zellen in eine 12 x 75 mm Rohr und 1,5 sortiert x 10 6 bis 4,5 x 10 6 Zellen in eine 15 ml konische sortiert werden. </li><li> Sobald die erforderliche Anzahl von Zellen erhalten worden ist, manuell stoppen Sortierung. </li><li> Führen Sie eine post-Art-Analyse, um die Reinheit der sortierten Zellpopulationen zu ermitteln. </li></ol> Repräsentative Ergebnisse Wir haben hier für Maus Milz B-und CD4 T-Zell-Sortierung (Abbildung 1) gezeigt. Milzzellen wurden mit PE Texas Red-konjugiertem Anti-Maus-B220, FITC-konjugierten Anti-Maus-TCRβ und AlexaFluor-700-konjugierten Anti-Maus-CD4 an B-Zellen (B220 + TCRβ-) und CD4 T-Zellen (CD4 + + TCRβ identifizieren gebeizt ). Die Sortierung wurde mit BD FACS Aria Instrument durchgeführt. Nach dem Sortieren der B-Zell-Reinheit betrug&gt; 97% und die CD4 T-Zell-Reinheit betrug&gt; 98%. <img src="/files/ftp_upload/1546/1546fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Die Reinheit der Milz B-Zellen und CD4 T-Zellen nach FACS. Maus Milzzellen mit anti-Maus-B220, TCRβ und CD4 Antikörper gefärbt wurden. FACS für B-Zellen wurde mit einem BD FACS Aria durch Gating auf B220 + TCRβ-Zellen (Abb. 1A, links, untere rechte Quadrant). Ein Beitrag Sortieren Analyse wurde durchgeführt, um die Reinheit der B-Zellen (Abb. 1A, rechts) zu bestimmen. B220-Färbung ist auf der x-Achse und TCRβ Flecken auf der y-Achse dargestellt. FACS für CD4 T-Zellen wurde unter Verwendung der gleichen Durchflusszytometer durch Gating auf TCRβ + CD4 +-Zellen (Abb. 1B, linken, oberen rechten Quadranten). Ein Beitrag Sortieren Analyse wurde durchgeführt, um die Reinheit der CD4 T-Zellen (Abb. 1B, rechts) zu bestimmen. TCRβ Färbung ist auf der x-Achse und CD4-Färbung auf der y-Achse dargestellt. Der prozentuale Anteil positiver Zellen in jedem Quadranten dargestellt. <!--<img src="/files/ftp_upload/1546/1546fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2. Die Reinheit der Milz CD4 T-Zellen nach FACS. Murine Milz-T-Zellen wurden durch die Entfernung von B-Zellen durch Schwenken bereichert. Anschließend wurden die Zellen mit anti-Maus-TCRβ und CD4 Antikörper (linkes Bild) gefärbt. FACS wurde mit einem BD FACS Aria durch Gating auf TCRβ + CD4 +-Zellen (links, rechts oben quadrant). Ein Beitrag Sortieren Analyse wurde durchgeführt, um die Reinheit der T-Zellen, die größer als 99% (rechts) war zu bestimmen. TCRβ Färbung ist auf der x-Achse und CD4-Färbung auf der y-Achse dargestellt. Der prozentuale Anteil positiver Zellen in jedem Quadranten dargestellt. -&gt;

<ol><li>Herzenberg, L. A., De Rosa, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoclonal+antibodies+and+the+FACS%3A+complementary+tools+for+immunobiology+and+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Today%22%5BJournal%5D)">Monoclonal antibodies and the FACS: complementary tools for immunobiology and medicine.</a> Immunol Today. 21, 383-390 (2000).</li>
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</ol>

FACS ist ein hochentwickeltes Verfahren zur Reinigung von Zellpopulationen von Interesse, in denen eine sehr hohe Reinheit (95-100%) der sortierten Population erhalten werden kann. Daher ist diese Technik besonders wichtig für Experimente, bei denen hohe Reinheit ist eine wesentliche Voraussetzung (zB Microarray-Analyse). FACS ist besonders vorteilhaft gegenüber anderen verfügbaren Methoden der Reinigung, wenn eine Zelle Bevölkerung muss auf der Grundlage einer wöchentlichen ausgedrückt Oberflächenmarker gereinigt werden oder wenn zwei oder mehr Populationen zu reinigende, die verschiedenen Ebenen der Ausdruck der gleichen Oberfläche Marker haben werden müssen. Zum Beispiel die Reinigung der Randzone B-Zellen (B220 + CD21 hallo CD23 int / niedrig) und follikulärem B-Zellen (B220 + CD21 int / low CD23 hallo) auf Expression von CD21 und CD23 auf. Ein weiterer wachsender Anwendung von FACS ist Single cell sorting ermöglicht die Analyse einzelner Zellen (3, 4). FACS ist auch allgemein zu sortieren Zellen, die fluoreszierende Proteine, die genetisch ausgedrückt werden, wie grün fluoreszierende Protein markierte Proteine ​​(5) verwendet. Wenn eine sterile Art durchgeführt wird können die Zellen kultiviert werden. Allerdings kann die Lebensfähigkeit der Zellen und die Ausbeute bei der Sortierung beeinträchtigt werden. Die Lebensfähigkeit kann durch eine Zell-abhängige optimale Temperatur für die Sortierung und Verarbeitung Sammelröhrchen unmittelbar nach ihrer Kapazität zu erreichen verbessert werden. Die Wiederherstellung kann durch Verwendung von Polypropylen-Röhrchen, das Sammeln sortierten Zellen im Serum von Rich Media und Invertieren Sammelröhrchen intermittierend, Pflege-Röhrchen bei einer optimalen Temperatur und Zentrifugieren sortierten Zellen für ca. 10 min (http://cyto.mednet.ucla.edu erhöht werden / Protocol.htm). Die Entwicklung von Ultra-High-Speed-Sorter hat die Möglichkeit, die Anwendung von Flow Sortierung in klinischen Umgebungen erweitert. Die mögliche klinische Anwendungen der FACS gehören Reinigung von Blut-Stammzellen aus menschlichem Blut zu therapeutischen Zwecken, Anwendungen in der Krebstherapie, Amniozentese Ersatz-, Sortier-menschlichen Spermien und Früherkennung von Krankheiten Erkennungen (6, 7). Für mehrfarbige Färbung wird Antikörperselektion ein wichtiger Schritt und Fluorochrome beruhen auf dem Nachweis-System für die jeweilige Instrument gewählt. Es gibt eine Reihe von Unternehmen, die Zellsortern und der Laser-Konfiguration variiert verkaufen nach den Bedürfnissen der Benutzer. So kann man nicht einfach verwenden genau die gleichen Antikörper in veröffentlichten Studien ohne Bestätigung Kompatibilität verwendet. Für eine optimale Antikörper Auswahl, sollte man die Expression des Proteins untersucht. Im Allgemeinen sollten die hellsten verfügbaren Fluorochrom-markierten Antikörper verwendet, um schwach ausgedrückt Oberflächenmarker Fleck, während dim Fluorochrome für die Färbung von stark exprimierten Oberflächenmarker (8) verwendet werden können. Darüber hinaus Antikörper sollten in einer Weise, dass unter ihren Emissionsspektren Überlappung gewählt werden, ist minimal. Für mehrfarbige Färbung, ist es äußerst schwierig zu entscheiden Fluorochrom, dass keine spektrale Überlappung. In dieser Situation ist die Entschädigung durchgeführt. Kompensation ist notwendig, um mathematisch zu eliminieren die Fluoreszenz Überschneidungen zwischen den Emissionen Spektrum der verschiedenen Fluorochrome, die messbar von den Detektoren (8-10) ist. In anderen Worten ist die Überlappung Fluoreszenz von einem Fluorochrom aus dem Emissionsspektrum eines anderen Fluorochrom abgezogen. Die Ausgleichsrechnung erfordert eine ungefärbte Kontrolle und einzigen positiven Kontrollen für jedes Fluorochrom für eine mehrfarbige Färbung (9, 10). Eine Entschädigung kann unter Verwendung von Zellen oder Perlen werden. Die Perlen sind leicht zu färben, haben ein robustes Signal und bieten eine einfache Möglichkeit zur Herstellung von einzelnen Flecken Steuerelemente, die die gleichen Fluorophoren wie die experimentellen Proben haben. Compensation Perlen sind besonders vorteilhaft, wenn der Zelloberfläche Protein von Interesse auf einem niedrigen Niveau exprimiert wird und wenn die Zellpopulation von Interesse ist in der Anfangsphase ab Zellpopulation begrenzen. Sobald der Antikörper ausgewählt wurden, sollte ihre Aktivität durch die Durchführung einer Titration Analyse optimiert werden. Dies ist besonders wichtig, wenn der FACS-Maschine hat sehr leistungsfähige Laser. Die Verwendung von suboptimalen Konzentrationen der Färbung Antikörper können in schlechten Abtrennung der gewünschten Zellpopulation aus der gesamten Zellpopulation führen. Die Verwendung von hohen Antikörper-Konzentrationen erhöht die Chance für Antigen nicht-spezifische Färbung. Deshalb Antikörper-Titration ermöglicht die Auswahl der Antikörper-Konzentration, die maximale Helligkeit des positiven Bevölkerung und minimale Hintergrundfärbung (8) gibt. FACS ist heute ein Standard-Technik für die Reinigung von Subpopulationen von Zellen. Es kann benutzt werden, um jeden Zelltyp, in denen eine einzige Zellsuspension erzeugt und können Antikörper verfügbar sind, um die gewünschte Zellpopulation zu identifizieren trennen. FACS ist die Methode der Wahl, wenn highly reine Zellpopulationen sind erforderlich.

reinigung von spezifischen zellpopulation durch fluorescence activated cell sorting (facs)

Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)

Experimentelle und klinische Studien erfordern oft hochreine Zellpopulationen. FACS ist eine Technik der Wahl, um Zellpopulationen bekannter Phänotyp zu reinigen. Andere bulk Methoden der Reinigung sind Panning, ergänzen Erschöpfung und Magnetic Bead Separation. Allerdings hat FACS mehrere Vorteile gegenüber anderen verfügbaren Methoden. FACS ist die bevorzugte Methode, wenn eine sehr hohe Reinheit des gewünschten Bevölkerung erforderlich ist, wenn die Zielzelle Bevölkerung ein sehr niedriges Niveau der Identifizierung Marker drückt oder wenn Zellpopulationen erfordern Trennung basierend auf differentiellen Marker Dichte. Darüber hinaus ist FACS die einzige verfügbare Reinigungsverfahren für Zellen auf innere Färbung oder intrazelluläre Protein-Expression basiert, wie eine gentechnisch veränderte fluoreszierendes Protein-Marker zu isolieren. FACS ermöglicht die Reinigung von einzelnen Zellen nach Größe, Granularität und Fluoreszenz. Um Zellen von Interesse zu reinigen, werden diese zunächst mit Fluoreszenz-markierten monoklonalen Antikörpern (mAb), die spezifische Oberfläche Marker auf die gewünschte Zellpopulation (1) zu erkennen gefärbt. Negative Auswahl von ungefärbten Zellen ist ebenfalls möglich. FACS Reinigung erfordert ein Durchflusszytometer mit Sortier-Kapazität und der entsprechenden Software. Für FACS werden Zellen in Suspension als Stream in Tröpfchen mit jeweils einer einzelnen Zelle vor einer Laser hindurchgeführt. Die Fluoreszenz-Detektionssystem erkennt Zellen von Interesse auf vorbestimmten fluoreszierenden Parameter der Zellen. Das Gerät gilt eine Gebühr, die Tröpfchen mit einer Zelle von Interesse und eine elektrostatische Ablenkung erleichtert Sammlung der geladenen Tröpfchen in entsprechende Sammelröhrchen (2). Der Erfolg der Färbung und damit Sortierung hängt weitgehend von der Auswahl der Identifizierung von Markern und die Wahl der mAb. Sortieren Parameter können je nach Anforderung der Reinheit und Ausbeute werden. Obwohl FACS erfordert spezielle Ausrüstung und Ausbildung des Personals, ist es die Methode der Wahl für die Isolierung von hochreiner Zellpopulationen.

Für viele wissenschaftliche Studien, die eine biologische und chemische Analyse von Zell-Populationen müssen die Zellen in einem hohen Zustand der Reinheit sein. Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) ist eine überlegene Methode, bei der reinen Zellpopulationen zu erhalten.

Reinigung von spezifischen Zellpopulation durch Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)

Experimentelle und klinische Studien erfordern häufig hochreine Zellpopulationen. FACS ist eine bevorzugte Technik zur Aufreinigung von Zellpopulationen mit bekannten ...

Hallo, ich bin Hope Campbell, Spezialistin für Durchflusszytometrie am Blood Research Institute des Blood Center of Wisconsin. Hallo, ich bin STR Baso, Doktorand im Labor von Dr. Bonnie Dieter. Ich bin ebenfalls am Blood Research Institute des Blood Center of Wisconsin tätig.Heute werden wir eine Methode zur Isolierung von Zellen mittels fluoreszenzaktivierter Zellsortierung durchführen. In einem Labor verwenden wir dieses Verfahren, um die Funktion von Lymphozyten und myeloischen Zellpopulationen zu untersuchen. Beginnen wir.Bei diesem Verfahren werden B- und CD4-T-Zellen aus Mauszellen gereinigt. Die Ausgangszahl der Zielzellen sollte basierend auf der benötigten Zellenanzahl und der Wiederfindungsrate des Geräts bei Verwendung dieser Methode berechnet werden. Die typische Wiederfindungsrate für B- und CD4-T-Zellen liegt bei 85 bis 90 %. Die Ausgangspopulation der SP-Zellen besteht zu etwa 60 bis 70 % aus B-Zellen und zu 20 bis 30 % aus T-Zellen.Somit können Sie bei einem Ausgangsvolumen von 100 mal 10 hoch 6 Zellen 50 bis 60 Millionen B-Zellen und 20 bis 30 Millionen T-Zellen vor Beginn der FACS-Analyse gewinnen. Die für das Protokoll benötigten Lösungen und Reagenzien sollten auf Eis gebracht werden. Dazu gehören ein Färbepuffer, bestehend aus phosphatgepufferter Kochsalzlösung mit 3 % Fötales Rinderserum, ein Suspensionspuffer, bestehend aus 25 Millimolar HEPES in Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) mit 3 % Fötales Rinderserum, eine 25 Millimolar Hepes-B-Lösung in Fötales Rinderserum, Färbeantikörper und Kompensationsperlen.Dieses Protokoll erfordert außerdem die folgenden Hilfsmittel und Reagenzien. Konische 15-Milliliter-Röhrchen, 12 mal 75 Millimeter große Polystyrol- oder Polypropylen-Flussröhren. Ein Nylon-Zellsieb, Trypanblau und ein Hämozytometer sowie Sortier- und Sammelröhrchen sollten ebenfalls im Voraus vorbereitet werden, um dies durchführen zu können.Gebe 300 Mikroliter der HEPES FCS-Lösung in Fließröhren oder ein Milliliter der HEPES FCS-Lösung in 15-Milliliter-Konischröhren. Diese sollten gekühlt auf Eis gehalten werden, bis der Sammelprozess beginnt. Beginnen Sie mit der Herstellung einer Einzelzell-Suspension der gewünschten Zellpopulation. Wenn die mit diesem Verfahren isolierten Zellen kultiviert werden sollen. Die gesamte Zellpräparation sollte in einer Zellkulturbank durchgeführt werden. Unter Verwendung steriler Technik die Zellen einmal mit eiskaltem Färbepuffer waschen und durch mehrmaliges Umstülpen des Röhrchens die Zellen resuspendieren.Anschließend die Zellen sieben bis acht Minuten bei etwa 250 ×g und 4 °C zentrifugieren. Die Waschbedingungen können je nach Zelltyp und -konzentration variieren. Für Zellen waschen Sie bis zu 200 × 10⁶ Zellen mit 10 Milliliter Markierungspuffer.Entfernen Sie vorsichtig den Überstand durch Absaugen, sodass das Zellpellet intakt bleibt. Resuspendieren Sie die Zellen anschließend in eiskaltem Färbe-Puffer in einer Konzentration von bis zu 50 × 10⁶ pro 100 µl. Lösen Sie das Zellpellet durch vorsichtiges Klopfen oder sanftes Vortexen des Röhrchens.Überführen Sie anschließend 0,25 bis 1 × 10⁶ Zellen in ein neues 12 × 75 mm großes Polystyrol- oder Polypropylen-Flussr&ouml;hrchen auf Eis. Stellen Sie dieses beiseite, um es sp&auml;ter als unbelastete Kontrollprobe zu verwenden. Geben Sie in das erste R&ouml;hrchen prim&auml;re Antik&ouml;rper zur Zellsuspension, um die gew&uuml;nschte Endkonzentration zu erreichen. Hier werden mit PE-Texas-rot konjugierte anti-B220-Antik&ouml;rper zur F&auml;rbung von B-Zellen verwendet, w&auml;hrend mit ZI konjugierte anti-TCR-β- und/oder mit 700 konjugierte anti-CD4-Antik&ouml;rper zur F&auml;rbung von T-Zellen dienen. Mischen Sie durch leichtes Antippen des R&ouml;hrchenbodens oder durch vorsichtiges Schwenken.Vortexen Sie die Zellen, stellen Sie sie dann auf Eis und inkubieren Sie sie 20 bis 30 Minuten im Dunkeln. Nach der Inkubation waschen Sie die markierten Zellen durch Resuspendierung in 10 Milliliter eiskaltem Suspensionspuffer und zentrifugieren wie zuvor. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand. Wiederholen Sie diesen Schritt, um die Zellen ein zweites Mal zu waschen.Schließlich die Zellen in eiskaltem Suspensionspuffer resuspendieren. Wenn die primären Antikörper nicht direkt mit einem Fluorophor konjugiert sind, markierte sekundäre Antikörper oder Strep AVID im Konjugat zur Zellsuspension hinzufügen und die Zellen erneut 20 bis 30 Minuten lang im Dunkeln auf Eis inkubieren. Die Zellen zweimal mit eiskaltem Suspensionspuffer waschen.Nach dem Resuspendieren der Zellen in eiskaltem Suspensionspuffer. Bestimmen Sie die Zellkonzentration und -viabilität mithilfe eines vitalen Farbstoffs wie Trypanblau und eines Hämozytometers. Stellen Sie die Zellkonzentration auf 10 bis 20 × 10⁶ Zellen pro Milliliter ein, indem Sie Suspensionspuffer hinzufügen, um ein Verstopfen des Sortiergeräts durch Zellaggregate zu vermeiden, die während der Isolierung abgestorben sein könnten.Verfahren und Färbung. Filtern Sie die Zellen unmittelbar vor Beginn des Sortierprotokolls durch ein Trichtersieb. Die Porengröße des Siebs sollte je nach Zelltyp gewählt werden; für Zellen wird ein Sieb mit einer Porengröße von 40 Mikrometer verwendet.Sammeln Sie die gefilterten Zellen in einem kegelförmigen 15-Liter-Gefäß oder in 12 mal 75 Millimeter großen Durchflussröhren, abhängig vom Volumen. Stellen Sie die Zellen auf Eis, während das Cytometer für den Sortiervorgang eingerichtet wird. Wenn BD-Kompensationsperlen als einfarbige positive Kontrollen verwendet werden, bereiten Sie je eine Kontrollröhre für jede im Assay verwendete Farbe sowie eine unbelastete negative Kontrollröhre vor.Nach gründlichem Vortexen der Bead-Suspensionen jeweils einen Tropfen der negativen und positiven Bead-Suspensionen zu 100 Mikroliter Suspensionspuffer für jede verwendete Farbe und die negative Kontrolle hinzufügen. Anschließend je einen Mikroliter des markierten Antikörpers zu jedem positiven Kontrollröhrchen zugeben. In diesem Experiment wird ein Röhrchen unter Verwendung von PE Texas'Red B zwei 20 Antikörpern vorbereitet.Einmal mit ETCR-Beta-Antikörpern und einmal mit LOR-700-CD4-Antikörpern, die durch Vorsichtiges Antippen des Röhrchenbodens gemischt werden; 15 bis 30 Minuten im Dunkeln bei Raumtemperatur inkubieren. Die Kügelchen einmal mit zwei Millilitern Färbe-Puffer waschen und bei 200 × g 10 Minuten zentrifugieren. Den Überstand durch Absaugen entfernen und das Kügelchenpellet in 200 bis 500 Mikrolitern Färbe-Puffer resuspendieren.Die Pufferkonfiguration des Durchflusszytometers variiert je nach Hersteller und sollte nur von entsprechend geschultem Personal durchgeführt werden. Das Zellsortierverfahren hier wird mit dem BD defects aria durchgeführt. Wählen Sie vor der Sortierung die geeignete Düse in Abhängigkeit vom zu sortierenden Zelltyp aus.Die verfügbaren Größen für die FACS-Aria betragen 70 Mikrometer, 100 Mikrometer und 130 Mikrometer. Die Düsenöffnung sollte mindestens das Dreifache der Größe der zu sortierenden Zelle betragen; für Lymphozyten wird daher die 70-Mikrometer-Düse gewählt. Eine aseptische Zellsortierung kann mithilfe der aseptischen Sortieroption des Geräts durchgeführt werden.Mit dieser Option wird der gesamte Mantelweg gemäß den Anweisungen des Herstellers mit 70 %igem Ethanol dekontaminiert. Stellen Sie sicher, dass Sie die Mantelfilter ersetzen und PBS durch steriles PBS austauschen. Sobald das Durchflusszytometer betriebsbereit ist, stellen Sie die vorab gekühlten Sammelröhrchen, die hohe Mengen FCS enthalten, in die entsprechende Sammeleinrichtung.Verfügbare Sammelgefäße können bis zu zwei kegelförmige 15-Milliliter-Röhrchen, vier 12 × 75-Millimeter-Röhrchen oder vier Mikroröhrchen aufnehmen. Verwenden Sie 12 × 75-Millimeter-Röhrchen zum Sammeln von weniger als 1,5 × 10⁶ Zellen und 15-Milliliter-Kegelröhrchen zum Sammeln von 1,5 × 10⁶ bis 4,5 × 10⁶ Zellen.Platzieren Sie das geeignete Sammelgefäß in die Sortier-Sammelkammer. Leiten Sie die Seitenströme für Mehrfarbsortierungen in das installierte Sammelgefäß. Das Durchflusszytometer muss zunächst kalibriert werden, um den spektralen Überlappungseffekt zwischen den Detektoren auszugleichen.Das hier gezeigte Beispiel veranschaulicht die Überlappung zwischen den Emissionsspektren von FIT E und PE. Diese in der dunkel schattierten Fläche dargestellte Überlappung wird als Spillover bezeichnet. Hier würde der PE-Spillover im FIT E-Kanal und der FIT E-Spillover im PE-Kanal detektiert werden.Dieser Spillover muss korrigiert werden, um die Restfluoreszenz eines Farbstoffs in einem anderen Kanal zu eliminieren. Der Vorgang der Korrektur des Spillvers ist als Kompensation bekannt, um eine manuelle Kompensation durchzuführen. Verwenden Sie Zytometriesoftware, um eine Vorlage einzurichten, die ein bivariates Diagramm zur Anzeige des Vorwärtsstreulichts (FSC) und des Seitwärtsstreulichts (SSC) sowie ein Histogramm für jeden verwendeten Farbstoff enthält.Die Methode zur Einrichtung dieser Diagramme variiert je nach Software. Platzieren Sie das Negativkontroll-Rohr in die Ladeöffnung des Durchflusszytometers und beginnen Sie mit der Datenaufnahme, während die Probe durchläuft. Stellen Sie FSC und SSC so ein, dass die Population von Interesse im sichtbaren Bereich liegt.Danach die Fluoreszenz-PMT-Einstellungen anpassen, um die negative Population oder Autofluoreszenz im äußersten linken Bereich des Histogramms darzustellen. Das negative Kontrollröhrchen aufzeichnen. Das negative Kontrollröhrchen aus der Ladeöffnung des Durchflusszytometers entfernen und durch das erste positive Kontrollröhrchen ersetzen.Beginnen Sie nun mit der Datenaufnahme. Wiederholen Sie diesen Vorgang für jedes der positiven Kontrollröhrchen und nehmen Sie die Daten für jedes Röhrchen auf. Zeichnen Sie für jede positive Kontrolle ein Intervalltor oder ein Rechteck um die auf dem Histogramm erfassten Ereignisse.Zeichnen Sie dann ein weiteres Intervalltor im negativen Bereich des Histogramms. Berücksichtigen Sie bei der manuellen Kompensation jeden im Experiment verwendeten Farbstoff, indem Sie den Median der Positiven so anpassen, dass er dem Median der Negativen entspricht. Um den Median anzupassen, verändern Sie die Werte der spektralen Überlappung entweder nach oben oder unten, bis die Mediane jedes fluoreszierenden Parameters so genau wie möglich übereinstimmen.Unter Verwendung der Einstellungen, die mit den positiven und negativen Kontrollproben festgelegt wurden, bereiten Sie den Sortiervorgang vor, indem Sie die Gating-Einstellungen für die Versuchsprobe bestimmen. Platzieren Sie die Röhre mit den zu sortierenden Zellen in die Ladeöffnung des Durchflusszytometers und beginnen Sie die Datenaufnahme mit einer Geschwindigkeit von neun bis 10.000 Ereignissen pro Sekunde. Wählen Sie ein Punktediagramm aus, um Streuung in Vorwärtsrichtung gegen Seitwärtsstreuung darzustellen.Der Vorwärtsstreulichtsignal ist ein allgemeiner Indikator für die Zellgröße und wird auf der X-Achse abgetragen, während das Seitwärtsstreulichtsignal ein Indikator für die Zellgranularität ist und auf der Y-Achse abgetragen wird. Gehen Sie nun zur Auswahl der Population von Interesse über. Sobald die Gatter definiert sind, überprüfen Sie, ob die Temperatur des Ladeports des Durchflusszytometers auf vier Grad Celsius eingestellt ist.Bringen Sie dann das Probengefäß in die Ladeöffnung ein. Drücken Sie die Sortieroption und beginnen Sie die Datenerfassung; Sammelgefäße sollten auf Eis gestellt werden, sobald sie befüllt sind. Setzen Sie das Sortieren fort, bis die gewünschte Anzahl an Zellen gesammelt wurde oder bis das Probengefäß leer ist.Stoppen Sie dann die Sortierung, indem Sie erneut die Sortiertaste auswählen, und entfernen Sie die Probe aus dem Ladeanschluss. Danach setzen Sie das Samplenröhrchen direkt auf den Ladeanschluss des Zytometers und erfassen 500 bis 1000 Ereignisse. Unter Verwendung derselben Einstellungen wie für die T-Zell-Sortierung erhöhte sich die Reinheit von 21 auf 99 %. Für B-Zellen stieg der anfängliche B-Zell-Anteil von 5 % nach der Sortierung auf 98 %.Wir haben Ihnen soeben gezeigt, wie man B- und T-Zellpopulationen von Zellen mittels FACS reinigt. Denken Sie daran, dass FACS verwendet werden kann, um jede Zellpopulation zu reinigen, sofern eine Einzelzell-Suspension erzeugt werden kann und geeignete Antikörper verfügbar sind. Außerdem können Zellen, die genetisch mit fluoreszierenden Markern ausgestattet sind, problemlos ohne Verwendung von Antikörpern gereinigt werden.Denken Sie außerdem immer daran, die geeigneten Kontrollen für Ihre Experimente zu verwenden, und überprüfen Sie stets Ihre Konfiguration der Durchflusszytometrie-Laser, um sicherzustellen, dass Sie die richtigen Fluorochrome einsetzen. Achten Sie zudem darauf, geeignete Tore zu verwenden, sodass diese korrekt um Ihre Zellpopulationen liegen. Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

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Hier stellen wir eine Immunphänotypisierungsstrategie zur Charakterisierung der Megakaryozytendifferenzierung vor und zeigen, wie diese Strategie die Sortierung von Megakaryozyten in verschiedenen Stadien mit einem fluoreszenzaktivierten Zellsortierer ermöglicht. Die Methodik kann auf menschliche Primärgewebe, aber auch auf Megakaryozyten angewendet werden, die in Kultur in vitroerzeugt werden.

Immunphänotypisierung und Zellsortierung von humanen MKs aus menschlichen Primärquellen oder differenziert in vitro von hämatopoetischen Vorläufern

Lernen Sie die FACS-Methode zur Reinigung spezifischer Zellpopulationen wie B- und CD4-T-Zellen aus Mauszellen. Dieses Protokoll zeigt effektive Techniken für hochreine Zellisolierungen in der Immunologie.

Reinigung von spezifischen Zellpopulation durch Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)

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