Name: Antikörper Profiling von Luciferase Immunpräzipitation Systems (LIPS) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-10-07T17:25:00.000+00:00
Duration: 12 min 19 s
Description: Lernen Sie das Luciferase Immunpräzipitation Systems (LIPS) zur Antikörperquantifizierung in COS-1-Zellen mit Rohlysaten. Diese effiziente Methode ermöglicht präzise Antikörperprofile für diagnostische Anwendungen.

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1. Schematische Übersicht: Dieses Video zeigt die Schritte bei der Durchführung der LIPS-Test beteiligt. Antigene sind in COS1-Zellen als rekombinante Renilla-Luciferase (RUC)-Antigen Fusionen und Rohextrakte ausgedrückt erhalten und ohne Reinigung verwendet. Die LIPS-Test wird durch Inkubation crud e Ruc-Antigen-Extrakte mit Patientenseren in Mikrotitervertiefungen eingeleitet. Die Antikörper-Antigen-Gemisch wird dann zu einer 96-well Filterplatte mit Protein A / G Perlen IgG-Moleküle einzufangen übertragen. Nach dem Waschen der Filter-Platte mit dem Protein A / G Perlen, Antikörper gebunden Ruc-Antigen, das durch die Zugabe von Coelenterazin Substrat und Licht-Einheiten gemessen werden mit einem Luminometer gemessen. TEIL 1: Transfektion von Plasmiden für die Herstellung von Renilla-Antigen-Fusionsproteine Set-up: COS1 Zellen werden in DMEM-10% FCS mit Standard-Zellkultur-Protokolle kultiviert. Plasmide für Renilla Luziferase Fusionen wurden bereits 1 beschrieben. DNA für diese Plasmide wird unter Verwendung eines Midiprep Kit von Qiagen. Die Ausbeute sollte etwa 1 -3 mg werden. Messen Sie die DNA-Konzentration und speichern als 1000 ug / ml Stammlösung bei -20 ° C. Vorgehensweise: <ol><li> Einen Tag vor der Transfektion aufgeteilt Cos-1 Zellen in neue 100 x 20 mm Gerichte bei ca. 2 x 10 6 pro Platte und bei 37 ° C. </li><li> Am folgenden Tag sollte der Cos-1 Zellen werden 80-95% konfluent. Label 1,5 ml Polypropylen Mikrozentrifugenröhrchen für jedes Plasmid-DNA transfiziert werden. Lassen Sie die FuGENE-6 Transfektionsreagenz, welches bei 4 ° C gelagert, um sich aufzuwärmen, um Raumtemp. </li><li> Add 94 ul der Opti-MEM Medien in jedes Mikrozentrifugenröhrchen. Als nächstes fügen Sie 6 ul FuGENE 6 zur Opti-MEM Medium ohne Berührung der Seitenwand. </li><li> Inkubieren Sie die Mischung für 5 Minuten bei Raumtemperatur. </li><li> Fügen Sie 1-2 pg (von 1mg/ml DNA stock) von Plasmid für Renilla Luziferase Antigen Fusionskonstrukt. Mix und dann inkubieren die Mischung für 15 Minuten bei Raumtemperatur. </li><li> Übertragen Sie die DNA-FuGENE 6-Opti-MEM-Lösung, um die Zellen durch Abtropfen es gleichmäßig in den Medien der COS1 Zellen. </li></ol> TEIL 2: Die Ernte Renilla-Antigen-Fusions <ol><li> Zwei Tage nach der Transfektion werden die Cos-1 Zellen geerntet. Dies wird durch Entfernen des Mediums und dann Spülen der Zellen mit 6 ml PBS eingeleitet. Nach Dekantieren des PBS, Pipette entfernt restliche PBS aus dem Gewebe Kulturschale. </li><li> Fügen Sie 1,4 ml kaltem Lysepuffer 50 mM Tris, pH 7,5, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl 2, 1% Triton X-100, 50% Glycerin und Protease-Inhibitoren (2 Tabletten von kompletten miniprotease Inhibitor Cocktail pro 50 ml zusammen Lysepuffer). Ernten Sie die Zellen mit einer Zelle scrapper und schnell übertragen Hälfte des Lysats auf jeweils zwei 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis. </li><li> Ein Branson Sonifier 150 wird verwendet, um die Zellwände aufbrechen. Legen Sie die Mikrozentrifugenröhrchen mit dem Zelllysat auf Eis und Impuls für 5 Sek., 5 Sek. und 5 Sek. mit Ultraschall-Einstellungen von 2, 2 bzw. 4. </li><li> Centrifuge das Zelllysat bei 12.500 RPM für zwei 4 Minuten dreht sich bei 4 ° C. Nach dem ersten Spin, vorsichtig umdrehen den Rohren, die lose Trümmer von der Seitenwand des Rohres zu entfernen. Nach dem zweiten Spin Transfer vorsichtig den Überstand ab, ohne dass das Pellet aus den beiden Röhren ein neues Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis. </li><li> Berechnen Sie die Licht-Einheiten (GVE) je pl Lysat. Zur Messung der LU, verdünnte 1 ul Lysat mit 8 ul PBS in einem neuen Mikrozentrifugenröhrchen. Direkt mit 100 ul 1X Coelenterazin Substrat, um die verdünnte Mischung und sofort messen Lumineszenz in der Röhre mit einem Rohr Luminometer (20/20 n Turner Scientific) mit einem 5 Sekunden gelesen. </li><li> Bewahren Sie die Ruc-Antigen-Lysat bei -20 ° C für 1-2 Tage oder für einen längeren Zeitraum, wie oft in Aliquots bei -80 ° C. </li></ol> TEIL 3: Vorbereiten eines Sera Masterplatte <ol><li> Machen Sie eine sera Master Platte hergestellt, indem zunächst 450 ul Puffer A (50 mM Tris, pH 7,5, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl 2, 1% Triton X-100) in jede Vertiefung einer 96-Deep-Well Polypropylen Mikrotiterplatte . Bei diesem Schritt kann ein Farbstoff, Phenolrot, auch in Puffer A aufgenommen werden, (Endkonzentration liegt bei 0,2 pg / ml in Puffer A) als Tracer für die Überwachung künftiger sera Probenzugabe und andere Schritte der LIPS-Assay zu handeln, um. </li><li> Als nächstes fügen Sie 50 ul Serum von jeder Probe, die verschiedenen Vertiefungen mit 450 ul Puffer A. Hinweis: Dies ist eine 1:10 Verdünnung der Seren in Puffer A. In der Regel Seren wird nicht auf die letzten beiden Vertiefungen der Master-Platte gegeben, weil Dies ist für den Puffer Rohlinge vorbehalten. </li><li> Vor der Verwendung der Master-Platte, ist es ausgiebig geschüttelt (1-2 Stunden) auf einem Rotator-Plattform. Das Serum in die Master-Platte ist staBLE für mindestens 1 Monat (oder länger) bei 4 ° C, wenn sie richtig, um Verdunstung zu verhindern gespeichert. </li><li> Wie unten beschrieben, bietet das Master-Platte 10 ul der verdünnten Seren wiederholt für die Profilierung der Seren gegen mehrere Antigene entfernt werden. Größere und kleinere Master-Platten können ebenfalls eingesetzt werden. Verschließen Sie die Platte gut mit Parafilm, wenn es nicht benutzt wird. </li></ol> TEIL 4: LIPS-Test <ol><li> Polypropylen 96-flachen Mikrotiterplatten werden verwendet, um sera Test. Im ersten Schritt, dann werden 40 ul Puffer A zu jedem Well der 96-Well-Platte mit einem 8-Kanal Mikropipette. </li><li> Nehmen Sie als nächstes 10 ul der verdünnten Seren (1 ul sera gleichwertig) von der Master-Platte und fügen Sie ihn direkt in jede Vertiefung der Arbeitsplatte mit einem 8-Kanal Mikropipette. </li><li> Ein Master-Mix mit den Ruc-Antigen-Extrakt ist neben solchen, die 1 x 10 7 light units (LU) in 50 ul Puffer A in jede Vertiefung gegeben formuliert. Lower-Eingänge (nur 1 X 10 6) können ebenfalls verwendet werden, sondern führen zu einer geringeren dynamischen Bereichs. Machen Sie dieses Master-Gemisch und Pipette 50 ul Ruc-Antigen-Gemisch in jede Vertiefung. </li><li> Die Platte auf einem Schüttler für 1 Stunde bei Raumtemperatur. </li><li> Während der Inkubation mit 5 ul einer 30% igen Suspension von Ultralink Protein A / G-Beads (Pierce Biotechnology, Rockford, IL) in PBS auf den Boden jeder Vertiefung einer neuen 96-Loch-Filter HTS-Platte (Millipore, Bedford, MA) . </li><li> Nach dem 1 Stunde Inkubation, übertragen Sie die 100 ul Ruc-Antigen-Antikörper-Reaktion Mischung auf 96-Well-Filter HTS-Platten, die das Protein A / G Kügelchen mit einem 8-Kanal Mikropipette. </li><li> Inkubieren Sie die 96-Well-Filterplatte auf einem Schüttler für 1 weitere Stunde bei Raumtemperatur. </li><li> Next waschen Sie den Filter Platte auf einem Vakuumkammer. Jedes der gut ist 8-mal mit 100 ul Puffer A gewaschen, gefolgt von zwei Mal mit 100 ul PBS. Dies kann manuell oder mit einem Roboter Pipettieren Workstation durchgeführt werden. </li><li> Nach der letzten Waschung wird das Vakuum abgeschaltet. Entfernen Sie die Filterplatte und blot es trocken mit einem Stapel von Papiertüchern oder Filterpapier achten Sie darauf, Feuchtigkeit auf der Ober-und Unterseite der Platte zu entfernen. </li></ol> TEIL 5: Messung der Lumineszenz und Datenanalyse Set-up: A Berthold LB 960 Centro Mikroplatten-Luminometer ist für die Bestimmung Lumineszenz in jede Vertiefung mit einer einzigen Düse verwendet. Nachdem die Maschine eingeschaltet ist, spülen Sie den Injektor mit destilliertem H 2 O mit dem Injektor Waschgang. Coelenterazin Substrat hergestellt unter Verwendung des Promega Renilla Substrat-Kit, wie vom Hersteller beschrieben. In der Regel 6 ml 1X Coelenterazin Substrat-Mix (dh 60 ul Coelenterazin Lager plus 6 ml 1X Puffer) ist für die Grundierung der Maschine vorbereitet und läuft eine volle 96-Well-Platte. Vor einer Analyse der Platte ist der Berthold LB 960 Centro Mikroplatten-Luminometer mit 1X Coelenterazin Substrat grundiert. Öffnen Sie ein Programm-Datei mit den Einstellungen für die Injektion des Substrates und das Lesen der Platte. Für diese Messungen wurden 50 ul Coelenterazin Substrat gespritzt wird, ist die Platte für 2 sec, durch ein 5 sec von Lumineszenz lesen gefolgt erschüttert. <ol><li> Obwohl die Platte Luminometer hat die Fähigkeit, die gesamte Platte zu lesen, kann eine partielle Lese von der Platte auch gewählt werden (unter der Lese-Menü) werden. Starten Sie das Programm, das von der Platte lesen initiiert. </li><li> Nach dem Lauf entfernen Sie die Mikrotiterplatte Filterplatte umgehend Verschütten in das Luminometer zu verhindern. Exportieren Sie die Daten mit dem MikroWin Programm in eine Excel-Format für die Analyse generiert. </li><li> Wir empfehlen die Beurteilung der Seren von zwei unabhängigen läuft. Die Daten werden dann gemittelt, um die LU-Titer-Werte für jede Probe zu erzeugen. Diese Werte können weiter angepasst, um den Puffer Rohlinge subtrahieren werden. </li><li> Zusätzliche Datenanalyse wie die Bestimmung der Cut-off aus dem Mittelwert plus 3 oder 5 Standardabweichungen der Steuerung Werte berechnet werden können. </li></ol>

<ol><li>Burbelo, P. D., Goldman, R., Mattson, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simplified+immunoprecipitation+method+for+quantitatively+measuring+antibody+responses+in+clinical+sera+samples+by+using+mammalian-produced+Renilla+luciferase-antigen+fusion+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A simplified immunoprecipitation method for quantitatively measuring antibody responses in clinical sera samples by using mammalian-produced Renilla luciferase-antigen fusion proteins.</a> BMC Biotechnol. 5, 22-22 (2005).</li>
<li>Burbelo, P. D., Leahy, H. P., Iadarola, M. J., Nutman, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Four-Antigen+Mixture+for+Rapid+Assessment+of+Onchocerca+volvulus+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Negl+Trop+Dis%22%5BJournal%5D)">A Four-Antigen Mixture for Rapid Assessment of Onchocerca volvulus Infection.</a> PLoS Negl Trop Dis. 3, e438-e438 (2009).</li>
<li>Burbelo, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitive+and+robust+luminescent+profiling+of+anti-La+and+other+autoantibodies+in+Sj+gren%E2%80%99s+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Autoimmunity%22%5BJournal%5D)">Sensitive and robust luminescent profiling of anti-La and other autoantibodies in Sj gren’s syndrome.</a> Autoimmunity. 139, 241-245 (2009).</li>
<li>Burbelo, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+antibody+quantification+and+generation+of+whole+proteome+antibody+response+profiles+using+LIPS+%28luciferase+immunoprecipitation+systems%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Rapid antibody quantification and generation of whole proteome antibody response profiles using LIPS (luciferase immunoprecipitation systems).</a> Biochem Biophys Res Commun. 352, 889-895 (2007).</li>
<li>Burbelo, P. D., Groot, S., Dalakas, M. C., Iadarola, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+definition+profiling+of+autoantibodies+to+glutamic+acid+decarboxylases+GAD65%2FGAD67+in+stiff-person+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">High definition profiling of autoantibodies to glutamic acid decarboxylases GAD65/GAD67 in stiff-person syndrome.</a> Biochem Biophys Res Commun. 366, 1-7 (2008).</li>
<li>Burbelo, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+luminescence+assay+for+autoantibodies+to+mammalian+cell-prepared+insulinoma-associated+protein+2%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Care%22%5BJournal%5D)">A new luminescence assay for autoantibodies to mammalian cell-prepared insulinoma-associated protein 2.</a> Diabetes Care. 31, 1824-1826 (2008).</li>
<li>Burbelo, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serological+diagnosis+of+human+herpes+simplex+virus+type+1+and+2+infections+by+luciferase+immunoprecipitation+system+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Vaccine+Immunol%22%5BJournal%5D)">Serological diagnosis of human herpes simplex virus type 1 and 2 infections by luciferase immunoprecipitation system assay.</a> Clin Vaccine Immunol. 16, 366-371 (2009).</li>
<li>Burbelo, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+quantitative+serological+detection+of+anti-cytomegalovirus+%28CMV%29+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Virol+J%22%5BJournal%5D)">Highly quantitative serological detection of anti-cytomegalovirus (CMV) antibodies.</a> Virol J. 6, 45-45 (2009).</li>
<li>Burbelo, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Four-antigen+mixture+containing+v-cyclin+for+serological+screening+of+human+herpesvirus+8+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Vaccine+Immunol%22%5BJournal%5D)">Four-antigen mixture containing v-cyclin for serological screening of human herpesvirus 8 infection.</a> Clin Vaccine Immunol. 16, 621-627 (2009).</li>
<li>Ramanathan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+luciferase+immunoprecipitation+systems+assay+enhances+the+sensitivity+and+specificity+of+diagnosis+of+Strongyloides+stercoralis+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">A luciferase immunoprecipitation systems assay enhances the sensitivity and specificity of diagnosis of Strongyloides stercoralis infection.</a> J Infect Dis. 198, 444-451 (2008).</li>
</ol>

LIPS erfordert nur minimale Assay-Optimierung und wegen seiner Einfachheit, qualitativ hochwertige Daten können in der Regel unter Verwendung LIPS in weniger als zwei Wochen für ein bestimmtes Antigen. Die zeitaufwendige Schritte sind das Klonen und die Erzeugung der entsprechenden Plasmid-Expressionsvektor mit der RUC-Antigen-Fusion. Sobald diese Plasmide erzeugt werden, können einzelne oder mehrere Antigene rasch mit LIPS getestet werden, wie oben beschrieben. Anzumerken ist, dass LIPS sehr vielseitig ist, dass Seren können auch in einem Rohr-Format oder alternativ auf einem Mikrotiter-Filterplatte mit Hilfe eines BIOMEK Roboter-Arbeitsstation 2 oder einem Teller Scheibe mit Vakuumfiltration getestet werden. Diese hoch skalierbare System ermöglicht die parallele LIPS Profilierung von einer Gruppe von Menschen Autoantigene 3 oder das gesamte Proteom eines Virus 4. Es ist wahrscheinlich, dass viele verschiedene Antikörper-Profile von LIPS generiert wird nützlich sein, für die Diagnostik 3-9, Entdeckung von Antigenen 9, nach dem Verlauf einer Behandlung 10, Impfstoff Überwachung und hat weitreichende Auswirkungen für bestimmte Erkrankungen und für die öffentliche Gesundheit im Allgemeinen.

<table><tbody><tr><td>HiSpeed-Plasmid-Midi-Kit</td><td>Qiagen</td><td>12643</td><td></td></tr><tr><td>Zellkulturschalen, 100 x 20 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Invitrogen</td><td>31985</td><td></td></tr><tr><td>FuGENE 6</td><td>Roche Group</td><td>1814443</td><td></td></tr><tr><td>Complete, Mini Proteaseinhibitor-Cocktail</td><td>Roche Group</td><td>11836153001</td><td></td></tr><tr><td>Polypropylen-96-DeepWell-Platte, 1 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-566-120</td><td>Tieflochplatte mit Deckel und Verschluss mit Parafilm</td></tr><tr><td>Polypropylen-Mikrotiterplatte</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-566-120</td><td></td></tr><tr><td>HTS-Filterplatte</td><td>EMD Millipore</td><td>MSBVN1B50</td><td></td></tr><tr><td>Ultralink immobilisiertes Protein A/G</td><td>Pierce, Thermo Scientific</td><td>53133 (10 ml)</td><td></td></tr><tr><td>Renilla-Luciferase-Assay-System</td><td>Promega Corp.</td><td>E2820</td><td>Für 2000 Assays</td></tr><tr><td>Centro-Mikroplatten-Luminometer</td><td>Berthold Technologies</td><td>LB 960</td><td></td></tr></tbody></table>

antikörper profiling von luciferase immunpräzipitation systems (lips)

Antibody Profiling by Luciferase Immunoprecipitation Systems (LIPS)

Technologien für umfassend zu verstehen und zu quantifizieren Antikörper-Profile auf Autoantigene und Infektionserreger können neue Einblicke in die Krankheitsmechanismen Ertrag und können neue Marker für Krankheiten aufzuklären mit unterschiedlichen klinischen Merkmalen substratify und besser zu verstehen Pathogenese. Wir haben eine sehr quantitative Methode aufgerufen Luciferase Immunpräzipitation Systems (LIPS) zur Profilierung Patientenseren Antikörper-Antwort auf Autoantigene und Erreger-Antigenen mit einer Infektion assoziiert entwickelt. Im Gegensatz zu ELISAs, ist das hoch empfindliche Lippen leicht implementiert, um humoralen serologischen Antwort Profile verschiedener Antigene in einem universellen Format Umfrage und produziert dynamische Antikörper-Titer im Bereich von bis zu 6 log<sub&gt; 10</sub&gt; Für einige Antigene. In diesen Studien wird die quantitative Profilierung von LIPS von Patienten humorale Reaktionen gegen Platten von Antigenen oder sogar das gesamte Proteom von einigen Krankheitserregern (zB HIV), in der Regel aussagekräftiger als Tests ein einziges Antigen mittels ELISA. Darüber hinaus LIPS eliminiert auch Zeit und den Aufwand zu hoch gereinigten Antigene sowie die arbeits-Assay Optimierungsschritte für Standard-ELISAs benötigt werden. Hier bieten wir Ihnen ein detailliertes Protokoll beschreibt die technischen Aspekte der Durchführung LIPS-Assays für leicht Profilierung Antikörper-Antworten auf einzelne oder mehrere Antigene.

Die technischen Aspekte der Durchführung LIPS (Luciferase Immunpräzipitation Systems) beschrieben sind. Das Gesamtkonzept beinhaltet Ausdruck chimären Gene Antigene fusioniert an Renilla Luziferase (RUC) in Säugerzellen. Crude Ruc-Antigen-Extrakte werden dann aufbereitet und ohne Reinigung eingesetzt in Immunpräzipitationsassays, um Antikörper zu quantifizieren.

Antikörper Profiling von Luciferase Immunpräzipitation Systems (LIPS)

Technologien zur umfassenden Analyse und Quantifizierung von Antikörperprofilen gegen Autoantigene und infektiöse Erreger können neue Erkenntnisse über Erkrankungen liefern ...

In diesem Video werden die Schritte zur Durchführung des Lips-Assays gezeigt. Antigene werden in CO1-Zellen als rekombinante Renilla-Luciferase- oder Rook-Antigen-Fusionen exprimiert. Rohextrakte werden gewonnen und ohne Reinigung verwendet.Der LIPS-Assay wird durch Inkubation von rohen Rook-Antigenextrakten mit Patienten-SRA gestartet. In Mikrotiterbrunnen wird das Antikörper-Antigen-Gemisch anschließend auf eine 96-Loch-Filterplatte überführt, die Protein-A/G-Kügelchen enthält, um nach dem Waschen der Filterplatte mit den Protein-A/G-Kügelchen IgG-Moleküle zu isolieren. Das gebundene Rook-Antigen wird durch Zugabe eines Luminogensubstrats gemessen, und die Lichteinheiten werden mit einem Luminometer erfasst.Hallo, ich bin Dr. Catherine Chang aus dem Labor für Sinnesbiologie am National Institute of Dental and Craniofacial Research. Heute zeigen wir Ihnen das Verfahren für das Luciferase-Immunpräzipitationssystem der Lippen. Wir verwenden das LIPS in unserem Labor, um Antikörpertiter zur Diagnose von Krankheiten und/oder Infektionen zu messen.Subst stratifiziert Krankheitszustände, überwacht Impfungen und andere Anwendungen, die bei der Erzeugung von Antikörperprofilen eine Rolle spielen. Beginnen wir also. Vor Beginn der Transfektion werden die Plasmide für Vanille-Luciferase-Fusionen im Voraus wie in der BMC Biotechnologie-Publikation beschrieben vorbereitet.BYO etal 2005 Plasmidna wird mit einem MIDI-Präp-Kit hergestellt, wobei eine Ausbeute von ein bis drei Milligramm erzielt wird, und als Stammlösung mit einer Konzentration von einem Milligramm pro Milliliter bei minus 20 Grad Celsius gelagert. Die für die Transfektion verwendeten Cost-one-Zellen werden in DMEM mit 10 % FCS gemäß standardmäßiger Gewebekulturprotokolle kultiviert. Einen Tag vor der Transfektion werden die Cost-one-Zellen in neue 100 mal 20 Millimeter-Dishs aufgeteilt, sodass etwa zwei mal 10 hoch sechs Zellen pro Platte vorliegen, und am folgenden Tag bei 37 Grad Celsius inkubiert.Die Zellen sollten 80 bis 95 % konfluent sein. Lassen Sie das FU-Gen und das Transfektionsreagenz, das bei vier Grad Celsius gelagert wird, auf Raumtemperatur erwärmen, während Sie darauf warten, dass das FU-Gen aufwärmt. Beschriften Sie 1,5-Milliliter-Polypropylen-Mikrozentrifugenröhrchen für jede zu transfizierende Plasmid-DNA, wobei darauf zu achten ist, die Seitenwände der Röhrchen nicht zu berühren. Geben Sie sechs Mikroliter FU-Gen-Sechs zu den Röhrchen hinzu, die bereits 94 Mikroliter Opti-Medium enthalten sollen, und inkubieren Sie fünf Minuten lang bei Raumtemperatur. Fügen Sie anschließend ein bis zwei Mikrogramm Plasmid für den ran-Luciferase-Antigen-Fusionskonstrukt hinzu, mischen Sie durch mehrmaliges Umstülpen des Röhrchens, zentrifugieren Sie kurz und inkubieren Sie 15 Minuten bei Raumtemperatur.Überführen Sie die gesamte DNA-Fusionslösung in die Zellen, indem Sie sie gleichmäßig in das Medium der Cos-1-Zellen tropfen. Inkubieren Sie die transfizierten Cos-1-Zellen zwei Tage lang und ernten Sie sie anschließend. Um mit der Gewinnung des Fusionsproteins zu beginnen, entfernen Sie das Medium und waschen Sie die Zellen mit sechs Millilitern PBS.Leiten Sie restliches PBS aus der Zellkulturschale ab, geben Sie 1,4 Milliliter kalte Lysepuffer hinzu und lösen Sie die Zellen mit einem Zellabstreifer ab. Übertragen Sie anschließend schnell die Hälfte des Lysats auf zwei 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen, die auf Eis liegen. Ein Branson SOLIDIFIER one 50 wird verwendet, um die Zellen zu lysieren. Stellen Sie das Mikrozentrifugenröhrchen mit dem Zelllysat auf Eis und pulsieren Sie fünf Sekunden lang.Fünf Sekunden und fünf Sekunden. Bei Beschallungseinstellungen von zwei, zwei und vier entsprechend. Zentrifugieren Sie das Zelllysat bei 12.500 U/min für zwei vier Minuten.Zentrifugieren bei vier Grad Celsius. Die Röhrchen zwischen den Zentrifugationsschritten vorsichtig durch leichtes Invertieren umrühren, um lose an der Röhrchenwand anhaftende Partikel zu lösen. Anschließend das Überstandsvolumen vorsichtig in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis überführen, wobei das Pellet nicht aufgewirbelt werden darf.Um die Lichteinheiten oder lu des Lysats zu messen, verdünnen Sie ein Mikroliter Lysat mit acht Mikrolitern PBS in einem neuen Mikrozentrifugenröhrchen, geben Sie direkt 100 Mikroliter eines Celent-in-Substrats zur verdünnten Mischung hinzu und messen Sie unverzüglich die Lumineszenz im Röhrchen mit einem Röhrchen-Luminometer mit einer Messdauer von fünf Sekunden ab diesem Schritt. Denken Sie daran, Sicherheitsvorkehrungen zu beachten, wenn Sie mit menschlichen und tierischen S-Proben arbeiten, um eine Serum-Hauptplatte als Quelle für patientenstammende Antikörper für die Antigen-Profilierung herzustellen. Fügen Sie zunächst 450 Mikroliter Puffer A in jedes Loch einer 96er-Tiefbrunnen-Polypropylen-Mikrotiterplatte hinzu.In diesem Schritt kann auch ein Farbstoff, Phenolrot, in Puffer A eingeschlossen werden, um als Tracer zur Überwachung zukünftiger SRA-Probenbearbeitung und anderer Schritte des Lippen-Assays zu dienen. Als Nächstes geben Sie 50 Mikroliter Serum von jeder Probe in jede Vertiefung, die 450 Mikroliter Puffer enthält. Hinweis: Dies ist eine 1:10-Verdünnung des SRA im Puffer.Üblicherweise wird SRA nicht in die letzten beiden Vertiefungen der Masterplatte gegeben, da diese für die Pufferblanks reserviert sind, bevor die Masterplatte für die spätere Verwendung aufbewahrt wird. Sie wird ausgiebig für ein bis zwei Stunden auf einer rotierenden Plattform geschüttelt. Bei 650 U/min ist das Serum mindestens einen Monat oder länger bei vier Grad Celsius stabil, und die Platte kann mit Parafilm versiegelt werden, um Verdunstung zu verhindern, falls sie vor der Durchführung des Lipidassays gelagert wird. Erstellen Sie eine Tabellenkalkulation, die die Probenidentifikationsnummern und die zugehörigen Vertiefungen auf der Masterplatte enthält. Polypropylen-Mikrotiterplatten mit 96 flachen Vertiefungen dienen als Arbeitsplatten zur Untersuchung von Seren.Im ersten Schritt fügen Sie mit einer achtkanaligen Mikropipette 40 Mikroliter Puffer A in jedes Loch der 96-Loch-Platte hinzu. Danach entnehmen Sie 10 Mikroliter verdünntes Serum aus der Masterplatte und geben es mit einer achtkanaligen Mikropipette direkt in jedes Loch der Arbeitsplatte. Versiegeln Sie die Masterplatte nach Gebrauch mit Parafilm, setzen Sie den Deckel wieder auf die Masterplatte, umschließen Sie sie mit Frischhaltefolie und lagern Sie sie bei vier Grad Celsius. Eine Master-Mix-Lösung, die den Rook-Antigenextrakt enthält, wird anschließend so hergestellt, dass je 50 µL Puffer A mit einer Menge von 1 × 10⁷ LU pro 50 µL versetzt werden. Bereiten Sie diese Master-Mix-Lösung zu und pipettieren Sie 50 µL der Rook-Antigenmischung in jedes. Decken Sie die Platte mit einer Polystyrol-Plattenabdeckung ab und inkubieren Sie sie eine Stunde lang auf einem rotierenden Schüttler bei 100 min⁻¹.Entnehmen Sie bei Raumtemperatur während der Inkubation eine 1,5-Milliliter-Aliquot einer 30 %igen Ultra-Link-Protein-Ag-Beadsuspension in PBS aus dem Kühlschrank. Geben Sie fünf Mikroliter auf den Boden jedes Wells einer neuen 96-Well-Filter-HTS-Platte. Nach der einstündigen Platteninkubation übertragen Sie die 100 Mikroliter große Reaktionsmischung aus Rook-Antigen und Antikörper mit einer A-Kanal-Mikropipette in 96-Well-Filter-HTS-Platten, die die Protein-Ag-Beads enthalten, und inkubieren die 96-Well-Filterplatte eine zusätzliche Stunde lang bei 100 U/min bei Raumtemperatur auf einem Rotationsraschler.Anschließend wird die Filterplatte mithilfe einer Biomek FX-Automatisierungsworkstation mit Vakuummanifold gewaschen. Jedes Loch wird achtmal mit jeweils 100 µL Puffer A und danach zweimal mit jeweils 100 µL PBS gespült. Nach dem letzten Waschschritt wird das Vakuum abgeschaltet. Die Filterplatte wird entfernt und mit einem Stapel Papiertüchern oder Filterpapier trockengetupft, wobei darauf geachtet werden muss, dass Feuchtigkeit sowohl auf der Ober- als auch auf der Unterseite der Platte entfernt wird. Zur Bestimmung der Lumineszenz in jedem Loch der Platte wird ein Berthold LB 960 Centro Mikroplatten-Luminometer verwendet.Schalten Sie das Gerät ein und spülen Sie den Injektor mit destilliertem Wasser. Für das Spülen und Betreiben des Geräts wird im Injektorwaschzyklus das INE-Substrat verwendet, das mit dem Promega-Ranil-Substratkit gemäß den Herstelleranweisungen hergestellt wird; typischerweise werden sechs Milliliter einer hervorragenden Tine-Substratmischung pro Platte benötigt. Füllen Sie die Substratmischung in das Luminometer und öffnen Sie eine Programmdatei, die die Einstellungen für die Substratinjektion und das Auslesen der Platte enthält.Für diese Messungen werden 50 Mikroliter Substratlösung injiziert. Die Platte wird zwei Sekunden lang geschüttelt, gefolgt von einer fünfsekündigen Messung der Lumineszenz.Starten Sie das Programm, das nach dem Durchlauf das Auslesen der Platte einleitet, und entfernen Sie die Mikrotiter-Filterplatte umgehend, um Verschüttungen im Luminometer zu vermeiden. Die Daten werden automatisch aus dem Microwind-Programm in ein Excel-Format zur weiteren Analyse exportiert. Mittelung der Ergebnisse für zwei verschiedene Durchläufe mit denselben Seren.Um LUs-Titerwerte für jede Probe zu ermitteln, wird empfohlen, dass die Duplikatproben eine hohe Übereinstimmung der Titerwerte zwischen den beiden Messungen aufweisen. Zur Datenauftragung können die LUs-Titerwerte zusätzlich angepasst werden, indem die Puffer-Blanks subtrahiert werden, wie hier dargestellt.Die Empfindlichkeit und Spezifität des Assays können ebenfalls berechnet werden, indem Schwellenwerte verwendet werden, die sich aus dem Mittelwert plus drei oder fünf Standardabweichungen der Kontrollproben ergeben. Wir haben Ihnen gerade gezeigt, wie man Antikörpertiter mithilfe von LIPS bestimmt. LIPS erfordert eine minimale Assay-Optimierung und kann aufgrund seiner Einfachheit verwendet werden, um innerhalb von weniger als zwei Wochen hochwertige Daten für jedes beliebige Antigen zu generieren. Bei der Arbeit mit menschlichem Serum ist es wichtig, sich daran zu erinnern, geeignete Sicherheitsvorkehrungen zu treffen.Beachten Sie außerdem, dass Lifts hochgradig skalierbar ist und daher zur Analyse einer geringen Anzahl von Proben mittels manuellem Waschen oder einer kompletten Platte mithilfe einer robotergestützten Arbeitsstation verwendet werden kann. Aufgrund dieser Vielseitigkeit erwarten wir, dass Lips in der seroantigenen Analyse äußerst nützlich sein wird und weite Auswirkungen auf die Krankheitsanalyse und die öffentliche Gesundheit im Allgemeinen haben wird. Das war’s. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Antikörper-Profilierungs-Experimenten.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Ein ELISA kann leicht zu einem Luminex xMAP Assay umgewandelt werden und durch die Vorteile der Multiplexen mehrere Antikörper gleichzeitig gescreent werden, um eine optimale Antikörperpaar zu identifizieren, was zu einer erhöhten Empfindlichkeit und den Dynamikbereich, während reduzierenden Assay einsehbar.

Umbau eines Capture-ELISA zu einem Luminex xMAP Assay unter Verwendung eines Multiplex-Antikörper-Screening-Methode

Das Video zeigt den Luciferase-Assay, der zur Quantifizierung von Luciferase-markierten Proteinen verwendet wird. Der Assay verwendet ein künstlich hergestelltes Luciferase-Enzym, das aus einem großen Fragment besteht, das an das kleine Fragment bindet, das mit einem Protein von Interesse konjugiert ist. Die gebundenen Untereinheiten bilden ein aktives Enzym, das in Gegenwart des Substrats ein Lumineszenzsignal freisetzt. Dieses Signal wird dann mit einem Luminometer quantifiziert.

Der Luciferase-Assay: Ein Hochdurchsatz-Assay zur Messung von Lumineszenzsignalen mit Hilfe von Bioreportern auf Basis von Nanoluziferase-Systemen

Dieses Video zeigt die Verwendung des ELISpot-Assays zur Beurteilung der Funktion von Antikörper-sezernierenden B-Zellen, ASCs. Die von den ASCs sezernierten Antikörper interagieren mit den membrangebundenen polyklonalen Antikörperfragmenten, die von den enzymkonjugierten IgG- oder IgM-Antikörpern nachgewiesen werden. Der farbige Fleck, der in jeder Vertiefung produziert wird, zeigt das Vorhandensein des Isotyps des spezifischen Antikörpers an, der mit der sekretorischen Aktivität der B-Zellen...

Funktionelle Bewertung von Antikörper-sezernierenden B-Zellen mittels ELISpot-Assay

Menschliches peripheres Blut wird häufig zur Beurteilung der humoralen Immunantwort verwendet. Im Folgenden werden die Methoden zur Isolierung humaner B-Zellen aus peripherem Blut, zur Differenzierung humaner B-Zellen in Antikörper (Ab)-sezernierende B-Zellen (ASCs) in Kultur und zur Aufzählung der Gesamt-IgM- und IgG-ASCs über einen ELISpot-Assay beschrieben.

Die Isolation, Differenzierung und Quantifizierung von Human-Antikörper-sezernierenden B-Zellen aus Blut: ELISpot als Functional Readout der humoralen Immunität

Protein-Wechselwirkungen können sowohl im Zellkern als auch im Zytoplasma einer Zelle auftreten. Um diese Wechselwirkungen zu untersuchen, werden die traditionelle Co-Immunpräzipitation und der moderne Proximity-Ligationsassay eingesetzt. In dieser Studie vergleichen wir diese beiden Methoden, um die Verteilung der NF90-RBM3-Wechselwirkungen im Zellkern und im Zytoplasma sichtbar zu machen.

Visualisierung von Protein-Protein-Wechselwirkung in Kern- und Cytoplasma-Fraktionen durch Co-Immunpräzipitation und<em&gt; In Situ</em&gt; Nähe Ligatur Assay

Eine Kapillare-basierte Immunoassay mit einer kommerziellen Plattform zu Zielproteine von Gesamtprotein Vorbereitungen messen wird demonstriert. Darüber hinaus sind Assay Parametern Belichtungszeit, Proteinkonzentration und Antikörper-Verdünnung für ein Zellkultursystem Modell optimiert.

Verfahren und wichtige Optimierungsstrategien für eine automatisierte Kapillar elektrophoretischen basierende Immunoassay-Methode

Hier zeigen wir, wie eine Nähe Ligation Assay (PLA) verwenden, um MST1/MST2 Heterodimerization in festen Zellen mit hoher Empfindlichkeit zu visualisieren.

Erkennung von Heterodimerization Protein-Isoformen, die mit einem in Situ Nähe Ligation Assay

Hier präsentieren wir Ihnen eine Luciferase-basierten Biosensor zur Quantifizierung der Kinase-Aktivität von großen Tumorsuppressor (LATS)-einer zentralen Kinase in den Signalweg Hippo. Diese Biosensor hat vielfältige Anwendungen in Grundlagen- und Translationale Forschung zur Hippo Weg Regulierungsbehörden in Vitro und in Vivozu untersuchen.

Überwachung von Hippo Signalisierung Pathway-Aktivität unter Verwendung eines Biosensors Luciferase-basierte großen Tumorsuppressor (LATS)

Die BSelex-Methode zur Identifizierung und Wiederherstellung einzelner antigenspezifischer Antikörper aus menschlichen peripheren mononukleären Blutzellen kombiniert Durchflusszytometrie mit einzelliger PCR und Klonen.

Einzellige Screening-Methode zur Auswahl und Wiederherstellung von Antikörpern mit gewünschten Besonderheiten aus angereicherten menschlichen Gedächtnis B-Zellpopulationen

Das skizzierte Protokoll beschreibt das Verfahren zur Herstellung des HiBiT-Rezeptor-bindenden Domänenproteinkomplexes und seine Anwendung für den schnellen und sensitiven Nachweis von SARS-CoV-2-Antikörpern.

Nachweis eines SARS-CoV-2-Rezeptor-bindenden Domänenantikörpers mit einem HiBiT-basierten Bioreporter

Lernen Sie das Luciferase Immunpräzipitation Systems (LIPS) zur Antikörperquantifizierung in COS-1-Zellen mit Rohlysaten. Diese effiziente Methode ermöglicht präzise Antikörperprofile für diagnostische Anwendungen.

Antikörper Profiling von Luciferase Immunpräzipitation Systems (LIPS)

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