Antikörper Profiling von Luciferase Immunpräzipitation Systems (LIPS)

In diesem Video werden die Schritte zur Durchführung des Lips-Assays gezeigt. Antigene werden in CO1-Zellen als rekombinante Renilla-Luciferase- oder Rook-Antigen-Fusionen exprimiert. Rohextrakte werden gewonnen und ohne Reinigung verwendet.

Der LIPS-Assay wird durch Inkubation von rohen Rook-Antigenextrakten mit Patienten-SRA gestartet. In Mikrotiterbrunnen wird das Antikörper-Antigen-Gemisch anschließend auf eine 96-Loch-Filterplatte überführt, die Protein-A/G-Kügelchen enthält, um nach dem Waschen der Filterplatte mit den Protein-A/G-Kügelchen IgG-Moleküle zu isolieren. Das gebundene Rook-Antigen wird durch Zugabe eines Luminogensubstrats gemessen, und die Lichteinheiten werden mit einem Luminometer erfasst.

Hallo, ich bin Dr. Catherine Chang aus dem Labor für Sinnesbiologie am National Institute of Dental and Craniofacial Research. Heute zeigen wir Ihnen das Verfahren für das Luciferase-Immunpräzipitationssystem der Lippen. Wir verwenden das LIPS in unserem Labor, um Antikörpertiter zur Diagnose von Krankheiten und/oder Infektionen zu messen.

Subst stratifiziert Krankheitszustände, überwacht Impfungen und andere Anwendungen, die bei der Erzeugung von Antikörperprofilen eine Rolle spielen. Beginnen wir also. Vor Beginn der Transfektion werden die Plasmide für Vanille-Luciferase-Fusionen im Voraus wie in der BMC Biotechnologie-Publikation beschrieben vorbereitet.

BYO etal 2005 Plasmidna wird mit einem MIDI-Präp-Kit hergestellt, wobei eine Ausbeute von ein bis drei Milligramm erzielt wird, und als Stammlösung mit einer Konzentration von einem Milligramm pro Milliliter bei minus 20 Grad Celsius gelagert. Die für die Transfektion verwendeten Cost-one-Zellen werden in DMEM mit 10 % FCS gemäß standardmäßiger Gewebekulturprotokolle kultiviert. Einen Tag vor der Transfektion werden die Cost-one-Zellen in neue 100 mal 20 Millimeter-Dishs aufgeteilt, sodass etwa zwei mal 10 hoch sechs Zellen pro Platte vorliegen, und am folgenden Tag bei 37 Grad Celsius inkubiert.

Die Zellen sollten 80 bis 95 % konfluent sein. Lassen Sie das FU-Gen und das Transfektionsreagenz, das bei vier Grad Celsius gelagert wird, auf Raumtemperatur erwärmen, während Sie darauf warten, dass das FU-Gen aufwärmt. Beschriften Sie 1,5-Milliliter-Polypropylen-Mikrozentrifugenröhrchen für jede zu transfizierende Plasmid-DNA, wobei darauf zu achten ist, die Seitenwände der Röhrchen nicht zu berühren. Geben Sie sechs Mikroliter FU-Gen-Sechs zu den Röhrchen hinzu, die bereits 94 Mikroliter Opti-Medium enthalten sollen, und inkubieren Sie fünf Minuten lang bei Raumtemperatur. Fügen Sie anschließend ein bis zwei Mikrogramm Plasmid für den ran-Luciferase-Antigen-Fusionskonstrukt hinzu, mischen Sie durch mehrmaliges Umstülpen des Röhrchens, zentrifugieren Sie kurz und inkubieren Sie 15 Minuten bei Raumtemperatur.

Überführen Sie die gesamte DNA-Fusionslösung in die Zellen, indem Sie sie gleichmäßig in das Medium der Cos-1-Zellen tropfen. Inkubieren Sie die transfizierten Cos-1-Zellen zwei Tage lang und ernten Sie sie anschließend. Um mit der Gewinnung des Fusionsproteins zu beginnen, entfernen Sie das Medium und waschen Sie die Zellen mit sechs Millilitern PBS.

Leiten Sie restliches PBS aus der Zellkulturschale ab, geben Sie 1,4 Milliliter kalte Lysepuffer hinzu und lösen Sie die Zellen mit einem Zellabstreifer ab. Übertragen Sie anschließend schnell die Hälfte des Lysats auf zwei 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen, die auf Eis liegen. Ein Branson SOLIDIFIER one 50 wird verwendet, um die Zellen zu lysieren. Stellen Sie das Mikrozentrifugenröhrchen mit dem Zelllysat auf Eis und pulsieren Sie fünf Sekunden lang.

Fünf Sekunden und fünf Sekunden. Bei Beschallungseinstellungen von zwei, zwei und vier entsprechend. Zentrifugieren Sie das Zelllysat bei 12.500 U/min für zwei vier Minuten.

Zentrifugieren bei vier Grad Celsius. Die Röhrchen zwischen den Zentrifugationsschritten vorsichtig durch leichtes Invertieren umrühren, um lose an der Röhrchenwand anhaftende Partikel zu lösen. Anschließend das Überstandsvolumen vorsichtig in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis überführen, wobei das Pellet nicht aufgewirbelt werden darf.

Um die Lichteinheiten oder lu des Lysats zu messen, verdünnen Sie ein Mikroliter Lysat mit acht Mikrolitern PBS in einem neuen Mikrozentrifugenröhrchen, geben Sie direkt 100 Mikroliter eines Celent-in-Substrats zur verdünnten Mischung hinzu und messen Sie unverzüglich die Lumineszenz im Röhrchen mit einem Röhrchen-Luminometer mit einer Messdauer von fünf Sekunden ab diesem Schritt. Denken Sie daran, Sicherheitsvorkehrungen zu beachten, wenn Sie mit menschlichen und tierischen S-Proben arbeiten, um eine Serum-Hauptplatte als Quelle für patientenstammende Antikörper für die Antigen-Profilierung herzustellen. Fügen Sie zunächst 450 Mikroliter Puffer A in jedes Loch einer 96er-Tiefbrunnen-Polypropylen-Mikrotiterplatte hinzu.

In diesem Schritt kann auch ein Farbstoff, Phenolrot, in Puffer A eingeschlossen werden, um als Tracer zur Überwachung zukünftiger SRA-Probenbearbeitung und anderer Schritte des Lippen-Assays zu dienen. Als Nächstes geben Sie 50 Mikroliter Serum von jeder Probe in jede Vertiefung, die 450 Mikroliter Puffer enthält. Hinweis: Dies ist eine 1:10-Verdünnung des SRA im Puffer.

Üblicherweise wird SRA nicht in die letzten beiden Vertiefungen der Masterplatte gegeben, da diese für die Pufferblanks reserviert sind, bevor die Masterplatte für die spätere Verwendung aufbewahrt wird. Sie wird ausgiebig für ein bis zwei Stunden auf einer rotierenden Plattform geschüttelt. Bei 650 U/min ist das Serum mindestens einen Monat oder länger bei vier Grad Celsius stabil, und die Platte kann mit Parafilm versiegelt werden, um Verdunstung zu verhindern, falls sie vor der Durchführung des Lipidassays gelagert wird. Erstellen Sie eine Tabellenkalkulation, die die Probenidentifikationsnummern und die zugehörigen Vertiefungen auf der Masterplatte enthält. Polypropylen-Mikrotiterplatten mit 96 flachen Vertiefungen dienen als Arbeitsplatten zur Untersuchung von Seren.

Im ersten Schritt fügen Sie mit einer achtkanaligen Mikropipette 40 Mikroliter Puffer A in jedes Loch der 96-Loch-Platte hinzu. Danach entnehmen Sie 10 Mikroliter verdünntes Serum aus der Masterplatte und geben es mit einer achtkanaligen Mikropipette direkt in jedes Loch der Arbeitsplatte. Versiegeln Sie die Masterplatte nach Gebrauch mit Parafilm, setzen Sie den Deckel wieder auf die Masterplatte, umschließen Sie sie mit Frischhaltefolie und lagern Sie sie bei vier Grad Celsius.

Eine Master-Mix-Lösung, die den Rook-Antigenextrakt enthält, wird anschließend so hergestellt, dass je 50 µL Puffer A mit einer Menge von 1 × 10⁷ LU pro 50 µL versetzt werden. Bereiten Sie diese Master-Mix-Lösung zu und pipettieren Sie 50 µL der Rook-Antigenmischung in jedes. Decken Sie die Platte mit einer Polystyrol-Plattenabdeckung ab und inkubieren Sie sie eine Stunde lang auf einem rotierenden Schüttler bei 100 min⁻¹.

Entnehmen Sie bei Raumtemperatur während der Inkubation eine 1,5-Milliliter-Aliquot einer 30 %igen Ultra-Link-Protein-Ag-Beadsuspension in PBS aus dem Kühlschrank. Geben Sie fünf Mikroliter auf den Boden jedes Wells einer neuen 96-Well-Filter-HTS-Platte. Nach der einstündigen Platteninkubation übertragen Sie die 100 Mikroliter große Reaktionsmischung aus Rook-Antigen und Antikörper mit einer A-Kanal-Mikropipette in 96-Well-Filter-HTS-Platten, die die Protein-Ag-Beads enthalten, und inkubieren die 96-Well-Filterplatte eine zusätzliche Stunde lang bei 100 U/min bei Raumtemperatur auf einem Rotationsraschler.

Anschließend wird die Filterplatte mithilfe einer Biomek FX-Automatisierungsworkstation mit Vakuummanifold gewaschen. Jedes Loch wird achtmal mit jeweils 100 µL Puffer A und danach zweimal mit jeweils 100 µL PBS gespült. Nach dem letzten Waschschritt wird das Vakuum abgeschaltet. Die Filterplatte wird entfernt und mit einem Stapel Papiertüchern oder Filterpapier trockengetupft, wobei darauf geachtet werden muss, dass Feuchtigkeit sowohl auf der Ober- als auch auf der Unterseite der Platte entfernt wird. Zur Bestimmung der Lumineszenz in jedem Loch der Platte wird ein Berthold LB 960 Centro Mikroplatten-Luminometer verwendet.

Schalten Sie das Gerät ein und spülen Sie den Injektor mit destilliertem Wasser. Für das Spülen und Betreiben des Geräts wird im Injektorwaschzyklus das INE-Substrat verwendet, das mit dem Promega-Ranil-Substratkit gemäß den Herstelleranweisungen hergestellt wird; typischerweise werden sechs Milliliter einer hervorragenden Tine-Substratmischung pro Platte benötigt. Füllen Sie die Substratmischung in das Luminometer und öffnen Sie eine Programmdatei, die die Einstellungen für die Substratinjektion und das Auslesen der Platte enthält.

Für diese Messungen werden 50 Mikroliter Substratlösung injiziert. Die Platte wird zwei Sekunden lang geschüttelt, gefolgt von einer fünfsekündigen Messung der Lumineszenz.

Starten Sie das Programm, das nach dem Durchlauf das Auslesen der Platte einleitet, und entfernen Sie die Mikrotiter-Filterplatte umgehend, um Verschüttungen im Luminometer zu vermeiden. Die Daten werden automatisch aus dem Microwind-Programm in ein Excel-Format zur weiteren Analyse exportiert. Mittelung der Ergebnisse für zwei verschiedene Durchläufe mit denselben Seren.

Um LUs-Titerwerte für jede Probe zu ermitteln, wird empfohlen, dass die Duplikatproben eine hohe Übereinstimmung der Titerwerte zwischen den beiden Messungen aufweisen. Zur Datenauftragung können die LUs-Titerwerte zusätzlich angepasst werden, indem die Puffer-Blanks subtrahiert werden, wie hier dargestellt.

Die Empfindlichkeit und Spezifität des Assays können ebenfalls berechnet werden, indem Schwellenwerte verwendet werden, die sich aus dem Mittelwert plus drei oder fünf Standardabweichungen der Kontrollproben ergeben. Wir haben Ihnen gerade gezeigt, wie man Antikörpertiter mithilfe von LIPS bestimmt. LIPS erfordert eine minimale Assay-Optimierung und kann aufgrund seiner Einfachheit verwendet werden, um innerhalb von weniger als zwei Wochen hochwertige Daten für jedes beliebige Antigen zu generieren. Bei der Arbeit mit menschlichem Serum ist es wichtig, sich daran zu erinnern, geeignete Sicherheitsvorkehrungen zu treffen.

Beachten Sie außerdem, dass Lifts hochgradig skalierbar ist und daher zur Analyse einer geringen Anzahl von Proben mittels manuellem Waschen oder einer kompletten Platte mithilfe einer robotergestützten Arbeitsstation verwendet werden kann. Aufgrund dieser Vielseitigkeit erwarten wir, dass Lips in der seroantigenen Analyse äußerst nützlich sein wird und weite Auswirkungen auf die Krankheitsanalyse und die öffentliche Gesundheit im Allgemeinen haben wird. Das war’s. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Antikörper-Profilierungs-Experimenten.