Primer Extension Capture: Gezielte Sequence Retrieval von stark degradierte DNA Sources

Dieses Video erklärt die Primer-Extension-Capture- oder PECA-Technik, die die gezielte Gewinnung von DNA-Sequenzen aus extrem geringen Kopienzahlen stark fragmentierter DNA-Quellen ermöglicht. Wir haben diese Technik verwendet, um komplette mitochondriale Genome aus über 40.000 Jahre alten Neandertalerknochen zu sequenzieren, und die Methode kann zur Anreicherung beliebiger kleiner Zielregionen oder einzelner Nukleotid-Polymorphismen aus vielen Individuen eingesetzt werden. Die wichtigsten Schritte dieses Verfahrens sind die PCR-Amplifikation einer primären DNA-Bibliothek, die Quantifizierung der amplifizierten Bibliothek mittels quantitativer PCR, die primäre Ziel-Extension an der amplifizierten Bibliothek, die Bindung der primären Extension-Produkte an Magnetkugeln zur Entfernung nicht-zielspezifischer Fragmente sowie die Elution und Sequenzierung der gebundenen und gewaschenen Zielprodukte.

Hallo, ich bin Adrian Briggs aus dem Labor von Shanti Payable in der Abteilung für Genetik am Max-Planck-Institut für evolutionäre Anthropologie in Leipzig. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Isolierung spezifischer DNA-Sequenzen aus einer komplexen, stark degradierten DNA-Quelle, wie beispielsweise alten Knochen. Mit diesem Verfahren haben wir die mitochondriale genetische Vielfalt von Homo neanderthalensis oder Neandertaler untersucht.

Beginnen wir. Die in unserem Experiment verwendete DNA stammt von Neandertalerknochen, die zwischen 40.000 und 70.000 Jahre alt sind und an verschiedenen Fundorten innerhalb des geografischen Verbreitungsgebiets des Neandertalers entdeckt wurden. Ein Knochen wird zunächst über Nacht UV-Licht ausgesetzt, um die Oberfläche von jeglicher Fremd-DNA zu desinfizieren.

Ein feiner Bohrer wird verwendet, um zwischen 100 und 500 Milligramm Knochenpulver zu erzeugen. Die DNA wird aus dem Knochenpulver mithilfe eines Verfahrens extrahiert, das in dem Artikel „Vergleich und Optimierung der Extraktion antiker DNA“ von Nadine Rockland und Michael Hofreiter aus dem Jahr 2007 beschrieben ist. Der DNA-Extrakt wird anschließend in eine Sequenzierbibliothek umgewandelt, indem universelle Adapter-Priming-Stellen an die Enden aller DNA-Fragmente angehängt werden. Da eine 454-Bibliothek, die aus einem Neandertalerknochen erzeugt wurde, nur winzige Mengen an DNA enthält, manchmal lediglich einige Pikogramm, wird die primäre DNA-Bibliothek zunächst mittels PCR unter Verwendung von Emulsions-PCR-Primern, die den universellen Bibliotheksprimern entsprechen, amplifiziert.

Um die PCR-Mischung für die Bibliotheksamplifikation vorzubereiten, kombinieren Sie die folgenden Reagenzien in einem PCR-Röhrchen: 10 Mikroliter 10× GAMP-Puffer, zwei Mikroliter Magnesiumchlorid, zwei Mikroliter BSA, ein Mikroliter dNTP-Mischung, jeweils drei Mikroliter der 4,54 MPCR-Vorwärts- und Rückwärtsprimer, ein Mikroliter AmpliTaq Gold DNA-Polymerase und 25 Mikroliter Bibliotheksvorlage. Fügen Sie abschließend 45 Mikroliter PCR-graduiertes Wasser hinzu, um ein Gesamtvolumen von 100 Mikrolitern zu erhalten. AmpliTaq Gold DNA-Polymerase ist bei Raumtemperatur stabil, daher ist es nicht notwendig, auf Eis zu arbeiten.

Nach der Vorbereitung der PCR-Reaktion das PCR-Gefäß in einen Thermocycler geben und mit einer Denaturierungsstufe von 95 Grad Celsius für 12 Minuten beginnen, gefolgt von 14 Zyklen mit jeweils 95 Grad Celsius für 30 Sekunden, 60 Grad Celsius für eine Minute und 72 Grad Celsius für eine Minute. Am Ende dieser 14 Zyklen einen abschließenden Schritt bei 72 Grad Celsius für fünf Minuten einstellen, danach kann das PCR-Gefäß unbegrenzt bei 10 Grad Celsius aufbewahrt werden, bis es nach Abschluss der PCR-Amplifikation verwendet wird. Anschließend erfolgt die Reinigung des PCR-Produkts mithilfe einer Kyogen MinLu-Spinsäule gemäß den Herstelleranweisungen; die DNA wird mit 50 Mikrolitern des mit dem MinLu-Kit gelieferten EB-Puffers von der Säule eluiert, bevor die primäre Verlängerung und Produktbindung erfolgt.

Quantitative PCR sollte an Aliquoten der nicht amplifizierten und amplifizierten Bibliotheken durchgeführt werden, um die Menge und Qualität des amplifizierten Bibliotheksprodukts zu quantifizieren und zu überprüfen. Die um 14 Zyklen amplifizierte Bibliothek sollte mehrere tausendmal mehr DNA enthalten als die Primärbibliothek. Falls dies nicht der Fall ist, sollten die Amplifikationsbedingungen überprüft und die Amplifikation wiederholt werden.

Primäre Verlängerungskapturner, die verwendet werden, um die Sequenzen von Interesse aus der amplifizierten Bibliothek zu isolieren, sollten wie normale PCR-Primer gestaltet sein, um mit einem idealen Schmelzpunkt von 60 Grad Celsius an das 5'-Ende jedes dieser Zielbereiche an der 12 Basen langen Schwanzsequenz zu binden, und zudem einen Biotinrest am 5'-Ende enthalten. Bis zu 150 PEC-Primer können gemeinsam in einer einzigen Multiplex-Mischung verwendet werden, die aus 200 Mikromolar-Stammlösungen hergestellt wird. Für die primäre Verlängerungsreaktion bereiten Sie eine PCR-Mischung in einem geeigneten PCR-Röhrchen vor, indem Sie fünf Mikroliter 10× GAMP-PCR-Puffer, zwei Mikroliter Magnesiumchlorid, ein Mikroliter BSA, 0,5 Mikroliter dNTPs, fünf Mikroliter der primären Verlängerungskapturner-Mischung, 0,5 Mikroliter Taq Gold DNA-Polymerase, zwei Mikroliter der 14 Zyklen amplifizierten Bibliothek-DNA und schließlich 31 Mikroliter PCR-Reinstwasser hinzufügen, um ein Gesamtvolumen von 50 Mikrolitern zu erhalten.

Wenn die amplifizierte Bibliotheksvorlage mehr als ein Mal 10 hoch 12 Kopien pro Mikroliter enthält, sollte die Vorlage zunächst mit EB-Puffer verdünnt werden, sodass nicht mehr als zwei Mal 10 hoch 12 Kopien der Reaktionsmischung zugegeben werden. Nachdem der PCR-Ansatz vorbereitet wurde, stellen Sie ihn in den Thermocycler und programmieren Sie einen einzelnen Reaktionsdurchlauf. Beginnen Sie mit einer 12-minütigen Denaturierung bei 95 Grad Celsius, gefolgt von einer Minute bei 60 Grad Celsius und fünf Minuten bei 72 Grad Celsius für die primäre Verlängerung.

Und wenn der einzelne Zyklus abgeschlossen ist, 72 Grad Celsius halten, um das PCR-Produkt bis zum nächsten Schritt zu lagern. Um unspezifische Primer-Anlagerungen zu vermeiden und direkt PEPPE 150 Mikroliter PBI- oder PB-Puffer aus dem Kyogen-Ute-Reinigungs-Kit in die PCR-Reaktionsgefäße zu geben, während die Reaktionsmischung weiterhin im Thermocycler bei 72 Grad Celsius gehalten wird. Dadurch wird die Polymerase inaktiviert, während die Temperatur zu hoch ist, um eine unspezifische Verlängerung der Zielprimer zu ermöglichen. Schließen Sie die Röhrchen, wirbeln Sie kurz vorsichtig um und zentrifugieren Sie die Flüssigkeit mit einem Tischzentrifugen kurz ab.

Verwenden Sie für diesen Schritt ausschließlich PBI- oder PB-Puffer, da andere Bindungspuffer wie der Qiagen PM-Puffer den nachgeschalteten Erfassungsprozess stören können. Entfernen Sie danach die Mischung aus dem PCR-Röhrchen und überführen Sie sie zur Reinigung gemäß den Herstelleranweisungen in eine Rogen MinLu-Säulenspinne. Eluieren Sie die DNA wie zuvor beschrieben mit 30 Mikrolitern des mit dem MinLu-Kit gelieferten EB-Puffers aus der Säule. Um alle Fragmente zu entfernen, die nicht an PEC-Primer angebunden haben, wird ein bead-basierter Erfassungsschritt durchgeführt.

Zunächst eine Stammlösung von M 270 Strip aufgeteilt in Perlen durch Vortexen resuspendieren und eine Menge an Perlen zu entnehmen, die 25 Mikroliter pro Probe entspricht. Die Perlen zweimal mit jeweils 500 Mikrolitern zweifach konzentriertem BW-Puffer waschen und in dem gleichen Volumen an zweifach konzentriertem BW-Puffer resuspendieren, wie das ursprünglich entnommene Perlenvolumen betrug. 25 Mikroliter der Suspension herstellen.

Fügen Sie für jede Probe 25 µL der gereinigten eluierten DNA zu 25 µL der Beadsuspension hinzu und bewahren Sie die verbleibenden fünf µL für eine spätere Quantifizierung auf. Mischen Sie die DNA- und Beadsuspension durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren und Rühren mit der Perpet-Spitze und rotieren Sie anschließend langsam 15 Minuten bei Raumtemperatur auf einem Labormischer. Übertragen Sie nach dem Mischen den Inhalt in ein frisches 1,5-mL-PCR-Gefäß.

Während des vorherigen Inkubationsschritts mit Rotation konnte sich etwas Nicht-Ziel-DNA an der Röhrenwand festsetzen. Daher vermeidet die Übertragung der Beadsuspension in eine neue Röhre die Möglichkeit, dass diese Nicht-Ziel-DNA in die endgültigen Produkte gelangt. Während des Hitzeeleutionsschritts pelletieren Sie die Beads mithilfe des magnetischen Partikelkollektors. Nach 10 bis 20 Sekunden haben sich alle Beads an der Wand gesammelt, sodass ein klares Überstand verbleibt, der entfernt werden sollte, um die Beads zu waschen. Geben Sie 500 Mikroliter einesmaligen BW-Puffers in die Röhre und wirbeln Sie etwa drei Sekunden lang bei langsamer Geschwindigkeit.

Einmal mit dem Reagenzglas in aufrechter Position und einmal mit dem Reagenzglas auf dem Kopf stehend sollten keine Kügelchen mehr an der Wand des Reagenzglases haften. Mit einem Tischzentrifugen kurz für ein bis drei Sekunden zentrifugieren, gerade lange genug, um die gesamte Flüssigkeit von den Wänden des Reagenzglases abzutrennen. Danach das Reagenzglas wieder in den MPC stellen und 10 bis 20 Sekunden warten, bis sich alle Kügelchen an der Seite des Reagenzglases gesammelt haben.

Entfernen Sie dann das SUP-Überstand. Die erste Wäsche ist nun abgeschlossen. Wiederholen Sie diesen Vorgang anschließend noch viermal, jeweils gefolgt von einer BW-Wäsche und der Entfernung des Überstandes.

Fügen Sie 500 Mikroliter einmal heißer Waschpuffer hinzu. Mischen Sie die Suspension durch kurzzeitiges Vortexen und Zentrifugieren wie zuvor, und schütteln Sie das Röhrchen anschließend zwei Minuten lang bei 65 Grad Celsius auf einem Thermoblock-Schüttler bei 1000 U/min, nachdem Sie kurz zentrifugiert haben, um Spuren des Überstandes innerhalb einer Minute nach dem Entfernen vom Thermoblock zu entfernen. Dieser Schritt entfernt Fragmente, die möglicherweise an PEC-Primer binden, aber im Primer-Elongationsschritt nicht verlängert wurden. Resuspendieren Sie das Pellet in 30 Mikrolitern EB-Puffer und überführen Sie die Mischung in ein neues 1,5-Milliliter-PCR-Röhrchen.

Den Probengefäß im Thermocycler bei 95 Grad Celsius drei Minuten lang inkubieren. Die Kügelchen im magnetischen Partikelkollektor pelletieren. Es sollten 10 bis 20 Sekunden vergehen, bis der Überstand vollständig klar ist, dann den Überstand S in ein frisches, beschriftetes Gefäß überführen.

Dabei darauf achten, keine Kügelchen mitzunehmen. Den Überstand, der das gebundene Produkt aus DNA-Fragmenten enthält, auffangen. Die Kügelchen können an dieser Stelle entsorgt werden.

Um das gewonnene Produkt zu amplifizieren, bereiten Sie eine PCR-Mischung mit einem Gesamtvolumen von 100 Mikrolitern wie in Teil zwei beschrieben vor und führen die gleichen PCR-Zyklenbedingungen durch. Nach Abschluss der PCR-Amplifikation des gewonnenen Produkts reinigen Sie es erneut mithilfe einer Qiagen-Ute-Spin-Säule, wie zuvor in Abschnitt zwei beschrieben, und eluieren die DNA aus der Säule mit 50 Mikrolitern Eb-Puffer. Das Produkt ist nun bereit für die Hochdurchsatzsequenzierung. Wir entwarfen 574 PEC-Primer, um lückenlos über das gesamte mitochondriale Neandertal-Genom zu streuen.

Wir teilten diese in vier Multiplex-Mischungen und zwei serielle Runden der primären Erweiterungskapazität auf Bibliotheken von fünf Neandertaler-Fossilien aus vier Fundorten in ganz Eurasien auf, die auf ein Alter zwischen 40.000 und 70.000 Jahren datiert sind, wobei zwischen 170.000 und 500.000 Sequenzen pro Individuum erzeugt und die Ergebnisse an eine mitochondriale Referenzsequenz ausgerichtet wurden. Wir fanden heraus, dass das PEC-Verfahren die mitochondriale DNA massiv angereichert hatte, wodurch für jedes Individuum eine vollständige Abdeckung der mitochondrialen DNA bei einer durchschnittlichen Sequenzabdeckung zwischen 18- und 56,3-facher Tiefe erreicht wurde. Mit diesen Ergebnissen konnten wir für jedes Individuum eine hochwertige, vollständige mitochondriale Genomsequenz erstellen.

Anschließend führten wir einen phylogenetischen Vergleich dieser Sequenzen mit einer weltweiten Stichprobe heutiger Menschen sowie mit unseren nächsten lebenden Verwandten, dem Schimpansen und dem Bonobo, durch. Dies bestätigte frühere Befunde, wonach die mitochondriale DNA der Neandertaler eng mit der der modernen Menschen verwandt ist, sich aber eindeutig von ihr unterscheidet. Darüber hinaus zeigte der Vergleich zwischen den Neandertaler-Sequenzen selbst eine äußerst geringe genetische Vielfalt bei den Neandertalern, die noch niedriger ist als die der heutigen weltweiten menschlichen Population und der heutigen europäischen Bevölkerung ähnelt.

Diese Hinweise in Kombination mit einer Analyse der Proteinevolution in den Neandertaler-Sequenzen deuten darauf hin, dass Neandertaler eine langfristig geringe Populationsgröße aufwiesen, was mit archäologischen Belegen übereinstimmt, die darauf hindeuten, dass die Neandertaler-Bevölkerungsdichte niemals die von modernen Menschen erreichten Werte erreichte. Wir haben Ihnen soeben gezeigt, wie man eine Primaten-Erweiterungskapazität durchführt, um Zielsequenzen zur Vorbereitung einer Hochdurchsatzsequenzierung zu amplifizieren und zu erfassen. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, alle Temperaturvorgaben am Thermocycler genau einzuhalten; beachten Sie jedoch, dass Primer unterschiedliche Annealing-Temperaturen aufweisen können, sodass Sie die Annealing-Temperatur möglicherweise an Ihre spezifischen Primer anpassen müssen, und achten Sie bei allen Waschschritten darauf, so viel Flüssigkeit wie möglich zu entfernen.

Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.