Cellular Encapsulation in 3D Hydrogele für Tissue Engineering

Der schrittweise Prozess der Verkapselung von Zellen beginnt mit der Vorbereitung und Sterilisation von Hydrogelformen und anderen Materialien, gefolgt von der Isolierung der Zellen in einzelne Populationen in Röhrchen für jedes Gelset. Die Ation wird dann in Gegenwart von Zellen durchgeführt, gefolgt von der Inkubationszeit in vitro oder in vivo. Die nachgelagerte Analyse des Zellverhaltens kann Tests auf Lebensfähigkeit, Morphologie, Proliferation und Differenzierung umfassen.

Hallo Amidio Kahan aus dem Labor von Dr. Jason Burdick im Department of Bioengineering an der University of Pennsylvania. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur zellulären Verkapselung in 3D-Hydrogelen für das Tissue Engineering. Wir verwenden dieses Verfahren, um die Auswirkungen der Zusammensetzung und Struktur von Hydrogelen auf das Verhalten verkapselter Zellen zu untersuchen.

Also lasst uns loslegen. Um dieses Verfahren zu beginnen, bereiten Sie eine 0,5%ige Lösung des Photoinitiators air cure 2 9 5 9 oder I 2 9 5 9 in PBS vor. Mischen und zwei bis drei Tage im Dunkeln bei 37 Grad Celsius inkubieren.

Wenn Sie fertig sind, verwenden Sie einen Spritzenfilter, um die Lösung zu sterilisieren und bei Raumtemperatur zu lagern. Verwenden Sie als Nächstes ein Tabellenkalkulationsprogramm wie Microsoft Excel, um die benötigte Menge an Polymer und Vernetzer zu berechnen. Hier wird Hyaluronsäure mit Acrylat-reaktiven Gruppen funktionalisiert.

Berechnen Sie auch die Menge des Penantpeptids, das die funktionelle Adhäsionsdomäne mit den Aminosäuren Cystin, Arginin, Glycin und Aspartat enthält. Das Cystin dient zur Bindung an das Polymer. Nachdem nun die benötigten Mengen an Polymervernetzer und Pent bestimmt wurden, wiegen Sie diese ab und geben Sie sie jeweils in ein Einor-Rohr.

Passen Sie die Berechnungstabelle entsprechend an. Für die tatsächliche Masse des erhaltenen Polymers fahren Sie fort Um Gelformen vorzubereiten. Schneide mit einer Rasierklinge die Spitzen von einzeln verpacktem Sterilgut ab.

Ein-Milliliter-Einwegspritzen. Stellen Sie sicher, dass ein flacher Schnitt für Formen gemacht wird, die für Fotomuster und Gele verwendet werden sollen. Sterilisieren Sie abschließend die Spritzenformen, die EOR-Röhrchen mit geöffneten Kappen und alle anderen notwendigen Materialien, indem Sie sie für 30 Minuten unter eine keimtötende Lichtquelle legen, die in die biologische Sicherheitswerkbank eingebaut ist.

Sobald die Sterilisation abgeschlossen ist, fahren Sie mit der Vorbereitung der Zellen nach der Sterilisation der Versuchsgeräte fort. Arbeiten Sie in der Haube und fügen Sie dem Polymer, das bei der mischen Vernetzung verwendet wird, steriles TEA und dem Polymer, das für die Vernetzung mit freien Radikalen verwendet wird, steriles PBS hinzu. Fügen Sie den Pendant Moiety Tubes und dem Vortex einen passenden Puffer hinzu.

Zum Auflösen bindet die anhängige Einheit an die alkylierte Hyaluronsäure über ein Thiol aus einer INE-Gruppe auf das Peptid, um die hängende Einheit an das Polymer zu binden, sie der Polymerlösung hinzuzufügen und mit Param zu verschließen. Kurz vortexen und bei 37 Grad Celsius mit Mischen inkubieren. Während der Vorbereitung der Zellen, während sich die hängende Einheit anheftet, bereiten Sie die Zellen für die Verkapselung von Tryis, menschlichen mesenchymalen Stammzellen oder HMCs, vor, indem Sie sie mit PBS waschen.

Dann eine Minute lang bei Raumtemperatur mit Trypsin inkubieren, das Trypsin entfernen und weitere fünf Minuten bei 37 Grad inkubieren. Fügen Sie dann HMSC-Wachstumsmedien hinzu, um das Trypsin zu neutralisieren und die Zellen von der Oberfläche der Platte zu lösen. Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer.

Teilen Sie die gezählten Zellen in Portionen auf, die die entsprechende Anzahl für jeden Satz von Gelen enthalten. Für ein Set von drei 50-Mikroliter-Gelen mit einer Dichte von 10 Millionen Zellen pro Milliliter trennen Sie 1,5 Millionen Zellen in ein einzelnes konisches Röhrchen. Bereiten Sie aufgrund des Zeitpunkts der Einnahme nicht mehr als vier Gele in einem einzelnen Set vor.

Zentrifugieren Sie anschließend die Zellen sechs Minuten lang bei 500 RCF. Bei Raumtemperatur, während sich die Zellen drehen, die Polymerisationsmischung für die Vernetzung in der mical-Edition vorbereiten. Geben Sie Puffer zum Vernetzer, um die entsprechende Konzentration zu erreichen.

Für die lichtinitiierte Vernetzung mit freien Radikalen wird die zuvor vorbereitete I 2 9 5 9 Lösung zur Polymerlösung gegeben. Bei 10 % des gesamten Gel-Fixiervolumens für eine Endinitiatorkonzentration von 0,05 Gew.-%. Nun sind die Zellen und der Polymerisationsmix bereit für die Verkapselung im Hydrogel.

Beginnen Sie damit, die Schlinge aus den Zentrifugenzellen abzusaugen. Warten Sie, bis sich die Flüssigkeit nach der ersten Aspiration abgesetzt hat, und aspirieren Sie erneut, um so viel Medium wie möglich zu entfernen, ohne die Zellpellet-Resus zu stören. Suspendieren Sie das Zellpellet mit der Polymerlösung, um Luftblasen zu vermeiden.

Pipettieren Sie die Lösung langsam etwa 10 Mal auf und ab, was ausreichen sollte, um die Zellen gleichmäßig zu verteilen. Verwenden Sie für die Additionsreaktion vom mical-Typ eine Pipettenspitze mit breiter Öffnung, um das entsprechende Volumen der Vernetzerlösung in die Polymerzelle zu geben. Mischen. Stellen Sie die Pipette auf das gewünschte individuelle Gelvolumen ein.

Pipettieren Sie die Lösung auf und ab, um sie zu homogenisieren und Eloqua in die Spritzenspitzenformen zu geben. Führen Sie den Schritt schnell durch, um eine gleichmäßige Verteilung der Zellen zu gewährleisten, und lassen Sie eine 10- bis 30-minütige Inkubation in der Kulturhaube für die Vernetzung zu. Für das Licht initiierte Vernetzung durch freie Radikale.

Aliquotieren Sie das entsprechende Volumen in Spritzenspitzenformen. Setzen Sie die Spritzen UV-Licht aus, um eine Radikalvernetzung zu erzielen, eine 10-minütige Belichtungszeit auf 365 Nanometer. Vier Milliwatt pro Quadratzentimeter UV-Licht ist für ACRL-funktionalisierte Polymere üblich.

Führen Sie den Schritt schnell durch, um die Ablagerung der Zellen vor der Einwirkung von UV-Licht zu minimieren. Tauchen Sie die Gele nach der Vernetzung in die Vertiefungen einer Gewebekulturplatte mit dem Medium für die Inkubation und Analyse. Die Vernetzung des Hydrogels kann auch sequentiell erfolgen.

Zuerst wird der funktionalisierte Farbstoff metholierter Rumin bis zu einer Endkonzentration von 20 Nanomolar in das Gel gegeben. Der Farbstoff hilft, die Strukturierung sichtbar zu machen, da er bevorzugt in radikal vernetzte Bereiche des Gels eingearbeitet wird. Beginnen Sie dann mit der Polymerisationsreaktion vom Mikrofontyp, die einen Bruchteil der theoretischen Vernetzungen für die folgenden Ergebnisse ergibt.

Crosslinking mit freien Radikalen muss man eine Maske verwenden, die in einem Programm wie Adobe Photoshop oder Illustrator entworfen und direkt auf Transparenzmasken gedruckt wurde. Die Abmessungen der Maske müssen mit dem runden Spritzenaufsatz übereinstimmen. Verwenden Sie eine sterilisierte Pinzette, um eine sterile Maske direkt auf die Geloberfläche aufzutragen und dem Licht auszusetzen, um das Gel zu vernetzen.

Weiterhin sind hier HMCs in HA-basierten Hydrogelen eine Stunde nach der Verkapselung zu sehen. Da synthetisierte Hydrogele in der Regel transparent sind, können Zellen mit Hilfe der Lichtmikroskopie für die Morphologie sichtbar gemacht werden. Dieselben Zellen wurden 24 Stunden nach der Verkapselung mit einem fluoreszierenden Lebendtot-Färbekit auf Lebensfähigkeit visualisiert.

Wir verwendeten Calcium M, um die lebenden Zellen und das Aherium-Homodimer für die toten Zellen nachzuweisen, und beobachteten eine Lebensfähigkeit von mehr als 95%. Wir verwendeten den Alamar-Blau-Assay auch, um den Grad der Zellproliferation zu bestimmen, gemessen daran, wie gut die Zellen das Assay-Reagenz verstoffwechseln, was zu einer Farbänderung führt. Die Zellfärbung wurde sieben Tage nach der Verkapselung an H-HMCs in einem abbaubaren und adhäsiven HA-basierten Hydrogel und unter Verwendung von Standardfixierungs- und permeablen Verfahren durchgeführt.

Das zelluläre Akton ist mit Fluorescein-markiertem Phin und Zellkernen sichtbar, die mit dpi zurückgehalten werden. Die Immunfärbung gegen Cullin wird zur Visualisierung von fokalen Adhäsionen innerhalb der Hydrogelmatrix verwendet. Die histologische Färbung erfolgt nach Dehydratisierung, Paraffineinbettung und Schnitt der Hydrogele unter Verwendung von radikalisch polymerisierten HMSC-verkapselten HA-Hydrogelen mit Standardprotokollen.

Nach einer Woche in Kultur wurden die Glykosaminoglykane mit Hämat-Toin-Markierung der Zellkerne und ASIN-Markierung des Bindegewebes A- und Blaufärbung für Glykosaminoglykane gefärbt. Echtzeit. Die PCR wird verwendet, um die Differenzierung von verkapselten Stammzellen zu quantifizieren. Nach Subtraktion des Hintergrunds wird das Expressionsniveau eines interessierenden Gens durch die Zykluszahl bestimmt, bei der die Fluoreszenzschwelle im Vergleich zu einem passiven Referenzsignal, bei dem es sich um ein konstitutiv aktives Housekeeping-Gen handelt, erreicht wurde. Wir haben Ihnen gerade gezeigt, wie Sie Zellen in 3D-Hydrogelen verkapseln und das Verhalten von Zellen in Gelen untersuchen können.

Bei der Anwendung dieser Verfahren ist es wichtig, eine vollständige Sterilität der Materialien zu gewährleisten, entweder durch langfristige Aufbewahrung steriler Pufferlösungen und Reagenzien oder durch Sterilisation mit der keimtötenden UV-Lampe. Das war's also. Danke fürs Waschen und viel Glück bei Ihren Experimenten.