Überwachung Herzfunktion Larven Drosophila melanogaster Für physiologische Untersuchungen

Drosophila sind genetisch attraktiv für Untersuchungen der Entwicklung und Funktion des Herzens und der zugrundeliegenden Herzschrittmacheraktivität. Dieses Verfahren zeigt, wie sowohl intakte als auch präparierte Larven präpariert und die Herzfrequenz überwacht werden. Das präparierte Präparat ermöglicht auch die Aufzeichnung von extrazellulären oder intrazellulären Potentialen, um die Funktion der Ionenkanäle weiter zu erfassen.

Hallo, ich bin Robin Cooper, Fakultätsmitglied am Department of Biology an der University of Kentucky. Heute zeigen Ihnen meine Schüler Ann Cooper, Kyla Ryman, Matt Ward und Easter Boku verschiedene Verfahren zur Überwachung der Herzfrequenz in Drosophila-Larven. Die folgende uneingeschränkte Methode wird als Ameisenfarm bezeichnet, da die Larven innerhalb einer Fokusebene sichtbar gemacht werden.

Für eine optimale Visualisierung der Larven verwenden Sie ein Präpariermikroskop mit einem Zwei-Zoll-Basisobjektiv und einem 0,5-Zoll-Rohrobjektiv für die beste räumliche Auflösung und Vergrößerung über ein ein Zentimeter x 0,5 Zentimeter großes Rechteck. Fotos und Videos können über eine Kamera auf einer Okularhalterung aufgenommen werden. Um diese Methode zu beginnen, legen Sie eine Larve mit einer dünnen Schicht Futter zwischen zwei Objektträger ein.

Die Rutschen werden im Abstand von einem bis 1,5 Millimetern mit Kunststoffabstandshaltern an allen vier Seiten gehalten. Kippen Sie das Präparat einige Minuten lang zwischen 20 und 45 Grad, um die Larven zu ermutigen, den Kopf nach unten zu richten. Stellen Sie den Mikroskopspiegel für den besten Kontrast des Herzens oder der beiden Luftröhren ein, um den Herzschlag zu beobachten.

Bei der Klebemethode handelt es sich um eine dauerhafte Halterung zur Fixierung von Larven auf einem Objektträger. Um mit der Klebemethode zu beginnen, lege ein sauberes Deckglas auf ein Objektträger. Geben Sie einen kleinen Tropfen Sekundenkleber auf eine Ecke des Deckglases.

Spülen Sie anschließend die Larven mit Wasser ab. Um überschüssige Lebensmittel zu entfernen, saugen Sie die Flüssigkeit mit einem Taschentuch oder der Ecke eines Papiertuchs auf. Sobald die Larve gründlich gespült ist, nehmen Sie sie vorsichtig mit einer sauberen Pinzette auf und legen Sie sie unter dem Mikroskop auf den Objektträger, weg vom Deckglas, und richten Sie die Larven auf ihren Bauch aus.

Der Magen hat schwache horizontale Rillen, die mit feinen schwarzen Haaren entlang verlaufen. Der Rücken der Larven sollte nach oben zeigen und weist zwei Rennstreifen auf, die die Luftröhre darstellen. Nehmen Sie mit einer zweiten Pinzette, die ausschließlich für den Umgang mit dem Kleber bestimmt ist, einen kleinen Tupfer aus dem Tropfen am Ende des Zettels und platzieren Sie ihn an der Ecke auf der gegenüberliegenden Seite.

Verwende eine winzige Menge, die gerade ausreicht, um den Kopf der Pinzette zu bedecken. Heben Sie das Tier auf und legen Sie es auf den Kleber, während Sie darauf achten, dass es bleibt. Mit der Bauchseite nach unten, dem schwarzen Mund.

Die Haken sollten sich am oder in der Nähe des Randes des Deckels befinden: Schieben Sie die Mundhaken und die braune Spirale hinein. Sollte den Kleber nicht berühren. Drücken Sie vorsichtig auf die Larven, um sie flach zu drücken.

Um eine Testsubstanz aufzutragen, geben Sie am besten kleine Tröpfchen mit einer Spritze in der Nähe des Larvenkopfes ab. Beobachten Sie die Herzfrequenz, indem Sie zählen, wie oft die Spiralen in einer Minute pulsieren. Für längere Beobachtungen können die Larven an Ort und Stelle gefüttert und angefeuchtet werden, um eine Austrocknung zu verhindern. Um eine Sezierplatte herzustellen, die unter dem Mikroskop verwendet werden kann, schneiden Sie mit einem Skalpell ein Loch mit einem Durchmesser von zwei Zentimetern in die Mitte eines Stücks Magnetband und kleben Sie es auf einen Objektträger.

Verwenden Sie Präpariernadeln, die gebogen und an Büroklammern geklebt wurden, um das Feststecken zu erleichtern. Legen Sie während der Dissektion ein intaktes Drittel der Sternlarven auf die Sezierplatte. Mit der dorsalen Seite nach oben sollte die Luftröhre durch die Kutikula sichtbar sein.

Platzieren Sie zwei Stecknadeln in den Larven auf beiden Seiten der Maulhaken und zwei weitere Stifte auf jeder Seite der Spiralen. Fügen Sie anschließend Kochsalzlösung hinzu, um die Larven feucht zu halten. Machen Sie dann einen horizontalen Schnitt am Coddle Ende, gefolgt von einem Längsschnitt, der sich entlang der Spiralen in Richtung des Kopfes des Tieres fortsetzen sollte.

Hebe eine dorsale Nadel an und hake sie unter der Nagelhaut ein. Verwenden Sie die Stecknadel zum Verteilen. Öffnen Sie die Körperhöhle.

Wiederholen Sie den Vorgang mit den anderen drei Stecknadeln. Sobald das Tier aufgepeppt wurde, entfernen Sie die Eingeweide und achten Sie darauf, die Luftröhre oder das Herz nicht zu beschädigen. Einige Strukturen, einschließlich des Gehirns und einiger Fettkörper, sind mit dem Herzen verbunden und schädigen es, wenn sie entfernt werden.

Lassen Sie das Präparat nach der Dissektion drei Minuten lang in einem HL-Dreisalzbad entspannen, intrazelluläre und Feldaufnahmen werden in diesem Präparat durchgeführt, während pharmakologische Wirkstoffe direkt auf das Herz aufgetragen werden. Die Gesamtzeit für diesen Präparierschritt beträgt drei bis sechs Minuten. Um eine elektrische Stimulation durchzuführen, müssen zuerst Fokalelektroden hergestellt werden, um eine Fokalelektrode dazu zu bringen, eine Glaselektrode über ein Heizelement zu führen, um zu brennen, und um eine allmähliche Biegung von etwa 45 Grad zu machen, montieren Sie eine Fokalelektrode, die mit HL drei Kochsalzlösung bei Raumtemperatur gefüllt ist, mit der Spitze nach unten.

Stellen Sie sicher, dass der Stimulatordraht die Kochsalzlösung in der Elektrode berührt und dass der Stimulator ausgeschaltet ist. Befestigen Sie eine frische Herzdissektionsvorbereitung am Mikroskop. Legen Sie den Erdungsdraht in die Kochsalzlösung.

Achten Sie darauf, die Stifte nicht zu berühren oder die Vorbereitung zu stören. Konzentrieren Sie sich weiterhin auf die Elektrode, während Sie den Manipulator verwenden, um sie in die Kochsalzlösung zu bewegen. Sobald Sie sich in der Kochsalzlösung befinden, positionieren Sie die Spitze der Elektrode mit dem Lumen flach am Herzen und berühren Sie es leicht.

Sobald die Elektrode positioniert ist, stellen Sie die Stimulatorfrequenz auf zwei Hertz und die Spannung auf die niedrigste Einstellung ein. Schalten Sie den Stimulator ein. Stellen Sie die Frequenz auf etwa drei Hertz ein und erhöhen Sie die Spannung langsam, bis sich der Herzschlag beschleunigt, um dem Rhythmus des Stimulators zu entsprechen.

Der Rhythmus kann nun über den Stimulator manipuliert werden. Verbindungen können hinzugefügt werden, um zu sehen, ob sie die Kontraktion oder die elektrische Leitung beeinflussen. Um Feldpotentialaufnahmen durchzuführen, füllen Sie eine Makro-Patch-Aufzeichnungselektrode mit Bademedium und montieren Sie sie in einen Manipulator an einem Verbundmikroskop.

Schließen Sie die Elektrode an einen Verstärker und ein Aufnahme-Rig an. Verwenden Sie den Manipulator, um das Lumen der Elektrode über das Herz einer am Mikroskop befestigten Dissektionsvorbereitung abzusenken. Berühren Sie das Herz ganz leicht mit der Elektrodenspitze.

Es können nun Feldaufnahmen gemacht werden, um Feldpotentiale aus einer anderen Region des Herzens aufzuzeichnen. Heben Sie die Spitze der Elektrode vorsichtig an und bewegen Sie sie mit dem Manipulator in einen neuen Bereich, dann verringern Sie die Feldpotentialaufzeichnungen an der Spitze. Ermöglicht eine präzise Überwachung der Rate und Dauer der elektrischen Signale im Herzen, um die Transmembranpotentiale von Larvenmyozyten zu messen.

Stellen Sie zunächst sicher, dass das Lumen einer scharfen Elektrode, die mit drei molaren Kaliumchlorid gefüllt ist, in einem Winkel von etwa 45 Grad zur Vertikalen flach am Herzen anliegt. Sobald es richtig positioniert ist, berühren Sie das Herz vorsichtig mit der Elektrodenspitze und klopfen Sie die Spitze in eine Zelle. Die Elektrode kann wieder verwendet werden, wenn sie nicht gebrochen ist.

Die intrazellulären Aufzeichnungen ermöglichen es, die ionische Basis des Aktionspotentials und charakteristische Formen der Potentiale zu messen, um die Auswirkungen von Ionenkanalmutationen oder Kanalmodulatoren zu untersuchen. Wir haben Ihnen gerade gezeigt, wie Sie Herzaufnahmen machen und wie Sie intrazelluläre und Feldpotentiale messen können. Sie können diese Techniken verwenden, um Herzveränderungen sowie pharmakologische Manipulationen und Genveränderungen zu untersuchen.

Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, nicht an einer Struktur zu ziehen, die mit dem Herzen verbunden ist, oder zu stark mit der Fokalelektrode zu drücken. Achten Sie auch bei der Klebemethode darauf, dass Sie den Mund oder die Kugel nicht zukleben. Das war's also.

Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Glück bei ihren Experimenten.