Überwachung Herzfunktion Larven Drosophila melanogaster Für physiologische Untersuchungen

Drosophila sind genetisch attraktiv für Untersuchungen zur Entwicklung und Funktion des Herzens sowie der zugrunde liegenden Schrittmacheraktivität. Dieses Verfahren zeigt, wie man Präparationen sowohl intakter als auch dissezierter Larven anfertigt und die Herzfrequenz überwacht. Die dissezierte Präparation ermöglicht zudem die Ableitung extrazellulärer oder intrazellulärer Potentiale, um die Ionenkanalfunktion weiter zu untersuchen.

Hallo, ich bin Robin Cooper, wissenschaftliches Mitglied des Fachbereichs Biologie an der University of Kentucky. Heute werden meine Studenten Ann Cooper, Kyla Ryman, Matt Ward und Easter Boku Ihnen verschiedene Verfahren zur Überwachung der Herzfrequenz bei Drosophila-Larven zeigen. Die folgende ungehinderte Methode wird als Ameisenfarm bezeichnet, da die Larven innerhalb einer Fokalebene sichtbar gemacht werden.

Verwenden Sie für eine optimale Visualisierung der Larven ein Stereomikroskop mit einem zweifachen Grundobjektiv und einem 0,5-fachen Tubusobjektiv, um die beste räumliche Auflösung und Vergrößerung über ein Rechteck von einem Zentimeter mal 0,5 Zentimeter zu erzielen. Fotos und Videos können über eine an einem Okularaufsatz montierte Kamera aufgezeichnet werden. Um diese Methode zu beginnen, platzieren Sie eine Larve zwischen zwei Glasobjektträgern, wobei sich eine dünne Schicht Nahrung zwischen ihnen befindet.

Die Objektträger werden an allen vier Seiten mit Kunststoffabstandshaltern um ein bis 1,5 Millimeter auseinandergehalten. Neigen Sie die Präparation zwischen 20 und 45 Grad für einige Minuten, um die Larve dazu zu bewegen, ihren Kopf nach unten zu richten. Stellen Sie den Mikroskopspiegel so ein, dass der Kontrast des Herzens oder der beiden Tracheen optimal ist, um den Herzschlag beobachten zu können.

Die Klebemethode ist eine dauerhafte Montage zur Fixierung von Larven auf einem Objektträger. Um die Klebemethode zu beginnen, legen Sie eine saubere Deckglasplatte auf einen Objektträger. Geben Sie einen kleinen Tropfen Sekundenkleber auf eine Ecke der Deckglasplatte.

Als Nächstes spülen Sie die Larven mit Wasser ab. Um überschüssiges Futter zu entfernen, saugen Sie die Flüssigkeit mit einem Tuch oder der Ecke eines Papiertuchs auf. Sobald die Larve gründlich gespült ist, heben Sie sie vorsichtig mit sauberen Pinzetten auf und legen sie auf den Objektträger, außerhalb des Deckglases unter dem Mikroskop, und positionieren Sie die Larve auf dem Bauch.

Der Magen weist schwach sichtbare horizontale Rillen mit feinen schwarzen Härchen auf. Die Rückseite der Larven sollte nach oben zeigen und zwei Streifen aufweisen, die die Tracheen darstellen. Mit einem zweiten Paar Pinzetten, das ausschließlich für die Handhabung des Klebstoffs vorgesehen ist, etwas von dem Tropfen an der Spitze des Objektträgers entnehmen und an der gegenüberliegenden Ecke platzieren.

Verwenden Sie eine winzige Menge, gerade ausreichend, um die Spitze der Pinzette zu bedecken. Nehmen Sie das Tier auf und legen Sie es auf den Kleber, wobei Sie sicherstellen, dass es an Ort und Stelle bleibt. Bauchseite nach unten, die schwarze Mundöffnung.

Die Haken sollten sich am oder nahe am Rand des Deckglases befinden, und zwar die Mundhaken und die braune Spirale. Sie dürfen den Klebstoff nicht berühren. Drücken Sie vorsichtig auf die Larven, um sie zu glätten.

Um eine Testsubstanz aufzutragen, ist es am besten, kleine Tropfen mit einer Spritze nahe dem Kopf der Larve abzugeben. Beobachten Sie die Herzfrequenz, indem Sie die Anzahl der Pulsschläge der Spiralen pro Minute zählen. Für längere Beobachtungen können die Larven vor Ort gefüttert und angefeuchtet werden, um Austrocknung zu verhindern. Um eine Unterlage für die mikroskopische Untersuchung herzustellen, schneiden Sie mit einem Skalpell ein Loch von zwei Zentimetern Durchmesser in die Mitte eines Stückes magnetischen Klebebands und befestigen Sie dieses auf einem Objektträger.

Verwenden Sie Präparationsnadeln, die gebogen und an Büroklammern festgeklebt wurden, um das Fixieren zu erleichtern. Legen Sie während der Präparation eine intakte dritte Instar-Larve auf die Präparationsplatte. Die dorsale Seite nach oben, sodass die Tracheen durch das Cuticula sichtbar sind.

Platzieren Sie zwei Nadeln an den Larven auf beiden Seiten der Mundhaken und zwei weitere Nadeln auf beiden Seiten der Spirakulöffnungen. Geben Sie anschließend Salzlösung hinzu, um die Larven feucht zu halten. Führen Sie dann einen horizontalen Schnitt am hinteren Ende aus, gefolgt von einem Längsschnitt, der neben den Spirakulöffnungen in Richtung des Kopfes des Tieres fortgesetzt werden sollte.

Heben Sie eine dorsale Nadel an und haken Sie sie unter das Cuticula. Verwenden Sie die Nadel, um die Gewebe auseinanderzuziehen. Öffnen Sie die Körperhöhle.

Wiederholen Sie den Vorgang mit den anderen drei Nadeln. Sobald das Tier fixiert ist, entfernen Sie vorsichtig die Eingeweide, ohne die Trachee oder das Herz zu beschädigen. Einige Strukturen, darunter das Gehirn und einige Fettkörper, sind mit dem Herzen verbunden und können dieses beschädigen, wenn sie entfernt werden.

Lassen Sie das Präparat nach der Dissektion drei bis fünf Minuten lang in einem HL-3-Salzlösungsbad ruhen; intrazelluläre und Feldableitungen werden an diesem Präparat durchgeführt, während pharmakologische Substanzen direkt auf das Herz aufgebracht werden. Die gesamte Zeit für diesen Dissektionsschritt beträgt drei bis sechs Minuten. Um eine elektrische Stimulation durchzuführen, müssen zunächst fokale Elektroden hergestellt werden. Dazu führen Sie eine Glaselektrode über ein Heizelement, um sie anzupolieren und eine gleichmäßige Biegung von etwa 45 Grad zu erzeugen. Befestigen Sie eine mit HL-3-Salzlösung bei Raumtemperatur gefüllte fokale Elektrode in der Manipulatorhalterung, wobei die Spitze nach unten weist.

Stellen Sie sicher, dass der Stimulationsdraht die Salzlösung innerhalb der Elektrode berührt und dass der Stimulator ausgeschaltet ist. Befestigen Sie eine frische Herzdisektionspräparation am Mikroskop. Legen Sie den Erdungsdraht in die Salzlösung.

Dabei sorgfältig darauf achten, die Nadeln nicht zu berühren oder die Präparation zu stören. Während der Bewegung des Elektrodenhalters nach unten in die Salzlösung den Fokus auf die Elektrode behalten. Sobald sich die Elektrode in der Salzlösung befindet, die Spitze der Elektrode so positionieren, dass ihr Lumen flach am Herzen anliegt und dieses leicht berührt.

Wenn die Elektrode positioniert ist, stellen Sie die Stimulatorfrequenz auf zwei Hertz bei der niedrigsten Spannungseinstellung ein. Schalten Sie den Stimulator ein. Stellen Sie die Frequenz auf etwa drei Hertz ein und erhöhen Sie die Spannung langsam, bis sich der Herzschlag beschleunigt und dem Rhythmus des Stimulators anpasst.

Der Rhythmus kann nun über den Stimulator beeinflusst werden. Es können Verbindungen hinzugefügt werden, um zu prüfen, ob sie die Kontraktion oder die elektrische Leitung beeinflussen. Um Aufzeichnungen des Feldpotentials durchzuführen, füllen Sie eine Makropatch-Aufzeichnungselektrode mit Badmedium und befestigen Sie sie in einem Manipulator an einem auflichtmikroskop.

Verbinden Sie die Elektrode mit einem Verstärker und einer Aufzeichnungseinrichtung. Senken Sie mit Hilfe des Manipulators die Öffnung der Elektrode über das Herz einer am Mikroskop fixierten Präparation. Berühren Sie das Herz sehr leicht mit der Elektrodenspitze.

Mittlerweile können Felddaten aufgezeichnet werden, um Feldpotentiale aus einem anderen Bereich des Herzens zu registrieren. Heben Sie die Elektrodenpitze vorsichtig an und bewegen Sie sie mit dem Manipulator in einen neuen Bereich, anschließend senken Sie die Spitze erneut ab, um die Aufzeichnung der Feldpotentiale fortzusetzen. So lässt sich die Frequenz und Dauer der elektrischen Signale im Herzen präzise überwachen, um die transmembranen Potentiale larvaler Kardiomyozyten zu messen.

Zunächst sicherstellen, dass die Lumenöffnung einer scharfen Elektrode, die mit dreimolarer Kaliumchloridlösung gefüllt ist, in einem Winkel von etwa 45 Grad zur Vertikalen flach am Herzen anliegt. Sobald die Elektrode korrekt positioniert ist, die Herzwand vorsichtig mit der Elektrodenspitze berühren und die Spitze in eine Zelle eintippen. Die Elektrode kann erneut verwendet werden, sofern sie nicht beschädigt ist.

Mithilfe der intrazellulären Ableitungen kann man die ionische Grundlage des Aktionspotentials sowie charakteristische Formen der Potentiale untersuchen, um die Wirkung von Ionenkanalmutationen oder Kanalmodulatoren zu analysieren. Soeben haben wir Ihnen gezeigt, wie man Herzableitungen sowie intrazelluläre und Feldpotentiale aufnimmt. Mithilfe dieser Techniken können Sie sowohl Herzveränderungen als auch pharmakologische Eingriffe und genetische Modifikationen untersuchen.

Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, nicht an einer mit dem Herzen verbundenen Struktur zu ziehen oder mit der Fokuselektrode zu stark zu drücken. Auch bei der Klebemethode ist darauf zu achten, den Mund oder die Kugel nicht zuzukleben. Das war's also.

Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.