Name: Überwachung Herzfunktion Larven Drosophila melanogaster Für physiologische Untersuchungen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-11-16T17:02:00.000+00:00
Duration: 9 min 37 s
Description: Lernen Sie Methoden zur Überwachung der Herzfunktion bei Drosophila melanogaster-Larven. Diese Techniken umfassen intakte und präparierte Anordnungen für physiologische Untersuchungen.

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Förderung durch das G. Ribble Fellowships in der Abteilung für Biologie, das Kentucky Young Researchers und Undergraduate Education-Eureka zur Verfügung gestellt! Office (Univ. of KY).

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<li>Dasari, S., Viele, K., Turner, A. C., Cooper, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+p-CPA+and+MDMA+on+physiology%2C+development+and+behavior+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22European+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Influence of p-CPA and MDMA on physiology, development and behavior in Drosophila melanogaster.</a> European J. Neurosci. 26, 424-438 (2007).</li>
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</ol>

<ol><li> Dissection-Tools: Fine Nr. 5 Pinzette und einer feinen Schere (alle von Fine Science Tools (USA), Inc., 373-G Vintage Park Drive, Foster City, CA 94404-1139 erhalten) </li><li> Präpariermikroskop mit Zoom-Funktion für die Präparation und das Zählen der Herzfrequenz. Für fokale Stimulation des Herzens ist dies auch notwendig. </li><li> Für extra-und intrazellulären Aufnahmen ein zusammengesetztes Mikroskop mit aufrechten Ziele (4 x und 20x) verwendet wird. Standard intrazellulären Verstärker und A / D-Karte für Online-Aufzeichnung auf einem Computer. Elektrische Signale werden auf Linie zu einem PowerLab/4s Schnittstelle (ADInstruments, Australien) aufgezeichnet. Wir verwenden Standard-Software von ADInstruments namens Chart-oder Scope. </li><li> Chemikalien: Alle Kochsalzlösung Chemikalien von Sigma Chemical Company (St. Louis, MO) erhalten. </li><li> Für intrazelluläre Ableitungen verwenden wir Glaskapillare Schlauch (Katalog # 30-31-0 von FHC, Brunswick, ME, 04011, USA) und für fokale macropatch Aufnahme und stimulierenden Elektroden verwenden wir Kimax-51, Kimble Products Kunst. Nr. 34502, ID 0,8-1.1mm, Länge 100mm. Die intrazelluläre Elektrode sollte einen Widerstand von 20 bis 30 mOhm. Die macropatch Elektrode wird durch den Abbruch der Spitze des Glases nach einer feinen Spitze von einer Elektrode Abzieher gemacht wurde gebaut. Die abgebrochene Spitze braucht, um eine saubere senkrecht zu brechen etwa 20 um im Durchmesser. Die Spitze wird dann Wärme poliert, um etwa 10 &amp;mgr; m Innendurchmesser für den Schwerpunkt extrazellulären Aufnahme. Für die Stimulationselektrode das Herz-Laufwerk verwenden wir eine abschließende Spitze der etwa 20-50 m im Durchmesser. Der Schaft der Elektrode ist über ein Heizelement ausführen, um dazu führen, dass etwa 45 Grad mit einer allmählichen Kurve biegen. Dadurch entsteht eine ebene oder senkrecht Elektrode Lumen über dem Herzen Rohr als der Winkel mit dem Mikro-Manipulator wird über weitere 45 Grad auf die Vorbereitung zu produzieren. </li></ol>

Überwachung herzfunktion larven drosophila melanogaster für physiologische untersuchungen

Monitoring Heart Function in Larval Drosophila melanogaster for Physiological Studies

Wir präsentieren verschiedene Methoden, um die Herzfunktion in der Larven-Rekord<em&gt; Drosophila</em&gt;. Die Ansätze ermöglichen Herzfrequenz in hemmungsloser und zurückhaltend ganze Larven gemessen werden. Für die direkte Kontrolle über die Umgebung rund um das Herz anderer Ansatz nutzt die zergliedert Larven und Entfernung der inneren Organe, um die Herzen in der gewünschten Verbindungen zu baden. Die freiliegenden Herzen ermöglicht auch Membranpotentiale zu überwachenden welche Einblick in die Ionenströme durch die Myozyten und zur elektrischen Leitung entlang der Herzen Röhre erzeugt geben. Diese Ansätze haben verschiedene Vor-und Nachteile für zukünftige Experimente, die diskutiert werden. Die Larven Herzen Vorbereitung bietet ein zusätzliches Modell neben der<em&gt; Drosophila</em&gt; Skelett NMJ zu untersuchen, die Rolle der intrazellulären Calcium-Regulation der zellulären Funktion. Lernen Sie mehr über die zugrunde liegenden Ionenströme, dass die Aktionspotentiale Form in Myozyten in verschiedenen Arten, kann man hoffen, einen Griff an der bekannten ionischen Störungen verbunden, um spezifische Gene, die für verschiedene Krankheiten bei Säugetieren erhalten.

Wir präsentieren verschiedene Wege, um die Herzfunktion in der Larve des Monitors<em&gt; Drosophila</em&gt; Für die Beurteilung der Fragen, die sich mit der Funktion von Gap Junctions, Ionenkanal-Mutationen, Modulation der Schrittmacher-Aktivität und pharmakologischen Studien.

Überwachung Herzfunktion Larven Drosophila melanogaster Für physiologische Untersuchungen

Wir präsentieren verschiedene Methoden zur Aufzeichnung der Herzfunktion in Drosophila-Larven. Die Ansätze ermöglichen die Messung der Herzfrequenz in ungebundenen und ...

Drosophila sind genetisch attraktiv für Untersuchungen zur Entwicklung und Funktion des Herzens sowie der zugrunde liegenden Schrittmacheraktivität. Dieses Verfahren zeigt, wie man Präparationen sowohl intakter als auch dissezierter Larven herstellt und die Herzfrequenz überwacht. Die dissezierte Präparation ermöglicht zudem die Ableitung extrazellulärer oder intrazellulärer Potentiale, um die Ionenkanalfunktion weiter zu untersuchen.Hallo, ich bin Robin Cooper, wissenschaftliches Mitglied des Fachbereichs Biologie an der University of Kentucky. Heute werden meine Studenten, Ann Cooper, Kyla Ryman, Matt Ward und Easter Boku, Ihnen verschiedene Verfahren zur Überwachung der Herzfrequenz bei Drosophila-Larven zeigen. Die folgende ungehinderte Methode wird als Ameisenfarm bezeichnet, da die Larven innerhalb einer Fokusebene sichtbar gemacht werden.Verwenden Sie für eine optimale Visualisierung der Larven ein Stereomikroskop mit einem zweifachen Grundobjektiv und einem 0,5-fachen Tubusobjektiv, um die beste räumliche Auflösung und Vergrößerung über ein Rechteck von einem Zentimeter mal 0,5 Zentimeter zu erzielen. Fotos und Videos können über eine an einem Okularaufsatz montierte Kamera aufgezeichnet werden. Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie eine Larve zwischen zwei Glasobjektträgern mit einer dünnen Schicht Nahrung einschließen.Die Objektträger werden an allen vier Seiten mit Kunststoffabstandshaltern um ein bis 1,5 Millimeter auseinandergehalten. Neigen Sie die Präparation für einige Minuten um 20 bis 45 Grad, um die Larve dazu zu bewegen, ihren Kopf nach unten zu richten. Stellen Sie den Mikroskopspiegel so ein, dass der Kontrast des Herzens oder der beiden Tracheen optimal ist, um den Herzschlag beobachten zu können.Die Klebemethode ist eine dauerhafte Montage zur Fixierung von Larven auf einem Objektträger. Um die Klebemethode zu beginnen, legen Sie eine saubere Deckglasplatte auf einen Objektträger. Geben Sie einen kleinen Tropfen Sekundenkleber auf eine Ecke der Deckglasplatte.Als Nächstes spülen Sie die Larven mit Wasser ab. Um überschüssiges Futter zu entfernen, saugen Sie die Flüssigkeit mit einem Tuch oder der Ecke eines Papiertuchs auf. Sobald die Larve gründlich gespült ist, heben Sie sie vorsichtig mit sauberen Pinzetten auf und legen sie auf den Objektträger, außerhalb des Deckglases unter dem Mikroskop, und positionieren Sie die Larve auf dem Bauch.Der Magen weist schwach ausgeprägte, verlaufende horizontale Rillen mit feinen schwarzen Härchen auf. Die Rückseite der Larven sollte nach oben zeigen und zwei Streifen aufweisen, die die Tracheen darstellen. Mit einem zweiten Paar Pinzetten, das ausschließlich für die Handhabung des Klebstoffs vorgesehen ist, etwas von dem Tropfen an der Spitze des Objektträgers entnehmen und an der gegenüberliegenden Ecke platzieren.Verwenden Sie eine winzige Menge, gerade ausreichend, um die Spitze der Pinzette zu bedecken. Nehmen Sie das Tier auf und setzen Sie es auf den Klebstoff, wobei sichergestellt werden muss, dass es sicher haftet. Bauchseite nach unten, schwarzer Mund. Die Haken sollten sich am oder nahe am Rand des Deckglases befinden, und zwar die Mundhaken und die braune Spirale. Sie dürfen den Klebstoff nicht berühren. Drücken Sie vorsichtig auf die Larven, um sie zu glätten.Um eine Testsubstanz aufzutragen, ist es am besten, kleine Tropfen mit einer Spritze nahe dem Kopf der Larve abzugeben. Beobachten Sie die Herzfrequenz, indem Sie die Anzahl der Pulsschläge der Spiralen pro Minute zählen. Für längere Beobachtungen können die Larven vor Ort gefüttert und angefeuchtet werden, um Austrocknung zu verhindern. Um eine mikroskopierbare Präparationsplatte herzustellen, schneiden Sie mit einem Skalpell eine zwei Zentimeter durchmessende Öffnung in die Mitte eines Stückes magnetischen Klebebands und befestigen Sie dieses auf einem Objektträger.Verwenden Sie Präparationsnadeln, die gebogen und an Büroklammern angeklebt wurden, um das Fixieren zu erleichtern. Legen Sie während der Präparation eine intakte dritte Larvenstadium von *Aster* auf die Präparationsplatte. Die dorsale Seite nach oben, sodass die Tracheen durch das Cuticula sichtbar sind.Platzieren Sie zwei Stifte an den Larven auf beiden Seiten der Mundhaken und zwei weitere Stifte auf beiden Seiten der Spirakel. Geben Sie anschließend Kochsalzlösung hinzu, um die Larven feucht zu halten. Führen Sie dann einen horizontalen Schnitt am hinteren Ende durch, gefolgt von einem Längsschnitt, der neben den Spirakeln in Richtung des Kopfes des Tieres fortgesetzt werden sollte.Heben Sie eine dorsale Nadel an und haken Sie sie unter das Cuticula. Verwenden Sie die Nadel, um die Gewebe zu spreizen. Öffnen Sie die Körperhöhle.Wiederholen Sie den Vorgang mit den anderen drei Nadeln. Sobald das Tier fixiert und geöffnet ist, entfernen Sie die Eingeweide, wobei Sie darauf achten müssen, die Trachee oder das Herz nicht zu beschädigen. Einige Strukturen, einschließlich des Gehirns und einiger Fettkörper, sind mit dem Herzen verbunden und können dieses beschädigen, wenn sie entfernt werden.Lassen Sie das Präparat nach der Dissektion für drei bis fünf Minuten in einem HL-3-Salzlösungsbad ruhen; intrazelluläre und Feldableitungen werden an diesem Präparat durchgeführt, während pharmakologische Substanzen direkt auf das Herz aufgebracht werden. Die gesamte Zeit für diesen Dissektionsschritt beträgt drei bis sechs Minuten. Um eine elektrische Stimulation durchzuführen, müssen zunächst fokale Elektroden hergestellt werden; führen Sie hierzu eine Glaselektrode über ein Heizelement, um sie zu polieren und eine gleichmäßige Biegung von etwa 45 Grad zu erzeugen. Befestigen Sie eine mit HL-3-Salzlösung bei Raumtemperatur gefüllte fokale Elektrode in der Manipulatorhalterung, wobei die Spitze nach unten weist.Stellen Sie sicher, dass der Stimulationsdraht das Salin im Inneren der Elektrode berührt und dass der Stimulator ausgeschaltet ist. Befestigen Sie eine frische Herzdisektionspräparation am Mikroskop. Legen Sie den Erdungsdraht in das Salin.Dabei darauf achten, die Stifte nicht zu berühren oder die Präparation zu stören. Während der Elektrode mit dem Manipulator in die Salzlösung abgesenkt wird, die Konzentration auf die Elektrode richten. Sobald sich die Elektrode in der Salzlösung befindet, die Spitze der Elektrode so positionieren, dass ihr Lumen flach am Herzen anliegt und dieses leicht berührt. Wenn die Elektrode positioniert ist, stellen Sie die Stimulatorfrequenz auf zwei Hertz bei der niedrigsten Spannungseinstellung ein. Schalten Sie den Stimulator ein. Stellen Sie die Frequenz auf etwa drei Hertz ein und erhöhen Sie die Spannung langsam, bis sich der Herzschlag beschleunigt und dem Rhythmus des Stimulators anpasst.Der Rhythmus kann nun über den Stimulator beeinflusst werden. Es können Verbindungen hinzugefügt werden, um zu prüfen, ob sie die Kontraktion oder die elektrische Leitung beeinflussen. Um Aufzeichnungen des Feldpotentials durchzuführen, füllen Sie eine Makropatch-Aufzeichnungselektrode mit Badmedium und befestigen Sie sie in einem Manipulator an einem auflichtmikroskop.Verbinden Sie die Elektrode mit einem Verstärker und einer Aufzeichnungseinrichtung. Senken Sie mit Hilfe des Manipulators die Öffnung der Elektrode über das Herz einer am Mikroskop fixierten Präparation ab. Berühren Sie das Herz sehr leicht mit der Elektrodenspitze.Mittlerweile können Felddaten aufgezeichnet werden, um Feldpotentiale aus einem anderen Bereich des Herzens zu erfassen. Heben Sie die Elektrodenpitze vorsichtig an und bewegen Sie sie mit dem Manipulator in einen neuen Bereich, dann senken Sie die Spitze erneut ab, um die Aufzeichnung der Feldpotentiale fortzusetzen. So lässt sich die Frequenz und Dauer der elektrischen Signale im Herzen präzise überwachen, um die transmembranen Potentiale larvaler Kardiomyozyten zu messen.Zunächst sicherstellen, dass das Lumen einer scharfen Elektrode, die mit dreimolarer Kaliumchloridlösung gefüllt ist, in einem Winkel von etwa 45 Grad zur Vertikalen flach gegen das Herz liegt. Sobald die Elektrode korrekt positioniert ist, die Herzoberfläche vorsichtig mit der Elektrodenspitze berühren und die Spitze in eine Zelle eintippen. Die Elektrode kann erneut verwendet werden, sofern sie nicht beschädigt ist.Die intrazellulären Ableitungen ermöglichen es, die ionische Grundlage des Aktionspotentials und die charakteristischen Formen der Potentiale zu messen, um die Wirkungen von Ionenkanal-Mutationen oder Kanalmodulatoren zu untersuchen. Soeben haben wir Ihnen gezeigt, wie man Herzableitungen sowie intrazelluläre und Feldpotentiale aufnimmt. Mithilfe dieser Techniken können Sie Herzveränderungen sowie pharmakologische Eingriffe und genetische Veränderungen untersuchen.Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, nicht an einer mit dem Herzen verbundenen Struktur zu ziehen oder mit der Fokuselektrode zu stark zu drücken. Auch bei der Klebemethode ist darauf zu achten, den Mund oder die Kugel nicht zuzukleben. Das war's also.Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.

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Wir haben eine Semi-automatische optische Heartbeat Analysemethode (SOHA) für die Analyse von optischen Hochgeschwindigkeits-Aufnahmen aus den...

Semi-automatische optische Heartbeat-Analyse von kleinen Herzen

Dieser Bericht beschreibt eine Methode zur Messung der Larvenaktivität von Drosophila mit dem TriKinetics Drosophila Activity Monitor. Das Gerät nutzt Infrarotstrahlen, um die Bewegungen von bis zu 16 einzelnen Tieren zu erkennen. Die Daten können analysiert werden, um Bewegungsparameter wie Raten und die Positionen der Tiere in den Assay-Kammern darzustellen.

Die Messung der Aktivität in der Larven<em&gt; Drosophila</em&gt; Activity Monitor

Hier werden die experimentellen Protokolle für die Vorbereitung von Drosophila in verschiedenen Entwicklungsstadien und die Durchführung einer optischen Längsschnittbildgebung von Drosophila-Herzschlägen mit einem speziellen optischen Kohärenzmikroskopie-System (OCM) beschrieben. Die morphologischen und dynamischen Veränderungen des Herzens können durch die Analyse der strukturellen und funktionellen Parameter des Herzens aus OCM-Bildern quantitativ charakterisiert werden.

Drosophila Vorbereitung und Longitudinal Imaging der Herzfunktion in vivo unter Verwendung optischer Kohärenzmikroskopie (OCM)

Das Protokoll beschreibt einen einfache Assay Drosophila Melanogaster Larven zu identifizieren, die Hypoxie unter normalen atmosphärischen Sauerstoffniveaus durchleben. Dieses Protokoll ermöglicht hypoxische Larven zu unterscheiden von anderen Mutanten, die überlappende Phänotypen wie Trägheit oder langsames Wachstum zeigen.

Ein Graben/Tunneling Test zur Erkennung von Hypoxie in Drosophila Melanogaster Larven

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zum Aufzeichnen der absteigenden elektrische Aktivität von Drosophila Melanogaster Zentralnervensystems ermöglichen kostengünstige und praktische Erprobung von pharmakologischen Wirkstoffen, Genmutationen neuronaler Proteine, und/oder die Rolle der unerforschten physiologischen Wege.

Elektrophysiologische Aufnahme der zentralen Nervensystems Tätigkeit der dritte Instar Drosophila Melanogaster

Das vorliegende Protokoll beschreibt die Erzeugung von Drosophila melanogaster , die eNpHR2.0 oder ReaChR-Opsine im Herzen exprimieren, für die OCT-Bildgebung und die optogenetische Herzschrittbildung. Detaillierte Anweisungen für die Drosophila OCT-Bildgebung und Herzschlagmodulation, einschließlich der Simulation von wiederherstellbarem Herzstillstand, Bradykardie und Tachykardie bei lebenden Tieren in verschiedenen Entwicklungsstadien, werden berichtet.

Entwicklung von Drosophila melanogaster Modellen für die Bildgebung und optogenetische Kontrolle der Herzfunktion

Das Protokoll stellt eine kostengünstige Methode mit hohem Durchsatz zur Beurteilung der Neurotoxizität in der Fruchtfliege durch die Quantifizierung der Bewegungsstörung als Alternative zu herkömmlichen Säugetiermodellen dar. Ziel ist es, die neurotoxischen Wirkungen von pharmazeutischen Wirkstoffen, Umwelteinflüssen oder genetischen Veränderungen anhand eines sensitiven, reproduzierbaren und ethisch günstigen Modells zu bewerten.

Verhaltensanalyse der lokomotorischen Dysfunktion bei Drosophila melanogaster als Aussage für Neurotoxizität

Lernen Sie Methoden zur Überwachung der Herzfunktion bei Drosophila melanogaster-Larven. Diese Techniken umfassen intakte und präparierte Anordnungen für physiologische Untersuchungen.

Überwachung Herzfunktion Larven Drosophila melanogaster Für physiologische Untersuchungen

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