Mikrovolumen Proteinkonzentrationsbestimmung mit dem NanoDrop 2000c Spektrophotometer

Die NanoDrop-Technologie kombiniert Faseroptik und Oberflächenspannung, um kleine Mengen von Proben wie Nukleinsäuren und Proteine zu halten und zu messen. Ein kleines Tröpfchen Probe wird direkt auf den unteren Sockel pipettiert. Ein oberer optischer Sockel greift dann in die Probe ein, um eine Säule zu bilden.

Das Stelzlager lässt sich automatisch bewegen, um die optimale Weglänge einzustellen. Durch die Verkürzung der Weglänge entfallen bei den meisten Proteinproben Verdünnungen, die Messung erfolgt in Sekundenschnelle und die Ergebnisse des Vis-Spektrums werden angezeigt. Hallo, ich bin Lynn Kalhorn von den NanoDrop Laboratories von Thermo Fisher Scientific.

Heute zeigen wir ein Verfahren zur Bestimmung der Proteinkonzentration mit Hilfe eines innovativen Mikrovolumen-Spektralphotometers. Der NanoDrop 2000 C.Das NanoDrop 2000 C Spektralphotometer verwendet ein innovatives Probenrückhaltesystem, das sich auf die Oberflächenspannung von Flüssigkeiten stützt, um Mikrovolumenproben zwischen zwei optischen Sockeln ohne den Einsatz von Küvetten oder Kapillaren zu halten und zu messen. Die Mikroprobe wird direkt auf die Detektionsoberfläche gelegt, und zwischen den Enden der optischen Fasern entsteht durch die Oberflächenspannung eine Flüssigkeitssäule.

Diese Flüssigkeitssäule bildet einen vertikalen optischen Weg. Eine Xenon-Blitzlampe dient als Lichtquelle und ein Spektrometer mit einem linearen CCD-Array wird verwendet, um das Licht zu analysieren, das durch die Probe fällt. Die Entfernung herkömmlicher Containment-Vorrichtungen wie Küvetten aus dem System hat mehrere Vorteile.

Für die Messung werden sehr kleine Probenmengen benötigt. Bei der Reinigung von ein bis zwei Mikrolitern müssen die optischen Oberflächen lediglich mit einem Labortuch abgewischt werden, und die Weglänge ändert sich während der Messung automatisch in Echtzeit. Darüber hinaus ermöglicht die Verkürzung der Weglänge die Messung höherer Konzentrationen, wodurch bei den meisten Proteinproben eine Verdünnung nicht mehr erforderlich ist.

In Fällen, in denen ein Tierarzt gerechtfertigt ist, wie z. B. bei kinetischen Studien, bietet der NanoDrop 2000 C eine Vete-Option im selben Spektralphotometer. Für dieses Protokoll werden wir die Option des Mikrovolumensockels verwenden, um die Proteinkonzentration zu bestimmen. Die Protein A two 80-Methode ist anwendbar auf gereinigte Proteine, die Tryptophan-, Tyrosin- und Phenylalaninreste oder Cystein-Cystein-Diss-Sulfid-Bindungen enthalten und eine Absorption bei 280 Nanometern aufweisen.

Um diesen Vorgang zu starten, wählen Sie die Anwendung Protein A two 80 aus dem Hauptmenü aus. Wenn das Fenster zur Wellenlängenüberprüfung angezeigt wird, stellen Sie sicher, dass der Arm nach unten geklappt ist, und wählen Sie die Art der zu messenden Probe aus der Dropdown-Liste aus. Die Standardeinstellung wird für die meisten unbekannten Proteinmischungen empfohlen, bei denen eine ABSORPTION einem Milligramm pro Milliliter entspricht.

Bei der Messung eines zuvor charakterisierten gereinigten Proteins kann entweder der Massenextinktionskoeffizient oder der molare Extinktionskoeffizient eingegeben werden. Um die Proteinkonzentration genauer zu bestimmen, wählen Sie die Konzentrationseinheiten aus der Dropdown-Liste neben dem farbcodierten Feld aus. Erstellen Sie als Nächstes eine Leerstelle.

Bei Verwendung eines geeigneten Puffers ist es wichtig, den Puffer zu verwenden, in dem das Protein suspendiert ist. Der verwendete Puffer sollte den gleichen pH-Wert und eine ähnliche Ionenstärke wie die Probenlösung haben. Aufgrund der Variabilität der Oberflächenspannung zwischen verschiedenen Proteinen empfehlen wir, zwei Mikroliter Proben zu laden, um eine korrekte Säulenbildung zu gewährleisten.

Berühren Sie zum Laden die Pipettenspitze mit geringer Retention mit der unteren Sockeloberfläche, während Sie die Lösung ausstoßen, um zu verhindern, dass die Lösung an der Außenseite der Pipettenspitze haftet, und stoßen Sie weniger als die volle Probenmenge aus, um ein Ausblasen und das Einbringen von Blasen in die Probe zu verhindern. Sobald die Probe geladen ist, senken Sie den Arm und klicken Sie auf Leer. Wenn die Ausblendung abgeschlossen ist, wischen Sie die Blindlösung von den unteren und oberen Sockeln ab.

Bei der Verwendung eines trockenen Labortuchs vor der Entnahme eines Aliquots zur Messung ist darauf zu achten, dass die Probe homogen ist. Mischen Sie die Probe sanft, aber gründlich, indem Sie sie vorsichtig mit einer mittleren Drehzahl vortexen, um das Einbringen von Mikroblasen in die Flüssigkeit zu vermeiden. Geben Sie eine Beispiel-ID in das entsprechende Feld ein.

Laden Sie zwei Mikroliter der ersten Probe, wie zuvor für den Rohling gezeigt, senken Sie den Arm ab und klicken Sie auf Messen. Wenn die Messung abgeschlossen ist, wischen Sie die Probe von den unteren und oberen Sockeln ab. Messen Sie alle anderen Proben mit einem trockenen Labortuch auf die gleiche Weise mit einem frischen Aliquot von zwei Mikrolitern Probe für jede Messung. Oft reicht ein gewöhnliches fusselfreies Labortuch aus, um die optischen Sockel zwischen den Messungen zu reinigen.

Das einzige Lösungsmittel, das unverträglich ist und nicht verwendet werden darf, sind Flusssäurelösungen, und Reagenzien, die Tenside enthalten, können die Oberflächen des Messsockels im Laufe der Zeit unkonditionieren und die Bildung der Probenflüssigkeitssäule verhindern. Eine Abflachung des Tröpfchens auf dem unteren Sockel ist ein Hinweis darauf, dass die optische Oberfläche nicht mehr überholt werden kann. Die Sockeloberflächen werden entweder mit einem Labortuch kräftig poliert oder die bevorzugte Methode ist die Verwendung der NanoDrop Sockelaufarbeitungsmasse PR one wie angegeben.

Wenn es sich bei der Probe um eine nicht charakterisierte Proteinlösung, ein Zelllysat oder einen Rohproteinextrakt handelt, empfehlen wir die Verwendung einer der vorkonfigurierten farbmetrischen Methoden, die auf dem NanoDrop 2000 C verfügbar sind. Zu diesen kolometrischen Methoden gehören BCAP sechs 60 Bradford- und Lowy-Assays. Der BCA-Assay wird hier vorgeführt. Die erforderlichen Reagenzien für den BCA-Assay sind in den Thermos Scientific Pierce-Reduktionsmittel-kompatiblen Kits BCA, Reagenz A, B, C, A, Reagenz B und Rinderserumalbuminstandards enthalten.

Wir werden das vorverdünnte Albumin-Set von Pierce verwenden, da sich unsere Standards auf die Pierce BCA-Literatur beziehen, um zu bestimmen, welche Assay-Standards für Ihre Umstände geeignet sind. Zur Herstellung der Reagenzien werden zunächst alle unbekannten Proteine und Proteinstandards auf Raumtemperatur ausgeglichen und durch sanftes Vortexen gründlich durchmischt. Verwenden Sie eine mittlere Drehzahl, um das Einbringen von Mikroblasen in die Flüssigkeit zu vermeiden.

Da Blasen die Messwerte negativ beeinflussen können. Bereiten Sie genügend frisches Arbeitsreagenz für die zu messenden Standards und Proben vor, wobei ein Verhältnis von 50 zu eins von Reagenz A zu B.In diesem Beispiel bereiten wir drei Milliliter Arbeitsreagenz vor, um die Referenzstandards und sechs Proben abzudecken. Der reguläre BCA-Assay deckt einen breiteren Dynamikbereich ab und verwendet ein Reagenzien-Protein-Verhältnis von 20 zu eins, während der Mikro-BCA-Assay empfindlicher ist und einen engeren Dynamikbereich aufweist, indem er ein Reagenzien-Protein-Verhältnis von eins zu eins aufweist.

Da wir den regulären BCA-Assay durchführen, werden wir ein Verhältnis von 20 zu eins zwischen Arbeitsreagenz und Probe herstellen. Geben Sie 190 Mikroliter Arbeitsreagenz in jedes Röhrchen mit genügend Röhrchen, um alle Proben und Standards abzudecken. Geben Sie als Nächstes 10 Mikroliter Standard oder Probe in jedes der Röhrchen, die das Reagenz enthalten.

Durch sanftes Vortexen gut vermischen. Inkubieren Sie die Röhrchen 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Lassen Sie die Reaktionen nach der Inkubation etwa 10 Minuten lang auf Raumtemperatur ausgleichen.

Im Gegensatz zur Protein A two 80-Methode erfordert die Protein-BCA-Methode, dass eine Standardkurve erstellt wird, bevor die Proteinkonzentrationen der Probe gemessen werden können. Um eine Standardkurve zu erstellen, wählen Sie zunächst die Protein-BCA-Methode aus dem Hauptmenü aus. Wenn das Fenster zur Wellenlängenüberprüfung angezeigt wird, stellen Sie sicher, dass der Arm nach unten geklappt ist.

Geben Sie die Werte für jede Standardkonzentration in die Tabelle im rechten Fensterbereich ein. Die Software ermöglicht die Referenz und bis zu sieben weitere Standards. Die Referenz- und/oder Standards können in Replikaten gemessen werden.

Erstellen Sie ein Leerzeichen mit dem entsprechenden Puffer. Der Rohling für farbmetrische Assays ist in der Regel deionisiert. Wasser pipettieren Sie zwei Mikroliter Wasser auf den unteren Sockel und senken Sie den Arm ab.

Klicken Sie auf Leer. Es ist nur ein Rohling erforderlich, um alle nachfolgenden Messungen der Referenz und der Normen abzudecken. Stellen Sie die Referenz her, indem Sie ein zwei Mikroliter schweres Eloqua mit nur funktionierendem Reagenz und Puffer ohne Protein auf den unteren Sockel pipettieren.

Senken Sie den Arm und klicken Sie auf Messen. Markieren Sie auf der Registerkarte Standards den gewünschten Standard und pipettieren Sie zwei Mikroliter des gewünschten Standards auf den unteren Sockel. Senken Sie den Arm und klicken Sie auf Messen.

Wiederholen Sie den Vorgang für alle Normen. Um die Normkurve anzuzeigen, klicken Sie auf Normkurve anzeigen. Nachdem alle Standards gemessen wurden, klicken Sie auf die Schaltfläche Proben.

Geben Sie die Proben-ID ein, laden Sie zwei Mikroliter Probe auf den unteren Sockel und klicken Sie auf Messen. Für jede Messung sollte ein frisches Aliquot von zwei Mikrolitern der Probe verwendet werden. Wenn die Messung abgeschlossen ist, wischen Sie die Probe mit einem trockenen Labortuch von den unteren und oberen Sockeln ab.

Das Ergebnis wird dann erhalten, da die Endkonzentration der Probe automatisch anhand der Standardkurve berechnet wird. Wir haben gerade zwei Möglichkeiten zur Bestimmung der Proteinkonzentration gezeigt, entweder durch direkte Zwei-80er-Messung oder durch eine indirekte farbmetrische Methode mit dem Mikrovolumen-Spektralphotometer NanoDrop 2000 C. Das ist alles.

Danke fürs Zuschauen.