Ableitung von hämatopoetischen Stammzellen aus embryonalen Stammzellen der Maus

Als Erstes nehmen wir eine konfluente T-25-Flasche von umsl. Ich werde sie einfach mit PBS waschen und einige Tropfen TR hinzugeben und einige Minuten einwirken lassen. Ich kann sehen, dass sich die Zellen von der Platte lösen. Sie sind also so gut wie fertig.

Okay, jetzt werde ich die Trypsin-Augenzellen sammeln. Es ist ratsam, die Trypsin-Augenzellen kurz anzutippen, um die Kolonien aufzulösen, und sie anschließend auf die UN-Platte zu übertragen. Dies wird etwa 30 bis 45 Minuten im Brutschrank stehen gelassen. Nun werde ich diese Zellen kurz abzentrifugieren, um sie zu sammeln, und danach das Überstand aufsaugen.

Ich werde in einigen Minuten lediglich resuspendieren, damit ich dies abzählen kann. Ich habe resuspendiert, jetzt habe ich die Zellen gezählt und entnehme nun eine Aliquotprobe, die ich auf 50 ml verdünnen werde. Dadurch erhalte ich die geeignete Konzentration, um hundert Zellen pro Tropfen zu bekommen, um sicherzustellen, dass die Zellen in Ordnung sind. Jetzt haben wir ein Reservoir.

Geben Sie diesen nochmals leicht ein Schwenken, wir gießen sie in unser Reservoir. Okay, das ist bereits programmiert. So, jetzt geht es los.

Jetzt ist es ziemlich gerade. Drehen Sie es um und legen Sie es beiseite. Bei jeder zweiten Platte neige ich sie einfach leicht, damit sich die Flüssigkeit etwas bewegt.

Okay, das sind also fünf Platten. Ich werde diese nun einfach in den Inkubator stellen. Das sind unsere Hänge-Tropfen, die wir vor zwei Tagen angelegt haben.

Um die Probe zu sammeln, schütteln Sie die Platten einfach, um die Tropfen zu vereinigen. Ich werde also alles sammeln und versuchen, dies vorsichtig durchzuführen, um die EVs nicht allzu sehr zu stören. Dazu nehme ich fünf oder sechs Portionen PBS und spüle die Platten damit aus. Anschließend lassen wir die Platten mindestens 10 Minuten lang stehen, damit sich die EBS durch Schwerkraft absetzen können.

Nachdem Sie visuell bestätigt haben, dass sich Ihre EBS abgesetzt haben, entfernen Sie den größten Teil des Überstandes, aber nicht ganz vollständig, da Sie Ihre nicht stören möchten, in Ordnung. In Ordnung, danach schütteln sie bis zum sechsten Tag. Dies sind Embryoidkörper, die vor sechs Tagen aus murinen embryonalen Stammzellen hergestellt wurden und die wir normalerweise sammeln, indem wir die Platten leicht wirbeln.

Wenn Sie die Platten schwenken, ziehen sich die EDS etwas in die Mitte der Schale und es ist etwas leichter, sie zu korrigieren. Nun lassen Sie die EDS durch die Schwerkraft auf den Boden des Röhrchens sedimentieren und entfernen anschließend das Medium. Danach waschen Sie einmal mit 10 ml, 10 bis 12 ml PBS. Okay, nun lassen wir diese, einen Moment.

Jetzt entferne ich einfach das P. Wir geben 250 Mikroliter unserer Enzymmischung hinzu und fügen ein Milliliter hinzu, dann stellen wir sie einfach in ein Wasserbad bei 37 Grad. Ab und zu, vielleicht ein- oder zweimal, komme ich vorbei und schwenke sie leicht, um sie zu mischen, da sich die Eds abgesetzt haben. Jetzt haben wir diesen enzymfreien Puffer zur Zelldissoziation, den wir einfach von gpro erhalten.

Und wir werden etwa acht Milliliter davon zu jedem Röhrchen hinzufügen. Anschließend pipettieren wir mehrmals mit einer 5-Milliliter-Pipette, um die Zellen zu dissoziieren; während des Hin- und Herpipettierens wird die Suspension sehr trüb. Dies ist ein visueller Hinweis darauf, dass sich die Zellen in dem Medium verteilen und es trübe machen. Nun werde ich die Zellen nach der Trypan-Ausschluss-Methode zählen. Wenn Sie eine Infektion durchführen oder einen MOI berechnen möchten, ist es sehr wichtig, die Zellen zu zählen.

Ich werde also einfach eine große Charge aus Virus, Medium, Zellen in der geeigneten Konzentration und Proteinsulfat vorbereiten. Und dann achte ich darauf, dass die Zellen – noch einmal, ich bin paranoid, was das Ausschleudern der Zellen aus der Suspension betrifft – gut verteilt sind. Ich achte stets darauf und verwende außerdem eine kleine, ich versuche, zu vermeiden, dass zu viel Spritzen entsteht, und wie wir für 2.500 U/min zentrifugieren.

Ich sammle also unsere Tag-10-Zellen, wobei ich alle Waschungen mitaufbewahre. Früher verwendete ich PI für P-Iodid, aber sieben ist nicht so hell. Daher überschneidet es sich nicht so stark mit anderen Kanälen und ist viel sauberer.

Jetzt holen wir also einfach die Variable, und das ist eine gute Methode, um Verluste in der Nadel aufgrund des Volumens zu vermeiden. Ich bin Shannon McKinney Freeman. Ich bin Postdoktorandin bei George Families Life Attorney im Bostoner Kinderkrankenhaus.

Heute werden wir besprechen, wie man eine transplantierbare Zellpopulation aus embryonalen Stammzellen von Mäusen gewinnt, die in das hämatopoetische System transplantiert werden kann. Warum führen wir dieses Experiment durch? Nun, wir wissen, dass wir mit diesem System – zunächst wurde der endgültige Protokollablauf entwickelt, um eine Zellpopulation aus embryonalen Stammzellen zu gewinnen, die hämatopoetische Stammzellaktivität aufweist – Mäuse nach tödlicher Bestrahlung retten können, indem wir ihr hämatopoetisches System langfristig, über die gesamte Lebensdauer des Organismus und in allen Linien des peripheren Blutes, wiederherstellen.

Deshalb wurde das Protokoll entwickelt. Nun führen wir weitere Experimente durch, um das Phänotyp der Zellpopulation innerhalb dieser erweiterten Population zu verstehen, die wir ableiten und die tatsächlich diese hämatopoetische Stammzellaktivität vermitteln. Denn wir wissen nicht, wir wissen lediglich, dass die Population sehr heterogen ist, und wir wissen, dass die Zelle, die die Mäuse tatsächlich rettet, innerhalb dieser Zellpopulation äußerst selten ist.

Und so versuchen wir im Grunde, sein Phänotyp zu definieren, damit wir es aus diesen sehr heterogenen Zellen anzureinigen können. Danach interessiert uns vor allem, wie es funktionell mit einer echten hämatopoetischen Stammzelle vergleichbar ist, wie man sie aus komplettem Knochenmark gewinnen könnte. Hat es die gleiche Rekonstitutionsfähigkeit in der Entwicklung, scheint es einer adulten Knochenmark-HSC zu entsprechen?

Oder vielleicht könnte es eher einer hämatopoetischen Stammzelle ähneln. Frühe Entwicklungsstadien könnten beispielsweise im granulo-monozytären Vorläufer (GM) oder in der fetalen Leber zu finden sein. Letztendlich versuchen wir genau dies zu verstehen, und wir möchten diese Fragen klären, weil wir letztlich hoffen, dass dieses Protokoll ähnliche Arbeiten leiten kann, die wir mit menschlichen embryonalen Stammzellen durchführen möchten.

Und wir sind der Ansicht, dass die Informationen, die wir mit dem Mathematik-System gewinnen, zukünftige Experimente erheblich verbessern werden. Ich denke, es gibt einige Punkte. Erstens ist es einfach ein gutes In-vitro-Modell, ein gutes Modell zur Erfassung der Entwicklung.

Wir versuchen also zunächst einmal die Entwicklung hämatopoetischer Stammzellen zu verstehen. Es handelt sich dabei um ein überschaubares System, das sehr gut für die ektopische Genexpression geeignet ist und ermöglicht, wie diese Faktoren die Entwicklung hämatopoetischer Stammzellen beeinflussen. Das ist aus grundlagenwissenschaftlicher Sicht äußerst nützlich.

Doch letztendlich möchten wir eine Art zellbasierte Therapie entwickeln, die klinisch zur Gewinnung transplantierbarer metabolischer Stammzellen aus menschlichen Zellen eingesetzt werden könnte. Doch das liegt wahrscheinlich noch in weiter Ferne. Tatsächlich haben wir festgestellt, dass der schwierigste Teil nicht so sehr die Gewinnung der Zellen selbst ist, sondern dass wir durch sorgfältige Experimente herausfanden, dass es eine Zeitspanne gab, in der wir Schwierigkeiten hatten, die Zellen unsere Empfängertiere rekonstituieren zu lassen.

Und was wir letztendlich herausfanden, war, dass wir sehr genau auf die Ablation der Empfänger achten mussten, da diese Zellen nicht dazu in der Lage sind. Typischerweise, wenn man bei Mäusen eine Transplantation mit Knochenmark durchführt, wendet man 10 oder 11 Gray Strahlung an, um die Mäuse und das Knochenmark zu dezimieren, und die Knochenmark-HC sind durchaus in der Lage, die Tiere von diesem Schaden zu retten. Es stellte sich jedoch heraus, dass diese Population von Zellen, die wir vergrößern, nicht in der Lage ist, die Tiere nach einer so hohen Dosis an I-Strahlung zu retten.

Was wir also tun mussten, war, die Bestrahlungsdosis sehr sorgfältig anzupassen, wobei wir auf die Größe der Tiere achteten, da wir feststellten, dass bei zu großen Tieren die gleiche Dosis nicht ausreichte, um eine wirksame Ablation zu erzielen. Doch erneut gilt: Wenn man die Tiere nicht ausreichend bestrahlt, sind die Zellen nicht in der Lage, mit widerstandsfähigeren Wirtsorganismen zu konkurrieren.

Als wir also erkannt hatten, dass dies eine entscheidende Variable war, die es uns schwer machte, die ab-Aktivität dieser Zellen zu beobachten, haben wir die Bestrahlungsdosis systematisch getitriert und außerdem festgestellt, dass das Alter und das Gewicht des Versuchstiers sehr bedeutsam sind. Von da an liefen unsere Experimente äußerst reproduzierbar. Wir haben herausgefunden, dass, wenn man Tiere mit einem Gewicht von etwa 20 Gramm, also zwischen 15 und 20 Gramm, mit 9,25 Gray ablatiert, dies die optimale Dosis darzustellen scheint, die diesen Zellen den nötigen Vorteil verleiht, um die Mäuse wiederherzustellen. Ja, und ich denke, das war eine der wichtigsten Variablen.

Ein weiterer, weiterer, weiterer bedeutender Aspekt wäre die Anzahl der Zellen, die injiziert werden. Wir haben außerdem die Titer unter Verwendung dieser speziellen Bedingungen zur Bestrahlung unseres Modellorganismus bestimmt. Außerdem haben wir den Titer der Anzahl dieser unfractionierten, heterogenen Zellpopulation ermittelt, die wir in Mäuse injizierten.

Und wir haben im Grunde festgestellt, dass Sie eine minimale Dosis von etwa 2 bis 5 Millionen Zellen benötigen, um die Tiere zu retten. Wenn Sie weniger injizieren, werden die Tiere nicht gerettet. Und ich denke, das spricht dafür, dass die Zelle, die tatsächlich die Rettung in diesem heterogenen Kompartiment vermittelt, wahrscheinlich selten ist.

Ich denke daher, dass die wichtigsten Variablen die Anzahl der injizierten Zellen und die Gewissheit sind, dass – egal welches Transplantationsmodell Sie verwenden – die Zellen ausreichend mit dem Rohr oder einem Skalpell behandelt werden, um ihnen den nötigen Vorteil für die Rekonstitution zu verschaffen, ohne sie jedoch derart zu belasten, dass sie nicht mehr fähig sind, eine Rettung zu ermöglichen. Diese Faktoren waren die entscheidenden, die wesentlichen Variablen.