Eine schnelle High-Throughput-Verfahren zur Abbildung Ribonukleoproteine ​​(RNPs) on Human pre-mRNA

Um die Bindungsstellen von Ribo-Kernproteinen auf prä-mRNAs zu kartieren, beginnen Sie mit dem Kacheln über die angegebene Region der präm NNA von Interesse in 30 Nukleotidfenstern und synthetisieren Sie die gekachelten Oligos auf einem Array. Die Oligos werden aus dem Array gekocht und mit einem interessierenden RNP ausgefällt. Der gesamte Startpool wird mit SCI drei und der gebundene Pool mit SCI fünf gekennzeichnet, und beide werden auf das Erkennungsarray angewendet.

Das Array wird dann gescannt und die Merkmalsextraktionssoftware wird verwendet, um die Ergebnisse zu interpretieren. Salze. Hallo, ich bin Kate Watkins aus dem Labor von Will Fair, Bruder in der MCB-Abteilung an der Brown University. Heute zeige ich Ihnen ein schnelles und kostengünstiges Verfahren zur Bestimmung der genauen Position eines RNA-Proteinkomplexes auf Prem RA im Labor, Resynthese von Prem A als Pool von überlappenden Oligonukleotiden.

Dieser Pool kann dann durch Co-Immunpräzipitation in eine gebundene und eine ungebundene Fraktion getrennt und anschließend mit einem Microarray analysiert werden. Obwohl dieses Verfahren viele Anwendungen hat, verwenden wir es, um mehrere Spleißfaktoren und ihre Rolle sowie alternatives Spleißen zu untersuchen. Also lasst uns loslegen.

Um dieses Verfahren zu starten, verwenden Sie den uc SC-Genombrowser, um bestimmte Gene, Spleißverbindungen oder andere interessante Bereiche herunterzuladen, aus denen der Prem-A-Pool entworfen werden soll. Wählen Sie die gewünschten Fenster aus, und kacheln Sie dann rechnerisch mit einer Leselänge von 30 Nukleotiden und einer Überlappung von 20 Nukleotiden, sodass jedes Oligo um 10 Nukleotide gegenüber dem vorherigen verschoben wird. Jetzt, da die 30 Nukleotide langen Oligos definiert sind, flankieren sie jeweils mit universellen Primersequenzen.

Senden Sie die Oligos an Agilent, um sie auf einem benutzerdefinierten Oligonukleotid-Microarray zu drucken. Sobald der Microarray angekommen ist, beginnen Sie, die DNA-Oligos von seiner Oberfläche zu gewinnen, indem Sie den Array-Deckschieber in eine Array-Hybridisierungskammer legen und vorsichtig 500 Mikroliter deionisiertes Wasser auf den Objektträger pipettieren. Legen Sie den Microarray-Objektträger mit der bedruckten Seite nach unten auf den Deckblatt, so dass die Etiketten auf jedem Objektträger zueinander zeigen, und achten Sie darauf, Luftblasen zu vermeiden, die den Oligo-Rückgewinnungsprozess stören können.

Schließen Sie die Hybridisierungskammer und drehen Sie sie über Nacht bei 99 Grad Celsius in einem Hybridisierungsofen. Nehmen Sie das Array am nächsten Tag vorsichtig aus der Kammer und ziehen Sie das Wasser ab, das nun die von der Array-Oberfläche freigesetzten Oligos enthält. Geben Sie den Pool des freigesetzten Oligos in ein 1,5-Milliliter-Einorröhrchen und beschallen Sie, um potenzielle Klumpen bei 50 % Amplitude dreimal für jeweils drei bis fünf Sekunden Pulse aufzubrechen. Als nächstes amplifizieren Sie den Pool durch Low-Cycle-PCR unter Verwendung von Universalprimern, an deren Ende ein T-Promotor angehängt ist.

Die Anzahl der erforderlichen Zyklen kann je nach Effizienz der Oligorückgewinnung variieren. Vermeiden Sie eine Überverstärkung, die als verschmiertes Band auf einem Acrylamidgel sichtbar ist. Verwenden Sie zum Schluss das mega kurze Skript-Kit von Amon, um RNA zu transkribieren.

Die Transkriptionsreaktion wird durch Phenylchloroform-Extraktion der RNA beendet, gefolgt von einer Ethanolfällung unter Verwendung von Natriumacetat und Glykoblau als Träger. Reanimation: Suspendieren Sie das RNA-Pellet in 105 Mikrolitern TE-Puffer. Um die Konzentration der RNA genau zu bestimmen.

Verwenden Sie Ribogrün, um eine Standardkurve zu erzeugen. Anschließend wird mit einem Fluoreszenzplatten-Reader gemessen. Der RNA-Pool ist nun bereit für die Co-Immunpräzipitation, um mit dem Pulldown zu beginnen.

Bereiten Sie zunächst die magnetischen Kügelchen vor, indem Sie die Dyna-Kügelchen von Protein A und G in einem Eins-zu-Eins-Verhältnis zu einem Endvolumen von 50 Mikrolitern pro Reaktion kombinieren. Konzentrieren Sie die Kügelchen mit einem magnetischen Trennständer an einer Stelle, um den Überstand zu entfernen. Dann zweimal mit der gleichen Menge kalt waschen, einen XPBS nach dem zweiten Waschgang.

Resusieren Sie, suspendieren Sie die Kügelchen in einem gleichen Volumen kaltem XPBS und fügen Sie zwei Nanogramm des Antikörpers Perion hinzu. Diese Menge kann je nach Antikörper variieren, so dass Experimente erforderlich sein können, um die optimalen Bedingungen für die Bindung des Antikörpers an die Kügelchen zu finden. Inkubieren Sie die Mischung über Nacht bei vier Grad Celsius auf einer rotierenden Plattform.

Fügen Sie morgens zwei Mikrogramm pro Reaktion der beschallten Hefe-Gesamt-RNA hinzu, um die unspezifische Bindung zu blockieren, und rotieren Sie für weitere 30 Minuten bei vier Grad Celsius. Sobald der Blockierungsschritt abgeschlossen ist, verwenden Sie erneut das Magnetgestell, um den Überstand zu entfernen. Waschen Sie dann die Kügelchen zweimal mit kaltem, einem XPBS, und lassen Sie das PBS aus der zweiten Wäsche in der Tube, aliquotieren Sie 50 Mikroliter der Perlenmischung in neue Röhrchen.

Ein Röhrchen für jede Co-IP-Reaktion. Die Perlen sind nun bereit für die Co ip. Bereiten Sie als Nächstes den Mastermix vor, indem Sie den RNA-Oligopool mit dem Kernzellextrakt kombinieren.

Als RNP-Quelle ist ein 50-Mikroliter-Aliquot des Mastermixes als vollständiger Probenschutz zu verwenden. Primer, bei denen es sich um RNA-Versionen der Universalprimer handelt, können hinzugefügt werden, um die Proteinbindung an die Primersequenz oder das Einbringen einer Sekundärstruktur in die RNA zu verhindern. Um die Co-Immunpräzipitation zu starten, entfernen Sie den Überstand von den Bead-Aliquoten und resuspendieren Sie die Beads in 120 Mikrolitern des restlichen Mastermixes. Wiegen Sie die Reaktionen ein bis zwei Stunden lang bei vier Grad Celsius.

Am Ende der Inkubation kann ein kleiner Eloqua einschließlich der Kügelchen aus jedem Coip entfernt werden. Für zusätzliche Tests der Bindungseffizienz oder Spezifität legen Sie den Rest der Reaktionen auf den Magneten und entfernen Sie den Überstand. Es folgen ein bis zwei Wäschen mit kaltem XPDS.

Die RNA, die über den RNP an den Antikörper auf den Kügelchen gebunden ist, ist die IP-Probe. Suspendieren Sie die IP-Beads erneut in 50 Mikrolitern 1 % SDS in 0,1 XTE-Puffer und erhitzen Sie die Proben 15 Minuten lang bei 65 Grad Celsius. Um die RNA zu eluieren, entfernen Sie den Überstand, der nun die RNA enthält, die zuvor an die Kügelchen gebunden war, und reinigen Sie sie durch Phenylchloroform-Extraktion, gefolgt von einer Ethanolfällung, und suspendieren Sie das Pellet in 50 Mikrolitern 0,1 XT-Puffer

Als nächstes transkribieren Sie die Proben mit den umgekehrten Universalprimern. Anschließend werden die Proben durch PCR mit den Universalprimern amplifiziert, von denen einer einen T-Sieben-Promotor enthalten sollte. Die Anzahl der Zyklen, die erforderlich sind, um den Pool zu erweitern, hängt von der Effizienz des CO IP ab.

Transkribieren Sie die Proben mit dem mega shorts Script Kit von ambion erneut, fügen Sie jedoch dieses Mal zwei Mikroliter Aminoallel UTP anstelle des mit dem Kit gelieferten T sieben UTP hinzu. Das Aminoallel UTP wird später verwendet, um die RNA mit den Seitenaugen zu markieren. Wenn die Transkription abgeschlossen ist.

Phenylchloroform-Extrakt und Ethanol fällen die Proben aus. Verwenden Sie kein Glykoblau oder Ammoniumacetat, da dies die Hybridisierung der Proben mit dem Array beeinträchtigen kann. Suspendieren Sie das Pellet in 4,5 Mikrolitern 0,1 molaren Natriumcarbonat.

Um die Proben zuerst zu markieren, fügen Sie der Gesamtprobe 2,5 Mikroliter nukleasefreies Wasser hinzu. Fügen Sie drei Mikroliter S3 hinzu und geben Sie zur IP-Probe drei Mikroliter Querschnittlähmung fünf. Eine Stunde lang im Dunkeln inkubieren.

Bei Raumtemperatur wird die Reaktion beendet, indem jeder Probe sechs Mikroliter viermolares Hydroxyllamin HCL zugesetzt werden, gründlich gemischt und geschleudert wird. 15 Minuten lang kurz inkubieren. Bei Raumtemperatur werden die markierten Proben durch Phenylchloroform-Extraktion und anschließende Ethanolfällung gereinigt. Der größte Teil der Farbe wird mit den freien Nukleotiden in die organische Phase gezogen, so dass die Pellets möglicherweise nicht sichtbar gefärbt sind.

Resus suspendieren Sie jedes Pellet in 50 Mikrolitern mit 0,1 XTE. Befolgen Sie die Anweisungen des Agilent Array-Hybridisierungskits, um die Microarray-Probe vorzubereiten, mit der folgenden Ausnahme. Fragmentieren Sie die RNA nicht: Fügen Sie nach Zugabe des Fragmentierungspuffers sofort den Hybridisierungspuffer hinzu, um die Fragmentierung zu stoppen.

Legen Sie die Proben auf das Array und hybridisieren Sie drei Stunden lang bei 50 Grad Celsius, während sich das Array dreht. Bereiten Sie die folgenden 50-Milliliter-Lösungen in konischen 50-Milliliter-Röhrchen vor. Ein Rohr mit zwei überschüssigen SC-Puffern, zwei Rohre mit einem überschüssigen Meerespuffer und ein Rohr mit deionisiertem Wasser.

Nach der dreistündigen Inkubation lösen Sie vorsichtig das Array-Objektträger-Sandwich und legen Sie es in die beiden XSSC-Puffer. Mit einer Pinzette. Trennen Sie das Array vorsichtig von der Deckfolie.

Entfernen Sie vorsichtig die Abdeckfolie und achten Sie darauf, das Array nicht zu berühren. Wenn der Schieber herausgezogen wird, schließen Sie den Konus und drehen Sie ihn vorsichtig 60 Sekunden lang um. Übertragen Sie das Array mit der Pinzette auf die eine XSSC-Lösung.

Verschließen Sie das Röhrchen und drehen Sie es eine Minute lang vorsichtig um. Übertragen Sie dann das Array in die zweite XSSC-Lösung und invertieren Sie es erneut vorsichtig für eine weitere Minute. Übertragen Sie zum Schluss das Array in das Röhrchen mit deionisiertem Wasser und invertieren Sie es vorsichtig für 30 Sekunden.

Trocknen Sie das Array, indem Sie die Ränder des Objektträgers auf ein Kim-Tuch legen. Drehen Sie das Array auf dem Tuch weiter und achten Sie darauf, die Seite mit den Oligos nicht zu beschädigen. Legen Sie das Array in ein leeres konisches Röhrchen und fahren Sie mit dem Scannen des Arrays fort.

Fahren Sie mit dem Scannen des Arrays fort. Hier ist ein repräsentatives Array. Jedes Feature oder Oligo ist entweder grün für den gesamten nicht angereicherten Pool oder rot für den mit IP angereicherten Pool eingefärbt.

Das Signal an jedem Feature wird auf die Gesamtintensität an diesem Kanal normiert. Die endgültige Ausgabe ist das Log-Verhältnis des roten Kanals zum grünen Kanal. Bei jedem Merkmal des Arrays wird die durchschnittliche Punktzahl an jeder genomischen Koordinate der angegebenen Position zugeordnet.

Eine Veranschaulichung dieses Mittelungsschritts ist für drei überlappende 30-Nukleotid-Oligos mit Werten von zwei, vier und 0,5 gegeben, wobei der durchschnittliche Anreicherungswert für jedes 10-Nukleotid-Fenster gezeigt wird. Hier ist ein Beispiel für ein Bindungsschema für das polyperine verfolgte Bindungsprotein PTB am CLTA-Gen, die Genmerkmale sind entlang des unteren Teils angegeben, und die logarithmischen durchschnittlichen Anreicherungswerte für das PTP-gebundene S werden durch dunkelrote vertikale Balken dargestellt. Hellrote Balken zeigen Bereiche an, die für die PTP-Bindung nicht angereichert sind.

Ich habe Ihnen gerade gezeigt, wie Sie schnell und effizient einen Oligonukleotidpool erstellen können, der sich über interessante Bereiche erstreckt, z. B. alternativ geschnittene Axone. Wir analysieren unsere Pools per Microarray, es ist aber auch möglich, sie entweder durch Illuminous, Lexi-Sequenzierung oder traditionellere Sanger-Sequenzierung zu sequenzieren. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass die Erstellung des Pools entweder auf RNA- oder Proteinebene modifizierbar ist.

Auf RNA-Ebene können wir autologe Regionen, Krankheitsmutationen, Polymorphismen oder zufällige Mutationen in die Oligonukleotidsequenz einbringen. Auf Proteinebene kann der RNA-Bindungsfaktor durch Phosphorylierung oder andere posttranslationale Modifikationen modifiziert werden. Außerdem kann die Bindungsumgebung manipuliert werden, um die Spiegel zusätzlicher Faktoren, die entweder mit dem interessierenden RNA-Bindungsprotein konkurrieren oder mit ihm interagieren, entweder zu erhöhen oder zu verringern.

Das war's also. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.