Engineering zellpermeablen Protein

Die Manipulation der zellulären Funktion kann durch die klassischen Ansätze der DNA-Transfektion oder der viralen Transduktion innerhalb der letzten 15 Jahre erreicht werden. Eine andere Methode entwickelte sich. Das biologisch aktive Protein der Proteintransduktion kann mithilfe kleiner Peptide, die mit dem interessierenden Protein fusioniert sind, direkt in Säugetierzellen eingebracht werden, was die zelluläre Aufnahme fördert.

Da keine DNA verwendet wird, wird das Risiko einer Agenesie der Anstrengung vermieden. Im Gegensatz zu den oben genannten klassischen Methoden. Die Proteintransduktion ermöglicht die titrierbare Abgabe von Proteinen.

Darüber hinaus können sowohl kleine Zellpopulationen als auch sich nicht teilende Zellen, wie z.B. postmitotische Neuronen, moduliert werden. Um rekombinante Proteine effizient zu exprimieren, empfehlen wir die Verwendung des Paciz-Vektorsystems. Es handelt sich um ein modulares Vektorsystem, bestehend aus einer Endklemmen- und einer C-Klemmenvariante.

Beide Vektoren ermöglichen das einfache Einfügen des interessierenden Gens für die Aufreinigung. Ein Histidin-Tag ist ebenso integriert wie eine Proteintransduktionsdomäne. In unserem Fall fördert die Berührung durch das HI-Virus die zelluläre Aufnahme für die zelluläre Verteilung.

Ein nukleares Lokalisierungssignal vervollständigt den Vektor, zu Kontrollzwecken können Fusionsmarkierungen einfach entfernt werden. Außerdem kann die Anordnung dieser Markierungen einen großen Einfluss auf die Eigenschaften der Fusionsproteine haben. Der Einfluss auf Ertrag und Reinheit sowie Verkaufsfähigkeit und biologische Funktion ist nicht vorhersehbar.

Hallo, mein Name ist Bernard Mus und ich arbeite in der Gruppe Stammzelltechnik am Institut für Rekonstruktive Neurobiologie in Bond, Deutschland. Hallo, mein Name ist Christoph P und ich bin auch Mitglied im in Hoover Lab. Unsere Arbeitsgruppe nutzt intensiv die Proteintransduktionstechnik, um biologisch aktives Protein direkt in verschiedene Säugetierzellen zu bringen, und heute möchten wir Sie durch den Prozess der Expression und Reinigung in und aus E-coli führen.

Danach möchten wir Ihnen zeigen, wie Sie zellpermanentes Fusionsprotein in Zellkulturen anwenden können, um das gesamte Verfahren zu veranschaulichen: Expression, Reinigung und Anwendung. Wir nutzen die ortsspezifische Rekombination Cree, um mausische Stammzellen genetisch zu modifizieren. Okay.Okay. Fangen wir an.

Um die Overnight-Kultur zu impfen, nutzen wir bereits transformierte Bakterien, die in einem Glycerin-Stamm bei minus 80 Grad Celsius gelagert sind. Diese Bakterien enthalten bereits den Vektor, der für die Dekre-Rekombination kodiert. Mit einer Piperspitze kratzen wir eine kleine Menge der Bakterien auf die Piperspitze und lassen sie in das Becherglas fallen, in dem sich die Übernachtkultur befindet.

Die Übernachtkultur besteht aus LB-Medien, die mit Glukose in einer Endkonzentration von oh 0,5 % und 50 Mikrogramm Kohlensäureinsulin pro ml ergänzt werden. Das Becherglas wird dann in einen bei 37 Grad Celsius laufenden Inkubator gegeben, um das ortsspezifische rekombinate Cree zu exprimieren. Wir verwenden TB-Medien aus der Vorkriegszeit für unsere groß angelegte Ausdruckskultur.

Um die Expression zu beschleunigen, empfehlen wir die Verwendung von TB-Medien, die auf 37 Grad Celsius erwärmt sind, was der Temperatur während der Expression des rekombinanten Proteins entspricht. Als nächstes fügen wir dem TB-Medium Glukose in einer Endkonzentration von oh 0,5% hinzu. Die Glukose verhindert eine erhöhte basale Expression des Fusionsproteins während des Wachstums der Expressionskultur vor der Induktion. Schließlich wird der Expressionskultur Ampicillin in einer Endkonzentration von 100 Mikrogramm pro ml zugesetzt, um eine Reinkultur zu gewährleisten, die nur die Bakterien enthält, die noch das Plasmid beherbergen, das für das Decree-Protein kodiert.

Wir können jetzt unsere Übernacht-Kultur bekommen und die Ausdruckskultur im Verhältnis von eins zu 50 impfen. Die Becher werden dann in einen 37 Grad heißen Brutkasten überführt. Sie sollten Proben nehmen, um die optische Dichte während der gesamten Expression regelmäßig zu messen.

Sobald die Kultur eine optische Dichte von 1,5 erreicht hat, werden die Bakterien mit einer Endkonzentration von oh 0,5 Millimolar IPTG induziert. Nach einer Stunde Induktion wird die Expressionskultur in Röhrchen überführt und anschließend durch Zentrifugation geerntet. Zu diesem Zweck verwenden wir einen SLA 3000 Rotor.

Die Zentrifuge läuft mit einer Geschwindigkeit von 5.000 Umdrehungen pro Minute für 10 Minuten bei vier Grad Vorgrad. Die Schlinge wird dann entsorgt und das Bakterienpellet kann unbegrenzt bei minus 20 Grad Celsius gelagert werden. Die gefrorenen Pellets werden in Lizza Puffer resuspendiert, ein Appellat, das einem Liter Expressionskultur entspricht.

Wir verwenden 10 ml Lizza Puffer und warten ca. 15 Minuten, bis die Lösung homogen wird. Pro ml Suspension wird dann ein Milligramm Lysozym zugegeben. Die Lösung wird 20 Minuten lang gemischt, damit das Enzym die Bakterien aufbrechen kann.

Anschließend wird Benson Nase in einer Verdünnung von eins bis 1000 für weitere 15 Minuten zugegeben, wodurch die DNA geschnitten wird, was zu einer nicht viskosen Lösung führt. Schließlich wird ein Sonator verwendet, um die Lyse der Zellen zu gewährleisten. Das Programm läuft nach Abschluss der Zertifizierung eineinhalb Minuten lang mit einer Leistung von 45%.

Denken Sie daran, von jedem Schritt hier eine Probe zu nehmen, die Rohlysat- oder SDS-Seitenanalyse der Reinigung. Es ist jetzt wirklich wichtig, einen ml eiskalten TSB-Puffer pro ml Suspension hinzuzufügen, da das Protein dazu neigt, im Glycerinbestand auszufällen. Wenn Sie diesen Schritt überspringen, wird die Lösung kurz gemischt und das Rohmaterial ist nun bereit für die Zentrifugation.

Zu diesem Zweck verwenden wir einen Rotor SS 34. Die Zentrifuge läuft 30 Minuten lang mit 17.000 U/min bei vier Grad Celsius. Als dies fertig war, übertrug centrifuge Inc den S-Überstand vorsichtig in frische 50-ml-Falcon-Röhrchen.

Geben Sie nun Nickel Anti A Slurry zum überstehenden Nickel. Anti A ist ein entscheidendes Reagenz für die ordnungsgemäße Reinigung der Histidin-Tech-Fusionsproteine. Das Histidin bildet mit den Nickel-Ionen einen Komplex, der eine Affinitätsreinigung ermöglicht. Schütteln Sie nun die Parkröhren für 60 Minuten sanft auf 40 Grad Celsius.

Nach einer Stunde können Sie die Suspension nun auf 20 ML-Säulen auftragen und die Lösung durch die Schwerkraft durchlaufen lassen. Bei Großserien ist es möglich, die Aufhängung auf mehrere Säulen aufzuteilen. Dann waschen wir die Säule zweimal mit einem Puffer, der 15 Millimolar Einlegesohle enthält.

Die Menge des aufgetragenen Puffers hängt vom Harzvolumen ab. Zwei MLS Nickel NTA entsprechen einem ml Harz für Waschmittel. Wir haben nach dem Waschen fünf Volumen Waschpuffer auf die Säule gegeben, wir sind jetzt bereit, unser Protein zu entziehen.

Daher verwenden wir einen Elutionspuffer mit einer Konzentration von 250 Millimolar Immun. Achte also darauf, wie sich die Farbe des Harzes in Richtung Grün verändert. Aufgrund der hohen Konzentrationen des CRE-Proteins wird die OID-Fraktion manchmal verdorben.

Um dies zu verhindern, mischen Sie die Lösung und fügen Sie zusätzlichen Lys-Puffer hinzu, die alle Fraktionen werden nun gepoolt und anschließend in einen Lyseschlauch überführt. Die Lyse entfernt den alten ersten Dialysatorschritt wird gegen den Puffer durchgeführt, der eine hohe Salzkonzentration enthält. Nach einer Stunde wird der Puffer mit hohem Salzgehalt ausgetauscht und das Dialyseverfahren über Nacht angewendet.

Am nächsten Tag wird der Dialyseschlauch aus dem Puffer mit hohem Salzgehalt entnommen und in einen Glycerinpuffer überführt. Nach drei bis fünf Stunden wird der Glycerinpuffer ausgetauscht und über Nacht erneut eine Dialyse durchgeführt. Die Lyse gegen Glycerinpuffer führt zu einer mindestens dreifach konzentrierten Stammlösung.

Die Stammlösung kann nun mehrere Jahre bei minus 20 Grad Celsius gelagert werden, ohne dass die Aktivität verloren geht. Zur Qualitätssicherung können Sie Ihre gesammelten SDB-Seitenmuster auf ein Gel laden und anschließend färben. Für Kamasi ist das Cree-Fusionsprotein als prominente Bande in der OID-Fraktion nachweisbar. Um die richtige Konzentration der Besatzungsrekombination zu verwenden, sollten Sie die Konzentration mit Hilfe des Redford-Assays bestimmen.

Wie man solche dauerhaften Proteine in Säugetierzellen einbringt. Bereiten Sie zunächst Ihre Zielzellen vor, um die höchste Effizienz der Proteintransduktion zu erreichen. Sehen Sie sich Monolayer-Zellen bei der Dichte an, die am nächsten Tag zu einer 80 bis 90%igen Konfluenz-Zellschicht führt, falls es sich bei Ihren Zielzellen um Ja-Zellen handelt, die in kompakten Kolonien gezüchtet werden.

Trennen Sie die Zellen somatisch und sehen Sie sie fünf Stunden im Voraus in einer Einzelzellsuspension. Es ist wichtig, vor der Proteintransduktion eine Einzelzellsuspension herzustellen, da sonst nur Luftzellen auf der Oberfläche einer Kolonie transfundiert werden können. Aspirieren Sie die Medien und beobachten Sie kurz die Luftzellen mit PPS vor der Tryin-Behandlung.

Entfernen Sie die restlichen Ja, ekligen Medien, die Serum enthalten. Nach dem Aspirieren der PPS überlagern Sie die Zellen mit Tropfen und lassen Sie sie drei bis fünf Minuten inkubieren. Prüfen Sie nun mit dem Mikroskop, ob alle Kolonien in einzelne Zellen aufgelöst sind.

Die eben genannten Gründe zeigen, dass dies ein entscheidender Schritt für die Proteintransduktion in Yeah-Zellen ist. Übertragen Sie abgelöste Zellen in ein Röhrchen. Legen Sie das Röhrchen auf einen Tisch, zentrifugieren Sie die Zellen und drehen Sie sie nach unten, aspirieren Sie das Supermittel und resuspendieren Sie die Zelle.

P in Wachstumsmedien verdünnen die Zellen in eine geeignete Zellzahl. Das hängt natürlich von der Größe der Gewebekultur ab. Inkubieren Sie die Luftzellen weitere fünf Stunden lang.

Dies gibt den Luftzellen genügend Zeit, sich am Boden festzusetzen und zu wachsen. Drei Klassen Reihenmaterial können mehr als zwei Jahre bei minus 20 Grad gelagert werden. Bei der Arbeit mit rekombinanten zellulären permanenten Fusionsproteinen ist es sehr vorteilhaft, eine solche Stammlösung zu haben, die bei Bedarf verwendet werden kann.

Während man darauf wartet, dass sich die Zellen an die Schale anheften, kann man das C-Transduktionsmedium einfach vorbereiten und ein entsprechendes Volumen des zellpermanenten Kriechens aus dem Cholesterinvorrat in sich selbst verdünnen. Medien. Da die Clare-Stammlösung noch nicht steril ist, müssen Transmedien vor ihrer Anwendung sterilfiltriert werden. Wir empfehlen die Verwendung einer Spritze, die auf einen Proteinbindungsfilter geschraubt werden kann.

Die endgültige Bachkonzentration ist abhängig vom Zelltyp oder den Medienzusätzen. So hat beispielsweise Serum einen starken negativen Einfluss auf die Transduktionseffizienz. Dies kann durch die Verwendung von serumfreien Medien oder durch eine erhöhte Bachkonzentration überwunden werden.

Wir finden die optimalen Bedingungen, die höchste Rekombinationseffizienz ermöglichen. Die Hydratkonzentration beginnt bei oh 0,5 bis 10 μmolar. Wir empfehlen, unterschiedliche Inkubationszeiten zwischen sechs und 18 Stunden zu testen.

Nehmen Sie nach fünf Stunden Inkubation Ihre Zielzellen heraus und aspirieren Sie Crossmedia. Anschließend ersetzen wir es durch Proteintransduktionsmedien und setzen die Luftzellen nach der Inkubation über Nacht wieder in den Inkubator ein. D-Zellen kurzzeitig mit PPS gewaschen und das Proteintransduktionsmedium auf normale ES-Medien umgestellt.

48 Stunden nach der Inkubation der Zelle kann die permanente Genexpression der Cree-Entlüftung über xul nachgewiesen werden. Färbende Zellen mit positivem Bega-Phänotyp wurden erfolgreich durch die ortsspezifische Rekombination gentechnisch verändert. Cree den Bericht.

Die Zellen beherbergen CRE unter Verwendung des Lae-Konstrukts bei prämediärer Rekombination. Eine Lock-P-Flanken-Stop-Sequenz wird herausgeschnitten und ein luxuriöses Reportergen wird aktiviert, das vom Team-Promoter gesteuert wird. Um die Rekombinationseffizienz in vorbehandelten Reporterzellen zu beurteilen, müssen Zellen fixiert werden.

Aspirieren Sie das Medium, waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS-Overlay-Zellen mit 4 % PFA und inkubieren Sie die Zellen 10 Minuten lang bei Raumtemperatur. Danach die Zellen noch einmal dreimal mit PBS waschen. Nach dem Aspirieren des PBS aus dem letzten Waschschritt bei Xal Fleckenlösung in die Vertiefungen werden die Zellen über Nacht bei 37 Grad in einem Inkubator inkubiert.

Am nächsten Tag kann die Beal-Aktivität durch Blue-Collar-Zellen überwacht werden. Die Rekombinationseffizienz kann durch die Anzahl der blauen Kolonien bestimmt werden. Unter optimalen Bedingungen sollten Sie in der Lage sein, eine Rekombinationseffizienz von mehr als 90% zu erreichenIn Ordnung, heute haben wir Ihnen gezeigt, wie Sie die ortsspezifische Abfragerekombination von E. coli ausdrücken und reinigen können.

In dieser Proof-of-Principle-Studie konnten wir in den meisten Salzen eine Rekombination induzieren. Okay, das war's. Viel Glück bei Ihren Experimenten.I.