Optische Erfassung der elektrischen Aktivität in Guinea-pig Enteric Networks mit spannungsabhängigen Farbstoffen

Dieses Video zeigt die Dissektion und anschließende Bildgebung elektrisch stimulierter Präparationen des enterischen Nervensystems unter Verwendung des spannungsempfindlichen Farbstoffs D four A-N-E-P-P-D-H-Q am natalen Styre-Perineum. Ein kleines Segment des Darms wird einem euthanasierten Meerschweinchen entnommen und präpariert, um zunächst die Submukosa und letztendlich das Myenterische Plexus für optische Aufnahmen freizulegen. Nachdem ein erstes Bild mit hoher Auflösung aufgenommen wurde, werden Elektroden auf das mit D for A-N-E-P-P-D-H-Q gefärbte, montierte Gewebe platziert.

Optische Veränderungen, die auf elektrische Aktivität hinweisen, werden mit der Hochgeschwindigkeitskamera aufgezeichnet. Während der Hochgeschwindigkeitsaufnahme wird eine elektrische Stimulation appliziert. Das hochauflösende Bild wird anschließend zur Analyse mit Neuro Plex über die Pixelkarte der Hochgeschwindigkeitskamera gelegt.

Hallo, ich bin Brian Salzberg, Leiter des Labors für zelluläre Optik oder kurz loco, wie wir es in der Abteilung für Neurowissenschaften an der University of Pennsylvania gerne nennen. Mein Name ist Analia Obide. Ich bin ebenfalls Mitglied des Labors für zelluläre Optik.

Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Aufzeichnung elektrischer Aktivität intakter, säugetierischer neuronaler Netzwerke mithilfe spannungsabhängiger Farbstoffe. Wir verwenden dieses Verfahren, um die neuronale Vernetzung innerhalb und zwischen den beiden Netzwerken zu untersuchen, aus denen das enterische Nervensystem besteht, das auch als zweites Gehirn oder Gehirn des Darms bezeichnet wird. Beginnen wir also.

Bereiten Sie submuköse und myenterische Plexus-Präparationen vor, indem Sie das Dünndarmstück eines 150 bis 200 Gramm schweren oder zwei bis drei Wochen alten Hartley-Meerschweinchens entfernen, das zuvor durch Inhalation von Isofluran anästhesiert und dann dekapitiert wurde. Entfernen Sie anschließend den Darminhalt, indem Sie das Lumen mit einer warmen, mit Sauerstoff angereicherten M199-DM-Lösung ausspülen. Schneiden Sie ein Darmsegment von acht bis zehn Zentimeter Länge ab und achten Sie darauf, die Polarität zu erhalten.

Überführen Sie es in eine mit Sard beschichtete 10 cm-Glaswanne, die M1 99 DM mit Raumtemperatur enthält. Stellen Sie die Wanne unter ein Stereomikroskop mit Dunkelfeldbeleuchtung. Öffnen Sie dann mit einer Schere die mesenteriale Grenze und befestigen Sie das Darmsegment mit Insektnadeln so, dass die Mukosa nach oben zeigt.

Es ist äußerst wichtig, eine gleichmäßige Spannung aufrechtzuerhalten, damit das Gewebe nach dem Fixieren eine rechteckige Form aufweist und die Reihen der Mukosavilli regelmäßig ausgerichtet sind, wobei feine Dumont-Pinzetten mit geraden Spitzen in einer nahezu horizontalen Position gehalten werden. Lösen Sie die Mukosa, indem Sie die Villi an einem Ende des Darmabschnitts greifen und entlang der Längsachse des Gewebes ziehen. Setzen Sie das Abtrennen von Mukosastreifen fort, um die Submukosa freizulegen, die die Submukosaganglien und die submuköse Gefäßversorgung enthält.

Danach mit sehr feinen Scheren einen Schnitt in die Submukosaschicht entlang der Ausrichtung der zirkulären Muskelfasern machen. Dann die Submukosa mit der feinen Pinzette sehr vorsichtig anheben, während der zirkuläre Muskel mit der Schere nach unten gedrückt wird, und entlang der longitudinalen Ränder schneiden.

Lösen Sie die Submukosa von der übrigen Präparation, während sich die Trennung fortsetzt. Führen Sie nun einen zweiten Schnitt entlang der Orientierung der zirkulären Muskelfasern in einem Abstand von 1,5 bis drei Zentimetern vom ersten Schnitt durch, um die endgültige Größe des submukösen Präparats festzulegen; das resultierende submuköse Segment ist 30 bis 50 Mikrometer dick und weist ein durchscheinendes Aussehen auf. Überführen Sie es in eine andere Sylgard-Schale, die frisches M1 99 DM enthält, und fixieren Sie es vorsichtig und spannungsfrei.

Legen Sie die Schale dann bei Raumtemperatur in eine mit Sauerstoff versorgte Kammer, um sie später zu verwenden. Das ursprüngliche Darmsegment sollte nun von Mukosa und Submukosa befreit sein, und der Musculus circularis sollte freigelegt sein. Dieses Segment wird nun verwendet, um eine Myentericus-Präparation herzustellen, die den Plexus myentericus sichtbar macht.

Entfernen Sie mithilfe einer feinen Pinzette mit gerader Spitze so viel wie möglich der ringförmigen Muskelschicht, indem Sie Faserbündel von jeder Seite des Präparats wegzupfen. Das freigelegte Myenterische Plexus kann nicht von der Längsmuskelschicht und dem darunterliegenden CI getrennt werden. Überführen Sie das Myenterische-Plexus-Präparat in eine neue, mit Sard beschichtete Schale, die mit oxygeniertem M1 99 M gefüllt ist. Heften Sie die Probe, die lebenden Muskel enthält, dann locker fest. Einige Minuten vor dem optischen Experiment überführen Sie das Präparat in eine neue, kleinere, mit Sylgard beschichtete Schale, die bereits mit M1 99 DM, das zwei Mikromolar Nefe enthält, gefüllt ist, um Muskelkontraktionen zu verhindern, und befestigen Sie es sorgfältig, indem Sie mehrere sehr feine Nadeln entlang des Randes platzieren.

Stellen Sie sicher, dass die Spannung gleichmäßig verteilt ist und das Gewebe vollständig plan auf dem Silikonstreifen am Boden aufliegt. Die Gewebepräparation ist nun bereit für physiologische Experimente. Bereiten Sie eine stehende Lösung von fünf bis 50 Mikrogramm pro Milliliter DAI four A-N-E-P-P-D HQ in M1 99 M mit zwei Mikromolar Nifedipin in einem Glasfläschchen vor und decken Sie sie mit Aluminiumfolie ab.

Das Ethanol aus der Stammlösung sollte weniger als 0,5 % der Lösung zur M1 99 DM mit Nifedipin ausmachen, die die Probe bedeckte; ersetzen Sie diese durch die hergestellte Farbstofflösung. Inkubieren Sie unter Verwendung eines ausreichenden Volumens der Lösung, um das Gewebe vollständig zu bedecken, bei Raumtemperatur für 10 bis 30 Minuten. Nach der Inkubation waschen Sie die Probe mit oxygenierter M1 99 M plus NEFE, indem Sie den gesamten Inhalt der Kammer ersetzen.

Die optische Aufzeichnung neuronaler Aktivität in elektrisch stimulierten Präparaten erfolgt mithilfe eines Systems, das aus einem aufrechten Epi-Fluoreszenzmikroskop mit einem Bildteiler, einer präzisen Hochgeschwindigkeitskamera mit niedriger Auflösung, einer hochauflösenden Schwarz-Weiß-Kamera, einem computergesteuerten Stimulansgenerator und einem Mikromanipulator besteht. Die gesamte Apparatur ist auf einem aktiv schwingungsisolierten Tisch montiert und von schweren akustischen Vorhängen sowie einem Mylar-Dach umgeben, um Luftschwingungen zu minimieren. Obwohl die Bildaufnahme von beiden Kameras mit einem einzigen Computer durchgeführt werden kann, der sowohl Neuro Plex als auch Global Lab Image Two oder eine andere Bildaufnahmesoftware ausführt, verwendet der hier gezeigte Aufbau zwei Computer, von denen jeder eine separate Kamera steuert, um die optischen Experimente zu beginnen.

Platzieren Sie die Kammer mit der gefärbten, gepanzerten Probe auf dem Mikroskoptisch. Da D vier A und EPPD HQ ein membranimpermanenter Farbstoff ist, der nur in einer lipidreichen Umgebung fluoresziert, sollten gesunde Neuronen aus einer gefärbten enterischen Präparation unter jeder Vergrößerung über 20 x wie leere Ballons erscheinen, wenn sie betrachtet werden. Verwenden Sie die Filter HQ 5 35 50 für die Anregung, HQ 5 72 LP vier für die Emission und einen 5 65 Nanometer Dicke-Spiegel.

Als Nächstes positionieren Sie mithilfe der Mikromanipulatorsteuerung eine mehrkanalige lineare Matrix-Anordnung mit Elektroden am oralen Ende des Gewebes, wobei darauf zu achten ist, dass die Elektrode außerhalb des Mikroskopobjektivs liegt. Eine lineare Matrix-Anordnung mit 10 Wolframelektroden, die über eine Strecke von einem Zentimeter verteilt sind, kann mehrere unabhängige neuronale Bahnen stimulieren und eignet sich gut zur Untersuchung vernetzter ganglionärer Schaltkreise. Für die repräsentativen Daten verwendeten wir jedoch eine selbstgebaute stimulierende Zweileiter-Elektrode.

Verwenden Sie Klebewachs, um eine Ableitelektrode am gegenüberliegenden Ende der Kammer anzubringen, bevor Sie eine funktionelle Ableitung durchführen, und nehmen Sie ein hochauflösendes Schwarz-Weiß-Bild des Bereichs auf, aus dem die elektrische Aktivität registriert wird, um die Visualisierung zu erleichtern. Der Graustufenkontrast kann invertiert werden, sodass Fluoreszenz dunkel erscheint. Um eine Stromstimulation mittels des computergesteuerten Stimulationsgenerators durchzuführen, programmieren Sie zunächst das Gerät, indem Sie die geeignete Intensität, Dauer, Frequenz und Anzahl der Reize sowie die Verzögerung bezüglich des Beginns der optischen Datenaufnahme auswählen.

Um sicherzustellen, dass die Stimulation innerhalb der Grenzen der optischen Datenerfassung erfolgt, konfigurieren Sie den Stimulationsgenerator als von Neuro Plex gesteuertes Gerät. Anschließend legen Sie innerhalb von Neuro Plex die Erfassungsparameter fest, einschließlich Bildfrequenz, Anzahl der Bilder und Kameraverstärkung. Um eine vollständige Auflösung eines Aktionspotentials zu erreichen, sollte die Bildfrequenz mindestens ein Kilohertz betragen.

Da D four A und E-P-P-G-H-Q eine Abnahme der Fluoreszenz bei Depolarisation aufweisen, die linear mit der Spannungsänderung verknüpft ist, kehren Sie die Anzeige der optischen Signale in Neuro Plex um, sodass die Aktionspotenziale nicht auf dem Kopf stehend erscheinen. Beginnen Sie mit der Aufnahme. Denken Sie daran, vor jeder funktionellen Aufnahme ein neues hochauflösendes Schwarz-Weiß-Bild jedes Blickfelds aufzunehmen.

Nach Abschluss der Aufnahme verwenden Sie Neuro Plex, um die Ergebnisse offline zu analysieren. Ein Bildschirmbereich mit der Bezeichnung Seitenanzeige zeigt das rohe Bild der Präparation, wie es von der 80 × 80 Hochgeschwindigkeitskamera als Einzelbild erfasst wurde. Wenn der Seitenmodus auf absolutes Einzelbild eingestellt ist, wird das hochauflösende Bild, das mit der zweiten Kamera aufgenommen wurde, mithilfe der Neuro Plex-Anzeigebefehle über die Pixelkarte des rohen Bildes gelegt.

Dazu ist ein Wechsel des Seitenmodus von absoluter Spur zu Spuren sowie die Auswahl eines überlagerten Bildes über den Anzeigebefehl erforderlich. Wählen Sie mithilfe der Maus entweder einzelne Pixel oder Pixelgruppen aus dem im Seitenanzeigefenster dargestellten Bild aus. Die Ausgaben dieser interessierenden Bereiche erscheinen als Spuren im Spurenanzeigefenster und zeigen die Größen der von diesen Pixeln registrierten optischen Änderungen als Funktion der Zeit an.

Die Invertierung der Graustufen im hochauflösenden Bild verbessert die Visualisierung auf der Spurenmodus-Seitenanzeige, und es wird dringend empfohlen, einen analogen Ausgang des Stimulators anzuzeigen. Wählen Sie den analogen Ausgangskanal für die Einbindung in das Spurenanzeigefenster aus. Dieser Ausgang zeigt den genauen Zeitpunkt der während des Experiments applizierten Reize an.

Um die Daten als Film anzusehen, verwenden Sie die Filmfunktionen in Neuro Plex, um aufeinanderfolgende Einzelbilder innerhalb eines Datensatzes mithilfe von Pseudofarbskalen anzuzeigen, die an die maximale und minimale Änderung der Fluoreszenzintensität angepasst sind. Ein Ganglion aus einer Myenterischen Plexus-Präparation, das mit DIA four A-N-E-P-P-D-H-Q gefärbt wurde, wurde mit einer hochauflösenden Kamera und einem 60x-Objektiv abgebildet. Während der Datenaufnahme wurde die Präparation mit einer Serie von fünf Impulsen bei 40 Hertz stimuliert.

Bei jedem Puls mit einer Amplitude von 15 Milliampere und einer Dauer von 0,5 Millisekunden wurden vier interessierende Bereiche oder ROI identifiziert, und Spuren wurden erzeugt, um die optischen Daten anzuzeigen, die über die ausgewählten Bereiche in der Pseudofarbdarstellung gemittelt wurden. Im ersten optischen Antwortbereich treten Membrandepolarisationen, die neuronale Aktivität anzeigen, als gelb bis rot auf. Diese Daten zeigen, dass die stimulationsbedingte Aktivität in diskreten Bereichen jedes Ganglions auftritt, hauptsächlich vermittelt durch vorbeilaufende Axone. Die ROI zwei, drei und vier identifizieren einzelne Neuronen in verschiedenen Entfernungen zur ROI eins.

Abbildung zwei zeigt bei 10-facher Vergrößerung die anatomischen Bahnen, entlang derer sich Informationen ausbreiten können; die Pfeile deuten die Richtung an, in der der Reiz den identifizierten myenterischen Ganglion aktiviert. Wir haben Ihnen soeben die Bestandteile einer optischen Versuchsanordnung zur Aufzeichnung elektrischer Aktivität mit spannungsabhängigen Farbstoffen gezeigt und wie diese Technologie, angewandt auf das enterische Nervensystem, die Möglichkeit eröffnet, die funktionelle Konnektivität innerhalb und zwischen zwei intakten, säugetierischen Netzwerken im Mikroskopfeld zu untersuchen. Bei Verwendung der optischen Ableitungstechnologie ist äußerste Sorgfalt im Detail von größter Bedeutung.

Störquellen, optische, mechanische und elektrische, müssen sorgfältig kontrolliert werden, und die Gesundheit des Präparats muss gewissenhaft erhalten bleiben. Daher ist die Beherrschung aller einzelnen Schritte dieses Protokolls entscheidend, um bei der optischen Aufzeichnung erfolgreich zu sein. Das war's also.

Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.