Name: Denaturierende Gradienten-Gelelektrophorese (DGGE) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-02-25T00:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 52 s
Description: Lernen Sie die Denaturierende Gradienten-Gelelektrophorese (DGGE) zur Analyse bakterieller Gemeinschaften in Biofilmen. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von 16S rRNA-Sequenzen zur Erforschung mikrobieller Dynamiken.

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denaturierende gradienten-gelelektrophorese (dgge)

Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE)

Denaturierende Gradienten-Gelelektrophorese (DGGE)

Okay. Hallo, mein Name ist Celeste Peterson und ich bin wissenschaftliche Mitarbeiterin an der Harvard University, wo ich mikrobielle Biofilm-Gemeinschaften erforsche. Ich charakterisiere die bakteriellen Gemeinschaften, indem ich ihre 16S-NrRNA-Sequenz analysiere und untersuche, wie sich diese Sequenz im Verlauf der Zeit und im Raum verändert. Dazu verwende ich die DDGE.Dies ist kein normaler Acryl meines Wells; er muss während des Betriebs bei 60 Grad gehalten werden, und der Puffer muss kontinuierlich durchgepumpt werden. Daher werden wir den Puffer etwa eine Stunde lang erwärmen, bis er 60 Grad erreicht hat, und anschließend können wir den Towel laufen lassen. Jetzt werde ich diese Platte mit verdünnter uc-Lösung waschen, um Verunreinigungen zu entfernen, und dann einschalten.So etwas kann Regelmäßigkeiten verursachen. Es ist wichtig, das gesamte Wasser abzuwischen. Wenn ich das Gel zusammenbaue, werde ich diesen Chip auf der Außenseite des Gels anbringen.Das Gel befindet sich also zwischen diesen beiden Glasscheiben, und der Chip wird außen liegen und das Gel dazwischen nicht beeinflussen. Nun werde ich das Gel in diesen Klammern zusammenbauen und sie dann zusammendrücken, indem ich sie nach rechts drehend festziehe. Wie bei jedem Gel ist es wichtig sicherzustellen, dass die Unterseite bündig abschließt.Um ein Erzeugen von Luftblasen zu vermeiden, drehen wir das Gel nun um und setzen es hier ein, um es mit der Dichtung abzudichten. Es ist daher wichtig, dass beim Einsetzen die Platten genau mit der Dichtung hier ausgerichtet sind. Die seitlichen Vorsprünge greifen dann ein, und Sie drücken nach unten, um die Dichtung zu schließen.Das ist also eine 30-Mil-Spritze. Dieser Teil und dieser Teil gehören zur Bio-Rot-Box und werden einfach so daraufgesteckt. Das dient lediglich dazu, überschüssiges Wasser aus den Röhrchen zu entfernen.Bringen Sie daher das Schlauchstück auf dem Gel an, um das Gel zu beladen. Zuerst setzen Sie einen Adapter in den Schlauch ein und dann eine Nadel mit diesem kleinen Adapter, die genau in die Mitte des Gels eingeführt wird, sodass sie etwas unterhalb der unteren Glasplatte liegt. Anschließend wird dieser Drahtadapter in das lange Schlauchstück eingesteckt, das mit zwei gleichen Spritzen verbunden ist, die die Lösung mit hoher bzw. niedriger Dichte enthalten.Das sind also vorgefertigte Lösungen. Bei der blauen habe ich einen Farbstoff hinzugefügt, der lediglich anzeigt, dass dies die stark denaturierende Lösung ist, und dies die am wenigsten dichte, also die schwach dichte Lösung. Beide enthalten alle erforderlichen Bestandteile.Und jetzt werde ich eine doppelt so große Menge wie in der vorherigen Woche herstellen. Sobald das Gemisch anfängt zu gelieren, haben Sie etwa fünf bis sieben Minuten Zeit, um das Gel einzufüllen, bevor es steigt. Nun füllen wir die Spritze mit der Lösung.Ich werde es mit etwa 15 der Lösung füllen. Um eventuelle Luftblasen zu entfernen, drehe ich es um und drücke vorsichtig, bis die obere Luftblase verschwunden ist. Diese kleine Schraube hier wird nun in diese Nut eingesetzt.Dieser Adapter wird mit dieser Klammer hier ausgerichtet und anschließend fest mit einem C-Clamp verschlossen. Danach wird dieser Schlauch an die Spritze angeschlossen. Dasselbe wird auf der anderen Seite mit der Hochdichtematrix durchgeführt, wenn es Zeit zum Abgeben ist.Ich werde nun dieses Rad gleichmäßig im Uhrzeigersinn drehen. Zuerst wird die blaue Lösung austreten, da sie am dichtesten ist, und sie wird den unteren Teil des Gels bilden. Danach wird nach einer Weile die klare Lösung beginnen, das Gel aufzufüllen, und so wird der Gradient gebildet.Ein Moment – gießen Sie vorsichtig unter einem Winkel ab, und sobald Sie das Gel eingegossen haben, spülen Sie die Röhrchen sofort aus, da sie sonst polymerisieren. Gehen Sie jetzt zur Gruppe dort drüben. Und dann drücken Sie nach unten. Also dieses kleine hier – und auf der anderen Seite mache ich dasselbe. Okay.Hallo, mein Name ist Celeste Peterson und ich bin wissenschaftliche Mitarbeiterin an der Harvard University, wo ich mikrobielle Bio-Gemeinschaften untersuche. Ich charakterisiere die bakteriellen Gemeinschaften, indem ich ihre 60 F-Sequenz analysiere und untersuche, wie sich die Sequenz im Verlauf der Zeit und im Raum verändert. Dazu verwende ich DDGE.Die DGE ist die Denaturierende Gelelektrophorese. Grundlegend besteht die Idee darin, dass ein Gradient vorhanden ist und die DNA, während sie durch den Gradienten läuft, denaturiert wird. Unterschiedliche 16S-Arten halten daher an verschiedenen Stellen entlang des Gradienten an.Und so ergibt sich letztlich ein Fingerabdruck der verschiedenen Sexiness-Arten in der Gemeinschaft. Das Ziel meines Experiments besteht also darin, herauszufinden, welche Arten in der Gemeinschaft vorhanden sind, und wie sich dies im Laufe von Zeit und Raum verändert. Ich kann dann das Sexiness-DDD-Gel laufen lassen, die Banden ausschneiden und die Arten identifizieren, die in jeder Gemeinschaft vertreten sind.Ein zentrales Problem bei der Durchführung eines A-DDG-Gels besteht darin, den optimalen Gradienten zu ermitteln. Dies erfordert experimentelle Anpassungen, um für eine bestimmte Probengemeinschaft den geeigneten Gradiententyp zu bestimmen. Der heute von mir verwendete Gradient liegt zwischen 35 und 55 % Harnstoff.Eines der großen Probleme, die bei dieser Technik auftreten können, ist, dass Verschmierungen in den Schrägen auftreten. Und ich habe herausgefunden, dass – aus welchem Grund auch immer – eine der besten Maßnahmen darin besteht, die Gele sehr lange laufen zu lassen, wodurch die Verschmierungen verschwinden. Heute verwende ich die Methode lediglich für allgemeine bakterielle Gemeinschaften, sie kann jedoch auch für eine spezifische Bakterienfamilie eingesetzt werden, um deren Veränderungen über die Zeit zu beobachten, und diese Gele sind in der Regel sehr sauber.Sie können auch Mutationen in einzelnen Genen mit DDGE untersuchen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Denaturierung Harnstoff-Polyacrylamid-Gelelektrophorese wird verwendet, um Einzelstrang-DNA oder RNA getrennt bis zu einer Grenze von 500 Nukleotiden. Urea in Kombination mit Hitze denaturiert Proben und unstrukturierte Einzelstränge in der Gel-Matrix migrieren nach ihrem Molekulargewicht.

Denaturierung Urea Polyacrylamidgelelektrophorese (Urea PAGE)

Ein Basis-Protokoll für die Trennung von DNA-Fragmenten unter Verwendung von Agarosegel-Elektrophorese beschrieben.

Agarosegel-Elektrophorese für die Trennung von DNA-Fragmenten

Dieses Video demonstriert die auf zweidimensionalen halbdenaturierenden Agarosegelelektrophoresen basierende Trennung von Amyloidfasern. Die Technik trennt die polymorphen Amyloid-Aggregate anhand ihrer heterogenen Größe.

Zweidimensionale semi-denaturierende Agarose-Gelelektrophorese: Eine Technik zur Trennung polymorpher Amyloidfasern basierend auf Größenheterogenität

In diesem Video demonstrieren wir eine zweidimensionale Gelelektrophorese-Methode, die einzelne Proteine aus einer komplexen Proteinmischung trennt, die aus Tumorgeweben des humanen nichtfunktionellen Hypophysenadenoms (NFPA) gewonnen wurde. Die Proteine werden in der ersten Dimension anhand ihrer elektrischen Ladung und in der zweiten Dimension anhand von Molekulargewichten weiter getrennt.

Zweidimensionale Polyacrylamid-Gelelektrophorese: eine Trenntechnik zur Analyse von Proteinen in komplexen Proteingemischen basierend auf Ladung und Molekulargewicht

Der schnelle Nachweis und die zuverlässige Quantifizierung von RNA-Editing-Ereignissen auf genomischer Ebene bleiben eine Herausforderung und basieren derzeit auf direkten RNA-Sequenzierungsmethoden. Das hier beschriebene Protokoll verwendet die Mikrotemperaturgradientengelelektrophorese (μTGGE) als einfache, schnelle und tragbare Methode zum Nachweis der RNA-Bearbeitung.

Ein Nonsequencing-Ansatz für den schnellen Nachweis der RNA-Editierung

Dieses Video zeigt das Protokoll eines in-vitro-Angiogenese-Assay, rekapituliert mehrere Stufen der Angiogenese. Zeitraffer-Bilder von Keimen, Lumenbildung, Verzweigung und Anastomose - die wichtigsten Merkmale der Angiogenese - gezeigt werden.

Optimierte Fibringel Bead Assay für das Studium der Angiogenese

Wir beschreiben ein Protokoll für die Mikrofabrikation der Gradienten-erzeugenden Mikrofluidik-Gerät, das räumliche und zeitliche Verläufe in klar definierten Mikroumgebung erzeugen können. Bei diesem Ansatz kann der Gradient-Erzeugung mikrofluidischen Gerät verwendet, um gerichtete Wanderung, Embryogenese, Wundheilung und Krebs Metastasen zu untersuchen.

Ein Gradient-Erzeugung Mikrofluidikvorrichtung für Zellbiologie

Wir zeigen, dass die Überexpression des epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptoren (EGFR) die Beweglichkeit der neuralen Stammzellen (NSCs) unter Verwendung eines neuartigen Agarosegel basierten mikrofluidischen Gerät verbessert. Diese Technologie kann ohne weiteres auf andere Säugetierzellen Systeme, bei denen Zellen Quellen sind rar, wie menschliche neurale Stammzellen, und die Umdrehung um Zeit ist von entscheidender Bedeutung.

Die Beurteilung Neural Stem Cell Motilität Mit einem Agarosegel-basierte Mikrofluidikvorrichtung

SDD-AGE ist eine nützliche Technik für die Erkennung und Charakterisierung von Amyloid-ähnlichen Polymeren in den Zellen. Hier zeigen wir eine Anpassung, dass diese Technik zugänglich großflächige Anwendungen macht.

Screening für Amyloid-Aggregation durch Semi-denaturierenden Detergens-Agarose-Gel-Elektrophorese

Wir beschreiben ein Verfahren zur Gewinnung von hohem Molekulargewicht von genomischer DNA aus planktonischen Biomasse auf 0,22 um Sterivex Filter, durch Cäsiumchlorid-Dichtegradientenzentrifugation zur Reinigung folgte konzentriert.

DNA-Extraktion von 0,22 pM Sterivex Filter und Cäsiumchlorid-Dichtegradientenzentrifugation

Lernen Sie die Denaturierende Gradienten-Gelelektrophorese (DGGE) zur Analyse bakterieller Gemeinschaften in Biofilmen. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von 16S rRNA-Sequenzen zur Erforschung mikrobieller Dynamiken.

Denaturierende Gradienten-Gelelektrophorese (DGGE)

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