Denaturierende Gradienten-Gelelektrophorese (DGGE)

Okay. Hallo, mein Name ist Celeste Peterson und ich bin wissenschaftliche Mitarbeiterin an der Harvard University, wo ich mikrobielle Biofilm-Gemeinschaften erforsche. Ich charakterisiere die bakteriellen Gemeinschaften, indem ich ihre 16S-NrRNA-Sequenz analysiere und untersuche, wie sich diese Sequenz im Verlauf der Zeit und im Raum verändert. Dazu verwende ich die DDGE.

Dies ist kein normaler Acryl meines Wells; er muss während des Betriebs bei 60 Grad gehalten werden, und der Puffer muss kontinuierlich durchgepumpt werden. Daher werden wir den Puffer etwa eine Stunde lang erwärmen, bis er 60 Grad erreicht hat, und anschließend können wir den Towel laufen lassen. Jetzt werde ich diese Platte mit verdünnter uc-Lösung waschen, um Verunreinigungen zu entfernen, und dann einschalten.

So etwas kann Regelmäßigkeiten verursachen. Es ist wichtig, das gesamte Wasser abzuwischen. Wenn ich das Gel zusammenbaue, werde ich diesen Chip auf der Außenseite des Gels anbringen.

Das Gel befindet sich also zwischen diesen beiden Glasscheiben, und der Chip wird außen liegen und das Gel dazwischen nicht beeinflussen. Nun werde ich das Gel in diesen Klammern zusammenbauen und sie dann zusammendrücken, indem ich sie nach rechts drehend festziehe. Wie bei jedem Gel ist es wichtig sicherzustellen, dass die Unterseite bündig abschließt.

Um ein Erzeugen von Luftblasen zu vermeiden, drehen wir das Gel nun um und setzen es hier ein, um es mit der Dichtung abzudichten. Es ist daher wichtig, dass beim Einsetzen die Platten genau mit der Dichtung hier ausgerichtet sind. Die seitlichen Vorsprünge greifen dann ein, und Sie drücken nach unten, um die Dichtung zu schließen.

Das ist also eine 30-Mil-Spritze. Dieser Teil und dieser Teil gehören zur Bio-Rot-Box und werden einfach so daraufgesteckt. Das dient lediglich dazu, überschüssiges Wasser aus den Röhrchen zu entfernen.

Bringen Sie daher das Schlauchstück auf dem Gel an, um das Gel zu beladen. Zuerst setzen Sie einen Adapter in den Schlauch ein und dann eine Nadel mit diesem kleinen Adapter, die genau in die Mitte des Gels eingeführt wird, sodass sie etwas unterhalb der unteren Glasplatte liegt. Anschließend wird dieser Drahtadapter in das lange Schlauchstück eingesteckt, das mit zwei gleichen Spritzen verbunden ist, die die Lösung mit hoher bzw. niedriger Dichte enthalten.

Das sind also vorgefertigte Lösungen. Bei der blauen habe ich einen Farbstoff hinzugefügt, der lediglich anzeigt, dass dies die stark denaturierende Lösung ist, und dies die am wenigsten dichte, also die schwach dichte Lösung. Beide enthalten alle erforderlichen Bestandteile.

Und jetzt werde ich eine doppelt so große Menge wie in der vorherigen Woche herstellen. Sobald das Gemisch anfängt zu gelieren, haben Sie etwa fünf bis sieben Minuten Zeit, um das Gel einzufüllen, bevor es steigt. Nun füllen wir die Spritze mit der Lösung.

Ich werde es mit etwa 15 der Lösung füllen. Um eventuelle Luftblasen zu entfernen, drehe ich es um und drücke vorsichtig, bis die obere Luftblase verschwunden ist. Diese kleine Schraube hier wird nun in diese Nut eingesetzt.

Dieser Adapter wird mit dieser Klammer hier ausgerichtet und anschließend fest mit einem C-Clamp verschlossen. Danach wird dieser Schlauch an die Spritze angeschlossen. Dasselbe wird auf der anderen Seite mit der Hochdichtematrix durchgeführt, wenn es Zeit zum Abgeben ist.

Ich werde nun dieses Rad gleichmäßig im Uhrzeigersinn drehen. Zuerst wird die blaue Lösung austreten, da sie am dichtesten ist, und sie wird den unteren Teil des Gels bilden. Danach wird nach einer Weile die klare Lösung beginnen, das Gel aufzufüllen, und so wird der Gradient gebildet.

Ein Moment – gießen Sie vorsichtig unter einem Winkel ab, und sobald Sie das Gel eingegossen haben, spülen Sie die Röhrchen sofort aus, da sie sonst polymerisieren. Gehen Sie jetzt zur Gruppe dort drüben. Und dann drücken Sie nach unten. Also dieses kleine hier – und auf der anderen Seite mache ich dasselbe. Okay.

Hallo, mein Name ist Celeste Peterson und ich bin wissenschaftliche Mitarbeiterin an der Harvard University, wo ich mikrobielle Bio-Gemeinschaften untersuche. Ich charakterisiere die bakteriellen Gemeinschaften, indem ich ihre 60 F-Sequenz analysiere und untersuche, wie sich die Sequenz im Verlauf der Zeit und im Raum verändert. Dazu verwende ich DDGE.

Die DGE ist die Denaturierende Gelelektrophorese. Grundlegend besteht die Idee darin, dass ein Gradient vorhanden ist und die DNA, während sie durch den Gradienten läuft, denaturiert wird. Unterschiedliche 16S-Arten halten daher an verschiedenen Stellen entlang des Gradienten an.

Und so ergibt sich letztlich ein Fingerabdruck der verschiedenen Sexiness-Arten in der Gemeinschaft. Das Ziel meines Experiments besteht also darin, herauszufinden, welche Arten in der Gemeinschaft vorhanden sind, und wie sich dies im Laufe von Zeit und Raum verändert. Ich kann dann das Sexiness-DDD-Gel laufen lassen, die Banden ausschneiden und die Arten identifizieren, die in jeder Gemeinschaft vertreten sind.

Ein zentrales Problem bei der Durchführung eines A-DDG-Gels besteht darin, den optimalen Gradienten zu ermitteln. Dies erfordert experimentelle Anpassungen, um für eine bestimmte Probengemeinschaft den geeigneten Gradiententyp zu bestimmen. Der heute von mir verwendete Gradient liegt zwischen 35 und 55 % Harnstoff.

Eines der großen Probleme, die bei dieser Technik auftreten können, ist, dass Verschmierungen in den Schrägen auftreten. Und ich habe herausgefunden, dass – aus welchem Grund auch immer – eine der besten Maßnahmen darin besteht, die Gele sehr lange laufen zu lassen, wodurch die Verschmierungen verschwinden. Heute verwende ich die Methode lediglich für allgemeine bakterielle Gemeinschaften, sie kann jedoch auch für eine spezifische Bakterienfamilie eingesetzt werden, um deren Veränderungen über die Zeit zu beobachten, und diese Gele sind in der Regel sehr sauber.

Sie können auch Mutationen in einzelnen Genen mit DDGE untersuchen.