Name: Retro-Orbital-Injection in Adult Zebrafisch (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-12-07T18:43:00.000+00:00
Duration: 4 min 50 s
Description: Lernen Sie die retro-orbitale Injektion bei adulten Zebrafischen für hämatopoietische Stammzelltransplantationen. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Blutzell-Dynamiken in vivo.

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Diese Arbeit wird von Howard Hughes Medical Institute und einen Zuschuss von der NIH für das Studium der embryonalen Blutbildung unterstützt.

Teil 1. Vorbereitung von Injektionsmaterial <ol><li> Tg (Globin: GFP)-Zellen: </li><li> Bleed erwachsenen Spenders Fisch mit 10ul Pipettenspitze in Heparin (1unit/ul) zu punktieren Fisch hinter gill beschichtet. </li><li> Absaugen roten Blutkörperchen und verzichten in der Zelle Puffer (0.9X PBS + 5% FBS + 1% Pen / Strep). </li><li> Filter Zellsuspension über 40um Mesh und bestimmen Konzentration von Zellen mit Hämozytometer wie zuvor von LeBlanc et al. </li><li> Spin nach unten und resuspendieren in Zell-Puffer bei gewünschten Konzentration, so dass endgültige Injektionsvolumen nicht mehr als 5UL. Hier injizieren wir 1,5 bis 2.000.000 Zellen / Empfänger. </li><li> Für die Dextran, Texas Red ®, löst den Farbstoff in DPBS für einen letzten Injektion Konzentration von 10-12 mg / mL. Planen bis 4 uL pro Fisch zu injizieren. </li></ol> Part 2. Injektion <ol><li> Anesthetize Fisch in Tricaine (4.2ml (4mg/ml) tricaine/100ml Fisch Wasser). </li><li> Wash Hamilton-Spritze 3-4 mal vor der Injektion mit 70% Ethanol. Spülen Sie 3-4 mal mit 0.9X DPBS. </li><li> Legen Sie den Fisch Rückenseite nach oben und nach rechts auf feuchten Schwamm entfernen. </li><li> Halten Sie die Hamilton-Spritze mit der rechten Hand und mit dem Zeigefinger auf den Kolben. Gently stabilisieren den Körper des Fisches mit der linken Hand. </li><li> Positionieren Sie die Nadel mit der Fase nach oben, so dass, wenn die Fische s Auge waren eine Uhr, die Nadel am 07.00 Position und in einem 45 Grad Winkel zum Fisch (Abb. 1) zeigt. </li><li> Schieben Sie Nadel 1-2 mm in 7.00 Position und langsam drücken Sie den Kolben. </li><li> Lassen Sie die Fische in frischen E3 Wasser erholen. </li><li> Wash Nadel, wie oben, zwischen den Injektionen von verschiedenen Reagenzien beschrieben. </li><li> Flick Zelle Lösung für die Zellen alle paar Minuten zu Zelle Verklumpen zu verhindern. </li><li> Keep Fisch off flow für 1 Woche mit täglichen Wasserwechsel um Infektionen zu vermeiden. Wir halten Fisch im Wasser ICU für diesen Zeitraum (10 mL Stress-Mantel + 5 ml pemafix + 5 ml melafix pro 38 Liter Wasser E3). </li></ol> Teil 3. Repräsentative Ergebnisse Wenn richtig ausgeführt, ist es möglich, injizierten Materials sichtbar, wenn sie in irgendeiner Weise gekennzeichnet. Zum Beispiel, Tg (Globin: GFP) sollten roten Blutkörperchen unter einem Fluoreszenz-Dissektionsmikroskop Umlauf in das Gefäßsystem des Empfängers casper Fisch kurz nach der Injektion, wie in Abbildung 2 ersichtlich. Ebenso kann die Injektion eines 70 kDa Dextran, konjugiert mit Texas Red ® visualisiert werden in das Gefäßsystem des durchsichtiger Fisch unmittelbar nach retroorbitalen Injektion (Abbildung 3). Fluorescent Nierenzellen von Tg (β-Aktin: GFP) Spender Fisch kann auch retroorbital in bestrahlte casper Empfänger Fisch injiziert werden. Diese Zellen werden schließlich zu Hause an den Empfänger Knochenmark (Abb. 4a) und kann dann weiter auf die Niere nach einigen Wochen (Bild 4b) neu zu besiedeln. Wenn die Injektion zu flach ist oder der Winkel der Nadel umgeht die retro-orbitalen venösen Kieferhöhle kann injizierten Materials sichtbar gemacht werden Pooling um das Auge oder fließenden aus ihm heraus. Alternativ, wenn die Injektion zu tief ist, kann Fische Erfahrung Gewebeschädigung oder starke Blutungen, obwohl sie vielleicht noch erholen. Wenn richtig ausgeführt, sollte die Mortalität nach retroorbitalen Injektion weniger als 5% der gesamten injizierten Fischen und den Erfolg der Auslieferung an den Blutkreislauf sollte größer als 90% der gesamten injizierten Fische. <img src="/files/ftp_upload/1645/1645fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1: Illustration des retro-orbitalen Injektionstechnik. Das rechte Auge des Fisches wird als eine analoge Uhr, in der die 07 Uhr-Position entspricht der richtigen Injektionstechnik vor Ort vertreten. <img src="/files/ftp_upload/1645/1645fig2.jpg" alt="Abbildung 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2: Tg (Globin: GFP) roten Blutkörperchen, die in der Gefäßversorgung des Schwanzes eines Erwachsenen casper Fisches drei Tage nach retroorbitalen Injektion. <img src="/files/ftp_upload/1645/1645fig3.jpg" alt="Abbildung 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 3"> Abbildung 3: Erfolgreiche Injektion eines 70 kDa Dextran konjugiert Texas Red ® als Farbstoff produziert fluoreszierende Gefäßsystem in das transparente erwachsenen Fischen, casper und ist leicht mit Standard angesehen ganze Tier Fluoreszenzmikroskopie eingesetzt. <img src="/files/ftp_upload/1645/1645fig4a.jpg" alt="Abbildung 4A" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Bild 4a"> Abbildung 4a: Drei Tage nach der retro-orbitalen Injektion gesamte Niere Knochenmarkzellen von Tg (β-Aktin: GFP) Spender Fische, die Zellen visualisiert werden können Homing der Niere Knochenmark der bestrahlten erwachsenen casper Empfänger Fisch. <img src="/files/ftp_upload/1645/1645fig4b.jpg" alt="Abbildung 4b" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Bild 4b"> Abbildung4b: Vier Wochen nach der retro-orbitalen Injektion gesamte Niere Knochenmarkzellen von Tg (β-Aktin: GFP) Spender Fisch, der Wiederbesiedlung des Empfängers Niere mit grünen Spender gesamte Niere Knochenmarkzellen werden in bestrahlten erwachsenen casper Empfänger Fisch visualisiert.

<ol><li>Steel, C. D., Stephens, A. L., Hahto, S. M., Singletary, S. J., Ciavarra, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+lateral+tail+vein+and+the+retro-orbital+venous+sinus+as+route+of+intravenous+drug+delivery+in+a+transgenic+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Animal%22%5BJournal%5D)">Comparison of the lateral tail vein and the retro-orbital venous sinus as route of intravenous drug delivery in a transgenic mouse model.</a> Lab Animal. 37, 26-32 (2008).</li>
<li>Pinkerton, W., Webber, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+of+injecting+small+laboratory+animals+by+the+ophthalmic+plexus+route%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Soc.+Exp.+Bio.+Med%22%5BJournal%5D)">A method of injecting small laboratory animals by the ophthalmic plexus route.</a> Proc. Soc. Exp. Bio. Med. 116, 959-961 (1964).</li>
<li>White, R. M., Sessa, A. S., Burke, C., Bowman, T., LeBlanc, J., Ceol, C., Bourque, C., Dovey, M., Goessling, W., Burns, C. E., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transparent+adult+zebrafish+as+a+tool+for+in+vivo+transplantation+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis.</a> Cell Stem Cell. 2, 183-189 (2008).</li>
<li>LeBlanc, J., Bowman, T. V., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+whole+kidney+marrow+in+adult+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Transplantation of whole kidney marrow in adult zebrafish.</a> J. Vis. Exp. , (2007).</li>
</ol>

Retro-Orbital-Injektion bei erwachsenen Zebrafisch gibt die höchste Effizienz der Lieferung von injizierten Materials in die Blutbahn mit der niedrigsten Inzidenz der Mortalität. Aufgrund der Art der Einspritzung, taucht der Einstichstelle, schnell zu heilen, sinkende das Auftreten von Infektionen und Menge des Blutverlustes. Die Website kann auch wiederholt während einer kurzen Zeit für die tägliche Injektionen von Drogen injiziert werden, zum Beispiel. Große Mengen von Drogen ist für die t...

<table><tbody><tr><td>Heparin-Natriumsalz aus Schweinedarmmukosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>2106</td><td>Vorgewogene Durchstechflasche mit 300 USP-Einheiten</td></tr><tr><td>Tricain-S</td><td>Western Chemical</td><td></td><td>MS-222</td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;phosphatgepufferte Kochsalzlösung</td><td>Invitrogen</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Dextran, Texas Rot&amp;#174;</td><td>Molecular Probes, Life Technologies</td><td>D1830</td><td></td></tr><tr><td>E3</td><td></td><td></td><td>5 mM NaCl&lt;br/&gt;0,17 mM KCl&lt;br/&gt;0,33 mM CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&lt;br/&gt;0,33 mM MgSO₄&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>Mikroliterspritze</td><td>Hamilton Co</td><td>80300</td><td>701N 10 µL Spritze (26S/2&amp;#8221;/2)</td></tr></tbody></table>

retro-orbital-injection in adult zebrafisch

Retro-orbital Injection in Adult Zebrafish

Die medikamentöse Behandlung von ganzen Tieren ist ein wichtiges Instrument in jedem Modell für pharmakologische und chemische genetische Studien. Die intravenöse (iv) Injektion ist oft das wirksamste und nicht-invasive Form der Lieferung eines Agenten von Interesse. In der Zebrafisch (<em&gt; Danio rerio</em&gt;) Hat iv Injektion von Medikamenten lange eine Herausforderung, weil der kleine Gefäßdurchmesser worden. Dies hat auch eine wesentliche Hürde für die Injektion von Zellen während der hämatopoetischen Stammzelltransplantation unter Beweis gestellt. In der Vergangenheit wurden Injektionen in die Blutbahn direkt durch das Herz getan. Allerdings hat diese intrakardiale Verfahren eine sehr hohe Sterblichkeitsrate als das Herz ist oft während der Injektion verlassen die Fische anfälliger für Infektionen, massive Blutverlust oder tödliche Organschäden punktiert. Aufbauend auf unserer Erfahrung mit der Maus, haben wir ein neues Injektionsverfahren im Zebrafisch, in denen der Injektionsstelle ist hinter dem Auge und in den retro-orbitalen venösen Sinus entwickelt. Dieses Retro-Orbital (RO) Injektionstechnik wurde erfolgreich sowohl in der Injektion von Medikamenten in der erwachsenen Fische sowie die Transplantation von Knochenmarkzellen gesamte Niere beschäftigt. RO Injektion hat eine viel geringere Sterblichkeit als bei herkömmlichen intrakardiale Injektion. Fische, die retroorbital injiziert werden tendenziell weniger nach der Injektion bluten und sind auf einem viel niedrigeren Risiko von Verletzungen zu einem wichtigen Organ wie das Herz. Ferner wird, wenn richtig durchgeführt, injizierten Zellen und / oder Drogen schnell in die Blutbahn ermöglicht Verbindungen auf ihre Wirkung auf den gesamten Fisch-und Nierenzellen ausüben zu Hause einfach an ihre Nische. So minimiert die neue Injektionstechnik Sterblichkeit und ermöglicht effiziente Bereitstellung von Material in die Blutbahn des erwachsenen Fischen. Hier haben wir beispielhaft für diese Technik durch retro-orbitale Injektion von Tg (<em&gt; Globin</em&gt;: GFP)-Zellen in das Erwachsenenleben<em&gt; Casper</em&gt; Fisch sowie Injektion von einem roten Fluoreszenzfarbstoff (Dextran, Texas Red<em&gt;</em&gt;) In das Erwachsenenleben<em&gt; Casper</em&gt; Fisch. Wir haben dann visualisieren erfolgreichen Injektionen von ganzen Tier Fluoreszenzmikroskopie.

Hier zeigen wir, wie retro-orbitalen Injektion bei erwachsenen Zebrafisch zu tun.

Retro-Orbital-Injection in Adult Zebrafisch

Die medikamentöse Behandlung ganzer Tiere ist ein unverzichtbares Instrument in jedem Modellsystem für pharmakologische und chemisch-genetische Studien. Die intravenöse (IV) Injektion ist ...

Spender-Rote Blutkörperchen werden zunächst aus transgenen Globin-GFP-Fischen gewonnen, indem das Herz des Spender-Tieres punktiert und die roten Blutkörperchen aspiriert werden. Nach der Vorbereitung der Zellen zur Injektion werden Empfängerfische retroorbital injiziert und anschließend mittels standardmäßiger Fluoreszenzmikroskopie am gesamten Organismus auf eine erfolgreiche Injektion der fluoreszenzmarkierten Zellen untersucht. Ebenso wird ein gefärbtes Dextrin, konjugiert mit Texas Rot, hergestellt und retroorbital injiziert, und das injizierte Tier wird auf eine erfolgreiche Injektion bildlich dokumentiert.Hallo, ich bin Emily Atch aus dem Labor von Leonard Zan in der Abteilung für Hämatologie und Onkologie am Kinderkrankenhaus Boston. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur retroorbitalen Injektion bei adulten Zebrabärblingen. In unserem Labor verwenden wir dieses Verfahren, um die Transplantation hämatopoetischer Stammzellen zu untersuchen.Beginnen wir nun. Wir werden retroorbitale Injektionen von transgenen Globin-GFP-Zellen und eines roten fluoreszierenden Farbstoffs, Dextrin, das mit Texas Red konjugiert ist, in adulte Casper-Fische demonstrieren – eine transparente Zebrafischart, um transgene Globin-GFP-Zellen vorzubereiten. Dazu entnehmen wir Blutzellen von adulten Spenderfischen mithilfe einer 10-Mikroliter-Pipettenspitze, die mit Heparin beschichtet ist, indem wir hinter den Kiemen des Fisches punktieren, rote Blutkörperchen aspirieren und diese in ein Zellpuffer abgeben.Als Nächstes filtrieren Sie die Zellsuspension über ein 40-Mikrometer-Sieb. Nach der Bestimmung der Zellkonzentration mithilfe eines Hämozytometers, wie zuvor von LeBlanc et al. beschrieben, zentrifugieren Sie die Zellen bei 1500 U/min für fünf Minuten. Resuspendieren Sie die Zellen erneut in Zellpuffer bei einer gewünschten Konzentration, sodass das endgültige Injektionsvolumen nicht mehr als fünf Mikroliter beträgt.In dieser Demonstration injizieren wir 1,5 bis 2 Millionen Zellen pro Empfänger, um den roten fluoreszierenden Farbstoff vorzubereiten, und lösen ihn in DPBS für eine endgültige Injektionskonzentration von 10 bis 12 Milligramm pro Milliliter auf. Wir injizieren vier Mikroliter pro Fisch, da das Injektionsverfahren identisch ist. Unabhängig vom injizierten Material demonstrieren wir lediglich die Injektion des roten fluoreszierenden Farbstoffs.Bevor die Fische injiziert werden, die Hamilton-Spritze drei bis vier Mal mit 70 %igem Ethanol ausspülen. Drei- bis viermal mit 0,9-facher XDPS spülen. Nachdem die Fische in Trica anästhesiert wurden, legen Sie die Fische mit der dorsalen Seite nach oben und nach rechts gerichtet auf einen feuchten Schwamm.Halten Sie die geladene Hamilton-Spritze mit der rechten Hand und stabilisieren Sie mit der linken Hand vorsichtig den Fischkörper mit dem Zeigefinger. Positionieren Sie die Nadel mit der Schräge nach oben, sodass die Nadel, wenn das Auge des Fisches einer Uhr entspricht, auf die Position sieben Uhr zeigt. Führen Sie die Nadel unter einem Winkel von 45 Grad zum Fisch vorsichtig ein bis zwei Millimeter in die Position sieben Uhr ein und drücken Sie langsam den Kolben herunter.Lassen Sie die Fische in frischem E3-Wasser auskurieren. Halten Sie die Fische eine Woche lang außerhalb des Fließsystems mit täglichen Wasserwechseln, um Infektionen zu vermeiden; wir halten die Fische während dieses Zeitraums in ICU-Wasser. Wenn retroorbitale Injektionen korrekt durchgeführt werden, ist es möglich, markiertes injiziertes Material zu visualisieren.Beispielsweise können transgene Globin-GFP-Erythrozyten unter einem fluoreszenzmikroskopischen Stereomikroskop drei Tage nach der Injektion im Gefäßsystem des Schwanzes eines erwachsenen Empfängerfisches vom Typ Casper zirkulieren gesehen werden; ebenso führt die erfolgreiche Injektion eines mit Texas-rot konjugierten 70-Kilodalton-Dextrins unmittelbar zur fluoreszierenden Darstellung des Gefäßsystems. Bei dem transparenten erwachsenen Casper-Fisch, der leicht mittels standardmäßiger Fluoreszenzmikroskopie am gesamten Organismus sichtbar gemacht werden kann, lassen sich ebenfalls fluoreszierende Nierenmarkzellen aus transgenen Donorfischen mit beta-Aktin-GFP rückwärts oral in einen bestrahlten Casper-Empfängerfisch injizieren. Diese Zellen wandern schließlich, wie hier drei Tage nach der Injektion gezeigt, in das Mark des Empfängers ein; vier Wochen später können sich diese grünen Donorzellen weiterentwickeln und das Nierenmark des Empfängers neu besiedeln.Wir haben Ihnen gerade gezeigt, wie man retroorbitale Injektionen bei adulten Zebrafischen durchführt. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, mit der Nadel in einem Winkel von 45 Grad zur Ebene des Fisches zu injizieren. Das war's also.Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Wir zeigen, intraperitoneale Injektion in das Erwachsenenleben Zebrafisch. Wir verwenden eine 10 ul Nanofil Mikrospritze durch eine Micro4 Controller und UltraMicroPump III geregelt. Diese Demonstration umfasst den Einsatz von kaltem Wasser als Betäubungsmittel.

Intraperitoneale Injektion in Adult Zebrafisch

Eine Methode, bedingt Knockdown ein Zielprotein Ausdruck in der erwachsenen Zebrafisch Retina beschrieben, das geht intravitreal Injektion antisense Morpholinos und Elektroporation sie in der Netzhaut. Das resultierende Protein ist für mehrere Tage, die Prüfung des Proteins Rolle bei der Regeneration oder intakten Netzhaut ermöglicht klopfte.

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Wir stellen eine effiziente Methode zur retrograden Markierung von retinalen Ganglienzellen (RGCs) in adulten Zebrafischen vor.

Retrograde Markierung von retinalen Ganglienzellen im erwachsenen Zebrafisch mit Fluoreszenzfarbstoffen

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Diese Methode basiert auf der Injektion von 0,5 − 3 μL der Lösung in den Thorax von erwachsenen Zebrafischen. Das Verfahren liefert Proteine und chemische Verbindungen effizient in die Nähe des Zebrafisch-Herzens, ohne das Organ zu beschädigen. Der Ansatz eignet sich für die Untersuchung von Wirkungen exogener Faktoren auf verschiedene Gewebe des Herzens.

Intrathorakische Injektion für die Erforschung des erwachsenen Zebrafischherz

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Eine neue intraperitoneale (IP) Injektionsmethode bei adulten Zebrafischen wird beschrieben. Beim Umgang mit toxischen Verbindungen wie Doxorubicin ist dieses Verfahren wirksamer als die beiden bisher berichteten IP-Methoden. Die Technik ist so konzipiert, dass sie von Forschern mit begrenzter Erfahrung im Zebrafischmodell leicht übernommen werden kann.

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Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll für die automatisierte Implantation von Tumor-Xenotransplantaten in Zebrafischlarven mit Hilfe eines hochmodernen robotergestützten Injektionssystems vor. Darüber hinaus präsentieren wir Injektionsvideos und Validierungsdaten, die die erfolgreiche Leistung des Systems belegen.

Automatisierung der Tumorimplantation in Zebrafischlarven für Krebsforschung und Medizin

Die Transplantation von Whole Kidney Marrow in Adult Zebrafisch

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