Retro-Orbital-Injection in Adult Zebrafisch

Rote Blutkörperchen von Spendern werden zunächst aus transgenen Globin-GFP-Fischen entnommen, indem das Herz des Spendertieres punktiert und die roten Blutkörperchen aspiriert werden. Sobald die Zellen für die Injektion vorbereitet sind, werden die Empfängerfische retroorbital injiziert und später mit der Standard-Ganztier-Fluoreszenzmikroskopie abgebildet, um fluoreszenzmarkierte Zellen erfolgreich zu injizieren. In ähnlicher Weise wird ein farbiger Farbstoff Dextrin, der an Texas-Rot konjugiert ist, hergestellt und retroorbital injiziert, und das injizierte Tier wird für eine erfolgreiche Injektion abgebildet.

Hallo, ich bin Emily Atch vom Labor von Leonard Zan in der Abteilung für Hämatologie und Onkologie am Children's Hospital Boston. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur retroorbitalen Injektion bei erwachsenen Zebrafischen. Wir verwenden dieses Verfahren in unserem Labor, um die hämatopoetische Stammzelltransplantation zu untersuchen.

Also lasst uns loslegen. Wir werden die retroorbitalen Injektionen von transgenen Globin-GFP-Zellen und einem roten Fluoreszenzfarbstoff Dextrin, der an Texas-Rot konjugiert ist, in adulte Casper-Fische demonstrieren, eine transparente Rasse von Zebrafischen zur Herstellung von transgenem Lobin. GFP-Zellen bluten erwachsene Spenderfische, indem sie mit einer 10-Mikroliter-Pipettenspitze, die mit Heparin beschichtet ist, den Fisch hinter den Kiemen durchstechen, rote Blutkörperchen aspirieren und in einen Zellpuffer abgeben.

Als nächstes filtrieren Sie die Zellsuspension über ein Netz von 40 Mikrometern. Nach der Bestimmung der Konzentration der Zellen mit einem Hämozytometer, wie zuvor von LeBlanc beschrieben, verbringen Sie die Zellen fünf Minuten lang bei 1500 U/min. Reus suspendieren die Zellen in Zellpuffer in einer gewünschten Konzentration, so dass das endgültige Injektionsvolumen nicht mehr als fünf Mikroliter beträgt.

In dieser Demonstration werden wir 1,5 bis 2 Millionen Zellen pro Empfänger injizieren, um den roten Fluoreszenzfarbstoff herzustellen, und ihn in DPBS für eine endgültige Injektionskonzentration von 10 bis 12 Milligramm pro Milliliter auflösen. Wir werden vier Mikroliter pro Fisch injizieren, da das Injektionsverfahren das gleiche ist. Unabhängig vom injizierten Material werden wir nur die Injektion des roten Fluoreszenzfarbstoffs demonstrieren.

Waschen Sie die Hamilton-Spritze vor dem Injizieren des Fisches drei- bis viermal mit 70 % Ethanol. Drei- bis viermal mit 0,9 XDPS spülen. Nachdem Sie den Fisch in Trica betäubt haben, legen Sie den Fisch mit der Rückenseite nach oben und mit dem Gesicht nach rechts auf einen feuchten Schwamm.

Halten Sie die geladene Hamilton-Spritze mit der rechten Hand und halten Sie mit dem Zeigefinger auf dem Kolben fest, um mit der linken Hand den Körper des Fisches sanft zu stabilisieren. Positionieren Sie die Nadel mit der Fase nach oben, so dass die Nadel auf die Sieben-Uhr-Position zeigen würde, wenn das Auge des Fisches eine Uhr wäre. Und in einem 45-Grad-Winkel zum Fisch führen Sie die Nadel vorsichtig ein bis zwei Millimeter in die Sieben-Uhr-Position ein und drücken den Kolben langsam nieder.

Lassen Sie den Fisch sich in frischem Wasser E drei erholen. Halten Sie die Fische eine Woche lang mit täglichen Wasserwechseln vom Fluss fern, um Infektionen zu vermeiden, halten wir die Fische für diesen Zeitraum im Wasser der Intensivstation. Wenn retroorbitale Injektionen korrekt durchgeführt werden, ist es möglich, injiziertes Material, das markiert wurde, sichtbar zu machen.

Zum Beispiel können transgene Globin-GFP-rote Blutkörperchen unter einem Fluoreszenz-Dissektionsmikroskop gesehen werden, das drei Tage nach der Injektion in der Gefäßstruktur des Schwanzes eines empfangenden erwachsenen Casper-Fisches zirkuliert, ebenso erzeugt die erfolgreiche Injektion eines 70-Kilodalton-Dextrins, das an Texas-Rot konjugiert ist, sofort fluoreszierende Gefäße. In dem transparenten adulten Casper-Fisch, der mit der Standard-Ganztier-Fluoreszenzmikroskopie gut sichtbar gemacht werden kann, können fluoreszierende Loch-Nierenmarkzellen von transgenen Beta-Aktin-GFP-Spenderfischen auch retrooral in einen bestrahlten Casper-Empfängerfisch injiziert werden. Diese Zellen werden schließlich das Empfängermark beherbergen, wie hier gezeigt, drei Tage nach der Injektion, vier Wochen später können diese grünen Spenderzellen die Empfängerniere wieder besiedeln.

Wir haben Ihnen gerade gezeigt, wie Sie retroorbitale Injektionen bei erwachsenen Zebrafischen durchführen können. Wenn Sie dieses Verfahren durchführen, ist es wichtig, daran zu denken, mit Ihrer Nadel in einem 45-Grad-Winkel zur Ebene des Fisches zu injizieren. Das war's also.

Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.