Messung der induzierten Spannung Membran mit Di-8-ANEPPS

Für einen Biologen ist die Zelle der Baustein des Lebens, der eine Reihe unterschiedlicher Organellen enthält, von denen jede spezifische Aufgaben erfüllt und gemeinsam der Zelle ermöglicht, ihre lebenswichtigen Funktionen aus elektrischer Sicht zu bewältigen. Die innere Struktur ist jedoch nicht sehr bedeutend, und die Zelle kann als leitfähiges Zytoplasma betrachtet werden, das von einer isolierenden Membran umschlossen und von einem leitfähigen Außenraum umgeben ist. Eine geringe Unausgeglichenheit der Ionenkonzentrationen, bei der überschüssige Ionen sich nahe der Membran anreichern, führt zur Ruhepotentialdifferenz der Membran.

Wenn eine Zelle in ein elektrisches Feld gebracht wird, führt dies zu einer lokalen Ladungsverschiebung auf beiden Seiten der Membran. Das Ergebnis ist eine induzierte Membranspannung, die sich zur Ruhepotentialspannung addiert und nach dem Abschalten des Feldes verschwindet. Bei einfachen Zellformen kann die induzierte Membranspannung analytisch für eine kugelförmige Zelle berechnet werden.

Sie wird durch die Schwan-Gleichung beschrieben, die besagt, dass die Spannung proportional zur Feldstärke und Zellgröße ist und entlang der Membran der Kosinusfunktion folgt. Bei komplexeren Zellformen kann die induzierte Spannung erheblich von der Kosinusfunktion abweichen und muss entweder numerisch mithilfe eines leistungsstarken Computers oder experimentell unter Verwendung eines potentiometrischen Farbstoffs bestimmt werden. Einer der potentiometrischen Farbstoffe, die häufig für diesen Zweck verwendet werden, ist Diethyl AIPs.

Ein schneller Farbstoff mit von der Membranspannung abhängigen Anregungs- und Emissionsspektren, AIPs, wird stark fluoreszierend, wenn er an die Membran gebunden ist, wobei die Änderung der Fluoreszenzintensität proportional zur Änderung der Membranspannung ist. Dieses Video zeigt das Protokoll zur Messung der induzierten Membranspannung unter Verwendung von D AIPs. In diesem Beispiel werden Chinas Hamsterovarzellen verwendet, die mit 100.000 Zellen pro Kammer in Kammern ausgesät werden.

In HAMF 12-Kulturmedium, das mit fetalem Kalbsserum, L-Glutamin und Antibiotika ergänzt wurde, inkubieren Sie die Zellen in ihrem Kulturmedium zwei bis vier Stunden lang, um anhaftende Zellen von sphärischer Form zu erhalten, oder 16 bis 20 Stunden, um einzelne anhaftende Zellen komplexerer Form zu erhalten. Bereiten Sie eine 10-Millionen-MO-Stammlösung von Diet-Aaps, die in DMSO im Originalfläschchen gelöst ist, vor. Einige Zelllinien benötigen möglicherweise eine zusätzliche Zugabe von Onic, um die Einlagerung des Farbstoffs in die Membran zu erleichtern. Geben Sie ein Milliliter Spinner, eine Modifikation des minimal essentiellen Mediums (SMEM), in ein EOL-Röhrchen und fügen Sie 2,5 Mikroliter 20 % Onic und drei Mikroliter 10 Millimolar Diet-Aaps hinzu.

Dies ergibt eine Ladelösung, die etwa 30 µM Diät-AAPS und 0,05 % Onic enthält. Ersetzen Sie das Kulturmedium in der Kammer durch die Ladelösung. Stellen Sie die Kammer für 10 Minuten bei vier Grad Celsius in den Kühlschrank.

Die Internalisierung des Farbstoffs durch die Plasmamembran wird nach der Färbung weitgehend gehemmt; spülen Sie den überschüssigen Farbstoff mehrmals vorsichtig mit reinem SMEM aus. Geben Sie abschließend 1,5 Milliliter SMEM in die Kammer. Die Zellen werden mit einem Fluoreszenzmikroskop, einer Öl-Immersion-Objektivlinse, einem Monochromator und einer CCD-Kamera beobachtet.

Stellen Sie in der Aufnahmesoftware die Anregungswellenlänge auf 419 Nanometer ein und wählen Sie einen Bandpassfilter mit einer Einstellung von etwa 605 Nanometern, obwohl dieser hier nicht angewendet wird. Diet aaps ermöglicht auch verhältnisbasierte Messungen der Membranspannung. Platzieren Sie die Kammer mit den Zellen auf dem Mikroskoptisch, positionieren Sie die Elektroden am Boden der Kammer und verbinden Sie sie mit dem Impulsgenerator.

In diesem Beispiel wird ein Rechteckimpuls mit einer Amplitude von 35 Volt und einer Dauer von 50 Millisekunden erzeugt. Mithilfe einer Gleichspannungsquelle und eines mikroprozessorgesteuerten Schalters wird der Impuls einem Elektrodenpaar zugeführt, wodurch ein elektrisches Feld zwischen ihnen erzeugt und die Membranspannung induziert wird. Die Impulsabgabe muss mit der Bildaufnahme synchronisiert sein.

Suchen Sie die Zellen von Interesse, und geben Sie für jeden Impuls einen einzelnen elektrischen Impuls oder eine Abfolge von Impulsen ab. Nehmen Sie zwei Fluoreszenzbilder auf: das Kontrollbild unmittelbar vor dem Impuls und das Impulsbild während des Impulses aufgrund der geringen Reaktion des Farbstoffs. Die Änderungen in der Fluoreszenz sind schwer zu erkennen und werden erst nach der Bildverarbeitung deutlich; öffnen Sie dazu die Bilder für jeden Impuls.

Subtrahieren Sie den Hintergrund sowohl im Kontrollbild als auch im Pulsbild. Wählen Sie eine Zelle aus und legen Sie den interessierenden Bereich so fest, dass er der Membran entspricht. Messen Sie die Fluoreszenz entlang dieses Bereichs im Kontroll- und Pulsbild und übertragen Sie die Werte für jeden Puls in eine Tabellenkalkulation.

Ziehen Sie die Kontrolldaten von den Pulsdaten ab und dividieren Sie das Ergebnis durch die Kontrolldaten, um die relativen Fluoreszenzänderungen zu erhalten. Wenn eine Abfolge von Pulsen angewendet wird, können die für jeden Puls bestimmten Werte der relativen Änderung gemittelt werden. Um eine zuverlässigere Messung zu erhalten, transformieren Sie die relativen Fluoreszenzänderungen in die induzierte Membranspannung.

Mithilfe einer Kalibrierungskurve lässt sich eine grobe Abschätzung dieser Kurve aus der Literatur entnehmen, doch für eine höhere Genauigkeit muss sie für jeden speziellen Aufbau gemessen werden. Tragen Sie die Spannung als Funktion der relativen Bogenlänge auf. Die Kurve kann auch für sphärische Zellen durch Verwendung eines geeigneten Filters geglättet werden.

Die resultierende Darstellung nähert sich einer Kosinusfunktion an, die mit der Schwan-Gleichung übereinstimmt. Bei komplizierteren Zellformen liefert das gleiche Verfahren komplexere räumliche Verteilungen der Membranspannung.