Spinal Cord Elektrophysiologie
18. Januar 2010
Eine Demonstration der Isolierung von Neugeborenen Maus Rückenmark für elektrophysiologische Untersuchungen.
Okay. Hallo, mein Name ist Alan Meyer und ich bin wissenschaftlicher Mitarbeiter im Faf-Labor am Salk-Institut. Heute zeige ich Ihnen, wie man eine ventrale Laminektomie durchführt, um das Rückenmark einer Maus zu isolieren. Außerdem zeige ich Ihnen, wie man das Rückenmark an eine Elektrode anbringt, um seine neuronale Aktivität aufzuzeichnen. Dazu müssen Sie zwei Lösungen für das Rückenmark vorbereiten: eine für die Dissektion und eine andere für das Ableitbad.
Der einzige Unterschied zwischen den beiden Lösungen liegt in der Konzentration von Calciumchlorid. Zunächst muss eine Lösung von 10 X-A-C-S-F hergestellt werden. Dazu werden die unten aufgeführten Reagenzien benötigt.
Beginnen Sie damit, 100 Milliliter der 10 X-A-C-S-F in einen einliterigen Messkolben zu geben. Füllen Sie anschließend den Kolben mit Wasser, lassen Sie jedoch Platz, um ein Überlaufen zu vermeiden. Wenn Gas zugeführt wird, gase die Lösungen mit einer Gasgemischkonzentration von 5 % CO2 und 95 % O2.
Um den pH-Wert zu senken und die Lösung zu oxygenieren, fügen Sie ein Milliliter einer einmolarigen Magnesiumsulfatlösung hinzu. Als Nächstes geben Sie ein Milliliter einer einmolarigen Calciumchloridlösung zur Dissektionslösung und zwei Milliliter einer einmolarigen Calciumchloridlösung zur Aufzeichnungslösung. Mäuse im Alter von E 16,5 bis P 4 können für diese Experimente verwendet werden.
Beginnen Sie die Dissektion der Maus, indem Sie sie zuerst schnell mit einer scharfen Schere enthaupten. Schneiden Sie anschließend entlang der ventralen Mittellinie, bis Sie zum Schwanz gelangen. Entfernen Sie dann mit einer Pinzette die Eingeweide der Maus und spülen Sie diese mit der A-CSF-Lösung ab.
Verwenden Sie das einkristalline Calciumchlorid-A-CSF, um die Dissektion durchzuführen. Legen Sie die Maus in die Dissektierschale und fixieren Sie sie, indem Sie je einen Pin in ihre vier Pfoten und einen Pin an der Basis des Schwanzes anbringen. Unser Ziel für diesen Teil besteht darin, das Rückenmark zu isolieren, indem entlang der roten gestrichelten Linie geschnitten und die Wirbelsäule von der Lamina getrennt wird, die das Rückenmark umgibt.
Dadurch können Sie das Rückenmark freilegen. Gehen Sie dann entlang der Linie, um die Häute und Rückenwurzeln auszuschneiden und das Rückenmark zu lösen. Lokalisieren Sie die Wirbelsäule und greifen Sie mit einer Hand mit einer Pinzette fest die Wirbelsäule, während Sie die andere Hand mit einer kleinen Schere verwenden.
Um das Rückenmark zu entfernen, halten Sie die Schere in flachem Winkel. Um zu vermeiden, dass die Scherspitzen das Rückenmark verletzen, werden wir nun das Rückenmark präparieren. Entlang der roten Linie schneiden Sie die Hirnhäute und die Spinalwurzeln durch.
Um das Rückenmark zu entfernen, können Sie entlang beider Seiten des Marks schneiden und anschließend entlang der ventralen Mittellinie schneiden. Es ist wichtig, die Schere in einem flachen Winkel zu halten, um das Rückenmark nicht zu verletzen. Achten Sie darauf, die Wurzeln nicht zu dicht am Rückenmark durchzutrennen.
Überführen Sie anschließend das Rückenmark in das Ableitbad und verbinden Sie die Elektroden mit den Rückenwurzeln. Positionieren Sie die Elektrode in der Nähe der Wurzel. Ziehen Sie dann mittels Absaugung vorsichtig den Nerv in die Elektrode hinein.
Vielen Dank fürs Zuschauen und ich hoffe, dass dieses Video bei Ihren zukünftigen Experimenten hilfreich sein wird.
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Übersicht
In diesem Artikel wird die Isolierung des Rückenmarks von neugeborenen Mäusen für elektrophysiologische Untersuchungen demonstriert. Das Verfahren umfasst die Durchführung einer ventralen Laminektomie und die Befestigung des Rückenmarks an einer Elektrode zur Aufzeichnung neuraler Aktivität.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Elektrophysiologie
Hintergrund
- Die Isolierung des Rückenmarks ist entscheidend, um neuronale Aktivität zu untersuchen.
- Elektrophysiologische Techniken ermöglichen die Messung neuronaler Signale.
- Die Konzentration von Calciumchlorid ist wichtig für die Dissektions- und Ableitungslösungen.
Zweck der Studie
- Die Technik zur Isolierung des Rückenmarks von neugeborenen Mäusen demonstrieren.
- Zeigen, wie das Rückenmark an eine Elektrode angebracht wird.
- Die Aufzeichnung neuraler Aktivität erleichtern.
Verwendete Methoden
- Ventrale Laminektomie zur Isolierung des Rückenmarks.
- Zubereitung von Dissektions- und Ableitungslösungen.
- Verwendung von Elektroden zur Aufzeichnung neuraler Aktivität.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Isolierung des Rückenmarks aus neonatalen Mäusen.
- Effektive Befestigung des Rückenmarks an Elektroden.
- Aufzeichnung neuraler Aktivität demonstriert.
Schlussfolgerungen
- Die Technik ist für elektrophysiologische Untersuchungen geeignet.
- Die Zubereitung der Lösungen ist entscheidend für erfolgreiche Ergebnisse.
- Diese Methode kann in verschiedenen Bereichen der Neurowissenschaftsforschung angewendet werden.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Dieses Protokoll ermöglicht die Isolierung des Rückenmarks von neugeborenen Mäusen zur elektrophysiologischen Untersuchung zentraler Mustergenerierungsschaltkreise und unterstützt die mechanistische Entlastung bei der Zielvalidierung für neuromuskuläre Erkrankungen. Die Methode stellt ein krankheitsrelevantes System bereit, um die Funktion von Lokomotionsnetzwerken zu untersuchen und die Wirkung von Substanzen auf die neuronale Signalübertragung zu bewerten. Sie erhöht die Vorhersagesicherheit in der frühen Entdeckungsphase, indem sie eine quantitative Messung elektrophysiologischer Signale aus einem validierten präklinischen Modell ermöglicht.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen im Zusammenhang mit der Entwicklung von Bewegungsschaltkreisen und der Ansteuerung neuromuskulärer Zielstrukturen.
- Operativer Wert: Bietet eine reproduzierbare Aufbereitung von Rückenmarksgewebe für konsistente elektrophysiologische Ableitungen.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Unterstützt die Assay-Standardisierung durch kontrollierte Dissektionslösungen und definierte Calciumchlorid-Konzentrationen zur Sicherstellung der Stabilität des Aufzeichnungsbadens.
- Operationaler Wert: Erleichtert die Herstellung validierter biologischer Systeme für nachgeschaltete Verfahren zur Wirkstoff-Screening und Signal-Detektion.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Bietet ein krankheitsrelevantes System, um Veränderungen der neuronalen Aktivität in Verbindung mit lokomotorischen Phänotypen in präklinischen Modellen zu bewerten.
- Operationaler Wert: Ermöglicht Kontinuität von der Entdeckung bis zur präklinischen Validierung, indem quantifizierbare elektrophysiologische Messgrößen bereitgestellt werden.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode lässt sich in frühe Entdeckungsworkflows integrieren, indem sie isolierte Rückenmarkpräparationen bereitstellt, die die Hypothesenprüfung und Klärung von Wegen für neuromuskuläre Zielstrukturen unterstützen.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die Hypothesenprüfung der Funktion zentraler Mustergeneratoren und der Modulation neuronaler Schaltkreise.
- Screening: Ermöglicht die Versuchsbereitschaft durch standardisierte Dissektions- und Ableitungslösungen mit definierten ionischen Zusammensetzungen.
- Analytik: Erzeugt quantitative elektrophysiologische Messungen der ventralen Nervenwurzeln, um experimentelle Bedingungen zu vergleichen.
- Translationale Forschung: Schafft Anschluss an die präklinische Kontinuität, indem sie eine messbare Ausgabe für die Modulation von zielgerichteten, bewegungsbezogenen Strukturen bereitstellt.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare Plattform für die Aufbereitung neuronaler Gewebe, die in mehreren neuromuskulären Entdeckungsprogrammen anwendbar ist.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit bei der Target-Validierung, indem mechanistische Unklarheiten in der Funktion von Bewegungsschaltkreisen reduziert werden.
- Operativer Wert: Gewährleistet Standardisierung und Reproduzierbarkeit durch definierte Lösungszubereitungen und Dissektionsmethoden.
- Strategischer Wert: Verbessert Entscheidungen über Fortführung oder Abbruch durch die Möglichkeit, bereits frühzeitig die Wirkung von Substanzen auf neuronale Signalübertragung zu beurteilen.
- Portfolio-Wirkung: Unterstützt die risikoadjustierte Priorisierung neuromuskulärer Targets basierend auf elektrophysiologischen Reaktionsprofilen.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse in der Dissektion neugeborener Mäuse und elektrophysiologischen Ableittechniken.
- Abhängig von der Instrumentierung zur Befestigung von Saugelektroden und Erfassung neuronaler Signale.
- Erfordert eine standardisierte Vorgehensweise zwischen Teams bei der Herstellung von Dissektions- und Aufzeichnungslösungen.
- Beinhaltet Anpassungsüberlegungen bei Anwendung auf unterschiedliche Entwicklungsstadien oder Krankheitsmodelle.
- Eingeschränkt durch die Notwendigkeit einer exakten Kontrolle der Calciumchlorid-Konzentration zur Aufrechterhaltung der Gewebeviabilität während der Aufzeichnung.
