Mess-Plasmamembranprotein endocytischen Preise von Reversible Biotinylierung

Dieses Protokoll beschreibt eine allgemeine Methode zur Messung der endozytotischen Rate der meisten Plasmamembranproteine unter Verwendung reduzierbarer, membrangängiger Reagenzien. In diesem Verfahren werden Zelloberflächenproteine, die extrazelluläre Lysine enthalten oder kovalent markiert sind, bei vier Grad Celsius mit Sulfo-NHS-SS-Biotin – hier in grün dargestellt – markiert. Anschließend werden die Zellen auf 37 Grad Celsius erwärmt, um die Endozytose von Oberflächenproteinen zu ermöglichen. Danach werden die Zellen wieder auf vier Grad Celsius abgekühlt, um den Membrantransport zu stoppen, und das verbleibende Oberflächenbiotin wird mithilfe eines Reduktionsmittels entfernt, das die Disulfidbindung belässt.

Daher verbleiben nur die biotinylierten Proteine, die ursprünglich an der Zelloberfläche lokalisiert waren, internalisiert wurden und vor dem Abstreifverfahren geschützt blieben. Abschließend werden die Zellen solubilisiert und die biotinylierten Proteine mittels Streptavidin-Affinitätschromatographie isoliert. Hallo, ich bin Luke Gabriel aus dem Labor von Heli Milk Ian in der Abteilung für Psychiatrie an der University of Massachusetts Medical School.

Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Messung von endozytotischen oder Internalisierungsraten mithilfe einer reversiblen Biotin-Elutions-Technik. Wir verwenden dieses Verfahren, um die Internalisierungsrate des Dopamintransporters zu messen. Beginnen wir also.

Am Tag vor dem Experiment Zellen und Substrate für die Verwendung am folgenden Tag vorbereiten. Die Zelltypen und Medien variieren, aber wenn die experimentellen Zellen nicht stark adhäsiv sind, ein geeignetes Zelladhäsions-Substrat wie polylysinbeschichtete Zellkulturschalen verwenden, jeweils auf jeder Sechs-Loch-Platte. Vier Vertiefungen insgesamt mit zwei separaten Platten beschriften.

Für jedes getestete Protein werden zwei Vertiefungen auf der Kontrollplatte für die Gesamtoberflächenprotein- und Abbausteuerung verwendet. Bereiten Sie eine Vertiefung auf der Versuchsplatte für jede zu testende Internalisierungsbedingung vor. Säen Sie eine mal 10 hoch 6 Zellen in zwei Milliliter Zellkulturmedium aus, sodass die Zellen am folgenden Tag etwa zu 80 % konfluent sein werden.

Nach der Kultivierung der Zellen bereiten Sie die folgenden Lösungen vor und lagern Sie bei vier Grad Celsius für die Verwendung am zweiten Tag. PBS zwei plus wird aus phosphatgepufferter Salzlösung mit einem pH-Wert von 7,4 hergestellt und mit 1,5 Millimolar Magnesiumchlorid und 0,2 Millimolar Calciumchlorid ergänzt. Die Tonationspufferlösung wird aus PBS zwei plus hergestellt, das mit 100 Millimolar Glycin ergänzt wurde. NT-Puffer wird hergestellt mit 150 Millimolar Natriumchlorid, 1 Millimolar EDTA, 0,2 % BSA und 20 Millimolar Tris bei einem pH-Wert von 8,6. Ripa-Puffer wird hergestellt mit 10 Millimolar Tris bei einem pH-Wert von 7,4, 150 Millimolar Natriumchlorid, 1 Millimolar EDTA, 0,1 % SDS, 1 % Triton X-101 und 1 % Natriumdesoxycholat.

Bereiten Sie als Nächstes eine SULF N-H-S-S-S-Biotin-Stammlösung vor, indem Sie sie in SULFOXID oder DMSO auf eine Konzentration von 200 Milligramm pro Milliliter auflösen. Stellen Sie Aliquote zu je 500 Mikroliter her und lagern Sie sie bei minus 20 Grad Celsius. Die Aliquote können mehrere Gefrier-Tau-Zyklen durchlaufen, nachdem dieser Tris durchgeführt wurde.

Eine TCEP-Standardlösung (Carboxyethylphosphin-Hydrochlorid) wird in einer Konzentration von 500 Millimolar hergestellt, indem sie in 50 Millimolar Tris gelöst wird, und der pH-Wert wird auf 7,4 eingestellt. Da TCEP stark sauer ist, muss der pH-Wert der Lösung auf 7,4 eingestellt werden, bevor sie abgedeckt und unter Aluminiumfolie vor Licht geschützt bei minus 20 Grad Celsius gelagert wird. Am zweiten Tag bereiten Sie PBS 2+ vor, das mit 0,18 % Glukose und 0,2 % proteasefreiem Rinderserumalbumin (IgG) ergänzt ist (PBS 2+ GBSA) und im Wasserbad auf 37 Grad Celsius vorgewärmt wird.

Lösen Sie die SFO N-H-S-S-S Biotin-Stammlösung bei Raumtemperatur auf. Bereiten Sie unmittelbar vor der Verwendung eine frische Schwefel-N-H-S-S-S-Biotin-Lösung vor, indem Sie die Lösung kräftig verwirbeln, um das DMSO aufzulösen.

Stellen Sie beide Platten in einem Kühllabor auf ein Eisbad und spülen Sie jedes Loch dreimal mit zwei Milliliter eiskalter PBS 2+ aus, wobei die Platten leicht geneigt gehalten werden, um eine vollständige Entleerung der Pufferlösung zu gewährleisten. Nach dem letzten Waschschritt werden 0,75 Milliliter pro Loch der frischen Sulfa-N-H-S-S-S-Biotin-Lösung zu jedem Loch hinzugegeben. Inkubieren Sie 15 Minuten bei vier Grad Celsius auf dem Eisbad mit intensivem Schütteln auf einem Plattenschüttler, kurz vor Ende der Inkubation.

Bereiten Sie eine weitere frische SUHO N-H-S-S-S-Biotin-Lösung vor und ersetzen Sie nach 15 Minuten die alte Lösung durch die frische Lösung. Inkubieren Sie weitere 15 Minuten bei vier Grad Celsius mit intensivem Schütteln auf einem Plattform-Shaker. Nach der zweiten Inkubation waschen Sie die Zellen dreimal schnell mit je zwei Millilitern Pufferlösung, um alle nicht reagierten NHS-Biotin-Moleküle zu quenchieren. Anschließend inkubieren Sie in zwei Millilitern Pufferlösung für 15 Minuten.

Ersetzen Sie die Lösung nach 15 Minuten durch frische Abpufflösung und inkubieren Sie weitere 15 Minuten. Halten Sie die Platten während jeder Inkubation bei vier Grad Celsius mit sanftem Schütteln auf einem Plattenschüttler, während die Kontrollplatte in der Abpufflösung auf dem Laborpult im Kühlschrank bleibt. Entfernen Sie die Versuchsplatte an dieser Stelle aus dem Kühlschrank und stellen Sie sie auf das Eisbad.

Wenn Arzneimittelbehandlungen getestet werden, fügen Sie geeignete Arzneimittelkonzentrationen zu vorgewärmtem PBS mit zwei Plus GBSA hinzu. Hier verwenden wir entweder ein Ethanol-Fahrzeug oder einen Mikromolar vier Ball Myra-Azetat oder PMA, um den PKC-Weg zu aktivieren. Spülen Sie jede Vertiefung der Versuchsplatte dreimal mit zwei Millilitern vorgewärmtem PBS mit zwei Plus GBSA, wobei nach dem letzten Spülvorgang die entsprechenden Arzneimittelbehandlungen hinzugefügt werden.

Geben Sie zwei Milliliter der entsprechenden PBS-2+-GBSA-Lösungen hinzu und füllen Sie alle leeren Vertiefungen mit vorgewärmtem Medium auf, um eine gleichmäßige Temperaturverteilung über die gesamte Platte zu gewährleisten. Überführen Sie die Zellen unmittelbar vor Ende der Inkubation für 10 Minuten in einen 37 °C warmen Inkubator. Bereiten Sie frische Abstreiflösung durch Verdünnen einer 50 mmolaren TCEP-Lösung in NT-Puffer vor und lagern Sie diese auf Eis.

Bereiten Sie eine ausreichende Menge für ein Milliliter pro Vertiefung vor. Nach der 10-minütigen Inkubation übertragen Sie die Versuchsplatte schnell in ein Eisbad und bringen Sie anschließend zurück in den Kühlraum. Waschen Sie die Versuchsvertiefungen dreimal mit je zwei Milliliter eiskaltem NT-Puffer, um die Endozytose zu stoppen.

Anschließend das Abstreif-Kontrollfeld dreimal mit je zwei Millilitern eiskaltem NT-Puffer waschen. Die Gesamt-Kontrollfelder in der Abpufflösung belassen. Ein Milliliter Abstreiflösung zu jedem Versuchs- und Abstreif-Kontrollfeld hinzufügen und 15 Minuten auf Eis inkubieren.

Vier Grad Celsius mit sanftem Schütteln vor dem Ende der Inkubation. Bereiten Sie erneut das gleiche Volumen an frischer Abstreiflösung wie zuvor vor. Nach 15 Minuten ersetzen Sie die alte Abstreiflösung durch frische Lösung und inkubieren weitere 15 Minuten bei vier Grad Celsius mit sanftem Schütteln, um die Zellen zuerst zu lysieren.

Waschen Sie alle Vertiefungen, die der Abbaulösung ausgesetzt waren, dreimal mit je zwei Millilitern NT-Puffer. Anschließend waschen Sie alle Vertiefungen, einschließlich der Gesamtkontrollen, dreimal mit je zwei Millilitern kaltem PBS. Geben Sie danach 300 Mikroliter RIPPA-Puffer, der frische Proteaseinhibitoren enthält, in jede Vertiefung hinzu und lysieren Sie die Zellen durch Schütteln für 20 Minuten bei vier Grad Celsius.

Überführen Sie das Lysat in 1,5-Milliliter-Mikroröhrchen und entfernen Sie zelluläre Trümmer durch Zentrifugation für 10 Minuten bei 18.000 × g und 4 °C. Verwenden Sie einen mit Ihren Lysierbedingungen kompatiblen Proteinassay, beispielsweise den BCA-Proteinassay von Pierce, um die Proteinkonzentration des Lysats im Vergleich zu einer Standardkurve aus bovinem Serumalbumin zu bestimmen. Bereiten Sie danach die Lysate für Strep- und Affinitätschromatographie vor.

Füllen Sie 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen mit äquivalenten Mengen an Protein aus jeder Probe. In diesem Experiment isolieren wir biotinylierte Proteine aus 50 Mikrogramm Zelllysaten. Geben Sie RIPA-Puffer, der Proteaseinhibitoren enthält, auf ein Endvolumen von 200 Mikrolitern pro Probe hinzu.

Als Nächstes die Streptavidin- und Agarose-Beads vor der Verwendung kräftig vortexen; mit einer 200-Mikroliter-Pipette, deren Spitze abgeschnitten wurde, jeweils 20 Mikroliter der Streptavidin- und Beads-Suspension in jedes Röhrchen pipettieren. Die Röhrchen vortexen und am folgenden Tag über Nacht bei vier Grad Celsius auf einem Röhrchenrotator inkubieren. Die Beads durch Zentrifugation der Proben bei 18.000 × g für zwei Minuten bei Raumtemperatur sammeln, anschließend den Überstand vorsichtig abpipettieren, wobei darauf zu achten ist, das Bead-Pellet mit der Pipettenspitze nicht zu berühren, und dann 0,75 Milliliter der bei Raumtemperatur gehaltenen Pufferlösung hinzufügen.

Puffern Sie jeden Kolben ab und wirbeln Sie ihn mit maximaler Geschwindigkeit, um die Kügelchen zu waschen. Zentrifugieren Sie zwei Minuten bei 18.000 ×g. Sammeln Sie die Kügelchen bei Raumtemperatur und wiederholen Sie diesen Wasch-, Wirbel- und Zentrifugierschritt noch zweimal, sodass insgesamt drei Waschungen durchgeführt werden.

Aspirieren Sie so viel wie möglich von dem Puffer, ohne das Perlenpellet zu stören. Geben Sie anschließend 20 bis 25 Mikroliter zweifach konzentrierten reduzierenden Laemmli-Puffer zu jedem Röhrchen. Das Reduktionsmittel spaltet die N-H-S-S-S-Biotin-Disulfidbindung und setzt die isolierten Proteine in Lösung frei.

Da die meisten Membranproteine eine Hitzebehandlung nicht vertragen, inkubieren Sie die Röhrchen nach der Reduktion und Denaturierung der Proteine 30 Minuten bei Raumtemperatur auf einem Rotator. Trennen Sie die Proteine mithilfe einer standardmäßigen SDS-PAGE und übertragen Sie die Proteine auf eine Membran zur Immundetektion. Führen Sie die Immunfärbung mit einem geeigneten Antikörper durch. In diesem Experiment verwenden wir einen Ratten-anti-DAT-Antikörper von Checon Nummer 3609 in einer Verdünnung von 1:2000 und erfassen die immunreaktiven Banden mit einem CCD-Kamera-Geldokumentationssystem, wobei sichergestellt wird, dass keine gesättigten Pixel vorhanden sind. In diesem Experiment verwenden wir ein BioRad VersaDoc-Imaging-System mit Quantity-One-Software, um die Dichte jeder Bande zu quantifizieren.

Hier ist ein repräsentativer Immuno-Block aus dem reversiblen Vorgang am Dopamin-Transporter dargestellt. Das stärkste Signal entspricht der Gesamtmenge an Oberflächenprotein vor der Internalisierung, wie im „total“-Gleis oder T zu sehen ist. Die Strip-Kontrolle oder S sollte idealerweise nahezu leer sein und eine hohe Strip-Effizienz anzeigen. Die Strip-Effizienz wird anhand von Banddichtemessungen mit der folgenden Formel berechnet.

Dieser Streifen in diesem Experiment hatte eine Effizienz von 99,8 %. Streifen mit einer Effizienz von mehr als oder gleich 90 % sind optimal, und Ergebnisse unter diesem Wert sollten verworfen werden. Dieses Beispiel eines Porenstreifens zeigt ein sichtbares Band in der Streifenbahn mit einer Streifeneffizienz von 34 %. Hier sind die Bänder mit geringerer Intensität die Internalisierungsbahnen aus der Versuchsplatte. Die Zellen wurden entweder mit Fahrzeuglösung oder mit einer Mikromolar-Lösung von PMA während einer 10-minütigen Internalisierung behandelt, und die Internalisierungsraten des Dopamintransporters wurden gemessen.

Die Internalisierungsrate wird anhand von Banddichtemessungen wie folgt berechnet: Wie in diesem Diagramm zu sehen ist, wurden 10,4 % des Oberflächen-DAT innerhalb von 10 Minuten unter Behandlung mit dem Fahrzeugmittel internalisiert. Die Behandlung mit PMA erhöhte jedoch die DAT-Internalisierungsrate auf 23,2 % des gesamten Oberflächen-DAT. Soeben haben Sie gelernt, wie man Internalisierungsraten von Plasmamembranproteinen mithilfe einer reversiblen Biotinylierungstechnik bestimmt.

Es ist wichtig, zwei Dinge zu beachten: Bereiten Sie das Bio-Tonationsreagenz sowie das TCP unmittelbar vor der Verwendung frisch zu. Wenn Sie feststellen, dass Sie während des Protokolls viele Zellen verlieren, verwenden Sie ein Zelladhäsions-Substrat auf Ihren Platten. Das war's.

Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihrem Experiment.