Name: Dual-Somatische Recordings von Gonadotropin-Releasing Hormone (GnRH) Neuronen von Green Fluorescent Protein (GFP) in Hypothalamus Slices Identified (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-02-23T17:20:00.000+00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: Erfahren Sie die Methode für duale somatische Recordings von GnRH-Neuronen in Hypothalamus-Schnitten von Mäusen. Diese Technik ermöglicht die Untersuchung koordinierter neuronaler Aktivität und verbessert das Verständnis reproduktiver Neurophysiologie.

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Ich bin dankbar, Ronald L. Calabrese, Dieter Jaeger (Emory University) und Ward Yuhas (Axon Instruments) für nützliche technische Diskussionen.

<ol><li> Hypothalamic Hirnschnitten bereit sind, inkubiert und die Aufnahme Kammer wie zuvor ausführlich (9) in Tieren, deren GnRH Neuronen exprimieren grün fluoreszierende Protein (GFP) unter der Kontrolle des GnRH-Peptid-Promotor (10). Nach Entfernung des Gehirns aus dem Tier, ist das Gehirn blockiert mit einer Rasierklinge in Regionen, die nicht von Interesse sind zu beseitigen. Um die Regionen zu entfernen zu bestimmen, wird das Gehirn auf der dorsalen Fläche platziert, so dass der Hypothalamus visualisiert werden können. Sowohl für den koronalen und sagittalen Schicht Orientierungen, ist das Kleinhirn entfernt. Für koronare Schicht Vorbereitung, ist der rostralen Teil des Kortex entfernt. In diesem Stück Orientierung bieten die seitlichen Bereiche der Hirnrinde Unterstützung für das Schneiden des Gehirns und eine ausreichende Fläche des Gehirns für die Platzierung von Silberdraht an das Gehirn bei der Aufnahme Kammer zu sichern. Für die sagittalen Schicht Vorbereitung sind die seitlichen Regionen des Gehirns entfernt und die rostralen Teile der Hirnrinde bieten die Unterstützung für Gehirn Schneiden und für die Platzierung von Silber Drähte mit dem Gehirn in der Aufnahme gut zu sichern. Während der Sperrung Verfahren wird das Gehirn ständig befeuchtet mit kaltem künstlichen Liquor (ACSF) mit einer Glaspipette. </li><li> Eine kleine Menge Sekundenkleber ist auf dem neuesten Plattform gesetzt. Das Gehirn ist mit einem Spatel angehoben. Überschüssiges ACSF wird durch mitbringen Kimwipe an die Oberfläche der Spachtel und Zeichnung über ACSF Entfernung aus dem Gehirn entfernt. Das Gehirn ist leicht nach vorne geschoben auf den Leim. Es ist wichtig, nicht auf das Gehirn zu berühren oder drücken Sie auf es, um es zu sichern. Das Gewicht des Gehirns selbst ist in der Regel ausreichend, um sicherzustellen, dass es sicher ist. </li><li> Das Gehirn und das Schneidwerk wird dann an den vibrierenden Mikrotom gesichert und das Schneiden gut mit kaltem ACSF gefüllt. Die kalte Lösung beide Firmen das Gehirn und kann vor Beschädigungen während des Schneidens Verfahren zu schützen. Verschiedenen Hirnregionen unterschiedlich im Grad der Kälte, die Qualität Scheiben optimiert. Die Temperatur des ACSF für die Vorbereitung der Hypothalamus Scheiben ist in der Regel 0 ° C. </li><li> Scheiben sollte langsam geschnitten und jede Scheibe sollten frei weg schwimmen aus dem Gehirn. Wenn Scheiben beim Schneiden curl beginnen, sollten die Geschwindigkeit, mit der Klinge voran verlangsamt werden. Man kann mit einem kleinen Pinsel auf uncurl Scheiben aber das bedeutet Gefahr der Beschädigung der Scheiben und sollte daher vermieden werden. Langsam wird die Vorschubgeschwindigkeit der Klinge ist über mit einem Pinsel bevorzugt. </li><li> Da jede Scheibe aus dem Gehirn geschnitten wird, ist es aus der Trennkammer entnommen und in eine Scheibe Inkubationskammer in einem warmen Wasserbad (ca. 32 ° C). Die Scheibe Inkubator wird kontinuierlich mit Sauerstoff mit einer Mischung aus 95% O 2 und 5% CO 2 zugeführt. Generell Pre-Recording-Scheibe Inkubationszeit reicht von 30 Minuten bis 2 Stunden. </li><li> Glaspipetten (3-6 MOhm) hergestellt sind, wie zuvor beschrieben (9) mit einer vertikalen Abzieher. Die Temperatur und Dauer des Ziehens hängt von der Art der Pipette Abzieher benutzt man die Art von Glas verwendet man und die Lebensdauer der Heizfaden des puller basiert. Die Form der Pipettenspitze kann auch variieren je nach Präferenz des Nutzers. Wir haben gute Erfolge mit einer gleichmäßig konische Spitze mit einer Öffnung von 0,1 mm erreicht. Größere Öffnungen in der Pipette neigen dazu, die Neuronen beschädigen, während kleinere Öffnungen in langen Dauer Aufnahmen Ergebnis ausfallen. </li><li> Pipetten mit Sylgard beschichtet, um Kapazität zu reduzieren. Gezogen Pipettenspitzen sind leicht mit Sylgard 184 mit einer zweiten Pipette aufgetragen. Sylgarded Tipps sind dann thermisch gehärtet mit einer Heißluftpistole. Diese Pipetten sind dann mit dem Bad Perfusat gefüllt. Zur Erhöhung der Visualisierung der Pipettenspitzen, wird eine kleine Menge von Alexa-568, um den Teil des Bades als Pipettenlösung vor dem Befüllen der Pipetten verwendet werden aufgenommen. Wir wissen nicht wiegen die Alexa-568, sondern genug zu verwenden, um die Lösung pink von Auge drehen. Die Pipettenspitzen können dann unter dem Texas-Rot-Filter visualisiert. </li><li> Wir haben einen Ansatz zur Strom-Clamp Messungen zur Detektion von Aktionspotentialen mit geringem Widerstand Dichtungen (siehe Diskussion) zu erhalten entwickelt. Die Aufnahmen werden in der Zelle endogene Ruhepotential ohne angelegten Strom mit Axon Instruments 2B Axoclamp durchgeführt. Aufgrund des geringen Widerstandes Dichtung, konnte man nicht erkennen Aktionspotentiale nur mit dem 2B-Verstärker. Zur Erhöhung des Signals ist ein zweiter Verstärker (AM-Systeme 3000) in Serie mit dem Axoclamp 2B verwendet. Dieser Ansatz hat die Leichtigkeit von losen Dichtungen und Nutzen der Langzeit-Aufzeichnungen. Technisch kann man direkt zu messen Aktionspotentiale und damit die Umgehung der Probleme mit dem Ansatz in der Voltage-Clamp-Aufnahme-Modus (siehe Diskussion). </li><li> Man nimmt zwei Pipetten an der Oberfläche der beiden zuvor markierten Neuronen gleichzeitig, in ähnlicher Weise wie der Ansatz für die ganze Zelle Aufnahme-Konfiguration. Annäherung beider neurons zur gleichen Zeit wurde mehr Erfolg bei der Beschaffung der Dual-Aufnahmen, als zu versuchen jedes Neuron des Paares unabhängig. Während dieser Zeit werden die aktuellen Einspritzimpulse aus der 2B-Verstärker weitergegeben, wie während der Ansatz für Ganzzellableitungen getan wird. </li><li> Positiver Druck muss auf beiden Pipetten beibehalten werden, um Verstopfungen zu verhindern der Spitze. Positiver Druck für Dual-Aufnahmen ist am besten mit einem ungefüllten 3 ml leere Spritze an den Pipettenhalter von einer Länge von Rohrstück generiert. Mit Spritzen erlaubt es, Druck auf beide Pipetten aufrecht zu erhalten. Positiver Druck sollte so schnell wie der Pipette in die Badlösung der Aufnahme Kammer platziert wurde aufgetragen werden. Man nähert sich dem ausgewählten Neuronen mit den Pipetten der Reihe nach. Nach der Positionierung der ersten Pipette direkt auf die größte Fläche des Neurons, unterhält eine positive, indem man die Spritze in Stelle und lässt die Pipette in dieser Position. Einer kehrt dann an die Spitze der Aufnahme Kammer und senkt die zweite Aufnahme Pipette in die richtige Position. Ausgewählte Neuronen sind oft auf verschiedenen Ebenen der Scheibe. Die erste Pipette sollte über die Neuron, das tiefste in der Scheibe und die Position der zweiten Pipette an der mehr oberflächlichen Neuron positioniert werden. Dies verhindert die Positionierung des zweiten Pipette aus Verschiebung der Positionierung des zweiten Pipette als die Scheibe etwas bewegen wird in der vertikalen Ebene wie Pipetten der Scheibe geben. </li><li> Lose Dichtungen (18-30 MQ) verwendet werden. Der Überdruck wird induzieren eine kleine Grübchen auf der Oberfläche jeder Zelle. Man versucht zum ersten Neuron durch die Freigabe positiver Druck und Anwendung sehr leichten Unterdruck zu versiegeln. Der Überdruck wird durch Entfernen der Spritze freigegeben. Saug-durch den Mund wird dann an das freie Ende des Schlauchs angewendet. Eine gesunde Neuronen-Membran wird schnell auf die Freisetzung von positiven Druck zu reagieren und sich an der Pipette. Leichten Sog bilden eine Dichtung mit entsprechenden Widerstand in einem gesunden Nervenzelle. </li> <li> Wenn man zu einem Neuron und scheitert Dichtung versucht, kann die Pipette nicht wieder verwendet werden, da Membranen nur Dichtung, sehr sauberes Glas. Stattdessen wirft man die Pipette (und Mikroskop-Objektiv) weg von der Oberfläche der Scheibe an die Spitze der Perfusion gut, entfernt die Pipette aus dem Bad, Änderungen an einer sauberen Pipette und kehrt dann in die Scheibe zu versuchen, eine andere Zelle Dichtung . Für diesen Gründen ist es wichtig, mehrere potenzielle Neuronen für Aufnahmen auszuwählen. Für Scheiben mit weniger als 4-6 Aufnahmequalität Neuronen, von denen wählen, ist der Erfolg bei der Beschaffung von Dual-Aufnahmen beschränkt. </li><li> Nach der Gründung einer losen Dichtung am Widerstand basiert, werden die aktuellen Einspritzimpulse aus der 2B-Verstärker beendet. Die 2B Verstärker ist in Serie mit dem 3000-Serie Verstärker gelegt. In dieser Konfiguration dient der Ausgabe des 2B Verstärker als Eingang für die 3000-Serie Verstärker. Letztere Verstärker liefert ein Signal für die Datenerfassung. </li><li> Die Dichtung (Schritt 4) und Rekonfiguration von Verstärkern (Schritt 5) wird dann für das zweite Neuron wiederholt. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1678/1678fig1tmb.jpg" alt="Abbildung 1" border="0" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Ein Zeitraum von mehr schießen in zwei GnRH-Neurone mit dem losen Dichtung angebracht Aufnahme-Konfiguration in einer sagittalen Schicht Vorbereitung. Die Scheibe wurde von einem kastrierten männlichen abgeleitet. Jeder Ausschlag nach oben zeigt ein Aktionspotenzial. Beachten Sie, dass eine GnRH Neuron (top Spuren) fast Dauerfeuer Exponate während der zweite GnRH Neuron weist intermittierende platzt. Dieses Muster der Aktivität von einzelnen Neuronen GnRH ist ähnlich dem der einzelne Einheiten von Multi-Unit-Aufnahmen während der Sekretion in vivo (7) extrahiert. Bitte <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1678/1678fig1.jpg">klicken Sie hier,</a> um eine größere Version der Abbildung 1 zu sehen.

<ol><li>Silverman, A. J. The gonadotropin releasing-hormone (GnRH) neuronal systems: immunocytochemistry. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSilverman%2C+AJ+%22The+Physiology+of+Reproduction%22">The Physiology of Reproduction</a>. Knobil, E., Neill, J. D. , Raven Press. New York. (1994).</li>
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</ol>

Die Aktivität von Interesse in einigen Neuronen auch GnRH-Neurone (basierend auf Hormonsekretion) tritt auf Zeitskalen von Stunden (5-7). Daher ist die ganze Zelle Konfiguration nicht die beste Wahl für einige experimentelle Ziele durch die Dialyse von intrazellulären Botenstoffen in der ganzen Zelle Aufnahmemodus. In zweiter Linie sind Ganzzellableitungen allgemein Tiere weniger als etwa 120 Tage alt begrenzt. Mit zunehmendem Alter scheinen neuronalen Membranen zu versteifen, so dass eine hohe Beständigkeit Dichtungen nur schwer zu erreichen. Darüber hinaus erhält, wenn man eine hohe Dichtung, Reißen der Patch stört das Siegel, so dass ein Loch zwischen der Pipette und der Membran. Dies führt zu einem unbrauchbaren Aufnahmen und ein Neuron, das schnell sterben wird durch ionische Ungleichgewichte. Regelmäßige Eierstock-Zyklen und damit stabile Aktivität des GnRH-Puls-Generators nicht erst später im Leben auftreten (7-10 Monate alt in C57BL6 Frauen; 11, 12), über das Alter, wenn man vernünftigerweise erwarten, erhalten Ganzzellableitungen zuverlässig. Schließlich zerstören Ganzzellableitungen der endogenen Verhältnisse von internen und externen Ionenkonzentrationen. Mit ganzen Zelle Aufnahmen, entspricht die interne Konzentration von Ionen die Konzentration der Ionen in der Pipette Lösung. Dies liegt daran, Pipettenlösung der relativ großen Volumen schnell ein Gleichgewicht erreicht mit / ersetzt die relativ kleine endogene Volumen der Zelle. Die lose Zelle angebracht Ansatz umgeht viele der Einschränkungen der whole-cell-Aufnahmen. Erstens kann ein niedriger Widerstand Dichtung (15-30 MQ) verwendet werden. Diese sind relativ einfach, auch in Neuronen von älteren Tieren zu bilden. Zweitens muss man nicht Ruptur der versiegelten Patch der Membran. Daher sind lose Zelle angebracht Aufnahmen technisch viel einfacher als Ganzzellableitungen. Zusätzlich wird, da die Zellmembran intakt ist, ist Dialyse von intrazellulären Komponenten nicht auftreten und endogenen ionischen Verhältnisse erhalten bleiben. Man kann nicht mit dem losen Zelle angebracht Ansatz zur Untersuchung synaptischer Ströme, aber es ist ideal für Langzeit-Aufzeichnungen von Neuronen in einem relativ nicht-invasive Art und Weise. Die Zelle-Attached-Aufnahmen können auch mit jedem Standard intrazelluläre Lösung in der Pipette werden. Dies bietet den zusätzlichen Vorteil, daß dadurch die Membran-Patch, wenn langfristig die Aufnahme abgeschlossen ist und die Kennzeichnung des Neurons mit einem intrazellulären Marker. Die lose Zelle angebracht Ansatz hat in der Voltage-Clamp-Aufnahme-Modus verwendet. Allerdings hat Voltage-Clamp-Aufnahme in das lose Zelle Attached-Konfiguration mehrere methodische Probleme. Zuerst wird das aufgenommene Signal ein indirektes Maß der Aktivität. Das Signal, das gemessen (die so genannte Aktion Strom) ist der kapazitive Strom, dass die Membran (13) Gebühren. Dies ist eine äußerst wichtige methodische Frage. Die Kapazität und Widerstand einer Aufnahme Pipette filtern das aufgezeichnete Signal. Es ist sehr wahrscheinlich, dass die kleine Aktion Strömungen in Aufladen der Kapazität der Pipette, die nicht richtig mit den meisten Verstärkern, aufgrund der hohen Widerstandsfähigkeit der headstage kompensiert werden, gehen verloren. Wenn diese Signale unentdeckt bleiben, ist die scheinbare Brennen Muster des Neurons nicht den tatsächlichen Feuern Muster. Ebenso führen unkompensierte Pipette und Abdichtwiderstande erhebliche Fehler bei der Messung während Veränderungen wie bei der Aktion Strömungen zum Ausdruck kommen (13). Einige Verstärker sorgen für Kapazität und Widerstand &quot;Entschädigung&quot; für die Pipette und Siegel, welches Signal Loss-Limite, aber hohe Kopf Stufen der meisten Verstärker behindern optimalen Ausgleich. Zweitens ist eine künstliche Situation auf die Zelle eingeführt. In Voltage-Clamp-Modus, ist die Gegend um die Zellmembran zu einem festen Potential gehalten wird, in diesen Studien, 0 mV. Dies bedeutet nicht, es gibt keine Bestromung der Zellmembran. Das Signal in Voltage-Clamp gemessen wird tatsächlich die Menge des angelegten Stroms an die Membran zu dem festen Potential aufrecht zu erhalten. Daher kann diese angelegten Strom verändern die Zellaktivität. Dual-Aufnahmen in der GnRH-System sind eine besondere Herausforderung aufgrund der begrenzten Anzahl der GnRH-Neurone und deren diffuse Verteilung. Für Dual-Aufnahmen um erfolgreich zu sein, muss der Manipulator als überaus stabil. Auch leichte Bewegung der Elektrode kann die Pipette zu rutschen das Neuron und die Aufnahme zu beenden. Darüber hinaus kann die Bewegung der Pipette auf die Zelle (zB Re-Positionierung, um die Bewegung zu kompensieren) verändern Brennen Muster. Einige Ionenkanäle wie N-Typ-Kalziumkanäle sind mechanisch empfindlich: Membran Strecke führt repetitive Aktivität sowohl Ganzkörper-Zell-und Zell-attached Aufnahme-Konfigurationen (14). Schließlich muss der Manipulator System in der Lage sein überaus feine und gleichmäßige Bewegung. Wie oben, mit zwei Aufnahmen bemerkt, nimmt man zwei Pipetten an der Oberfläche der beiden zuvor markierten Neuronen gleichzeitig und versucht, Dichtungeinem Neuron. Wenn dies gelingt, dann versucht man Siegel der zweiten Zelle. Generell kann man nicht erwarten, zu versiegeln und haben eine hohe Qualität der Aufnahme bei jedem Versuch. Dies erzeugt jedoch ein besonderes Problem mit Dual-Aufnahmen. Wenn man erfolgreich mit dem ersten Neuron ist aber nicht mit dem zweiten, muss man ändern Sie die Pipette und versuchen Sie eine andere Zelle. Deshalb muss man in der Lage sein, sowohl die Tauch-Objektiv des Mikroskops und die Pipette an die Spitze der Perfusion gut (um die Pipette zu ändern) zu bewegen, ohne dass der Erfolg besiegelt Neurons. Unsere Entwicklung und den Einsatz der losen Zelle-Attached-Ansatz für Dual-Aufnahmen ist ein großer technischer Fortschritt im Studium GnRH Neuronen. Es ist wahrscheinlich, zu brauchbaren Ergebnissen, die dazu beitragen, die Feld, die im Kontext der kritischen Frage, welche Mechanismen zu Grunde liegen die koordinierte Aktivität, die Ergebnisse in pulsatile Hormonsekretion. Produzieren

dual-somatische recordings von gonadotropin-releasing hormone (gnrh) neuronen von green fluorescent protein (gfp) in hypothalamus slices identified

Dual Somatic Recordings from Gonadotropin-Releasing Hormone (GnRH) Neurons Identified by Green Fluorescent Protein (GFP) in Hypothalamic Slices

Gonadotropin-Releasing Hormone (GnRH) ist ein kleines Neuropeptid, das Hypophysen-Version von luteinisierendes Hormon (LH) und Follikel-stimulierendes Hormon (FSH) reguliert. Diese Gonadotropine sind essentiell für die Regulierung der reproduktiven Funktion. Die GnRH-haltigen Neuronen sind diffus über den Hypothalamus und Projekt der Median Eminenz verteilt, wo sie GnRH aus ihren Axonterminalen Freisetzung in die hypophysiotropic Portal-System (1). In dem Portal Kapillaren, reist GnRH die Hirnanhangdrüse die Freisetzung von Gonadotropinen in den systemischen Kreislauf zu stimulieren. GnRH Release ist nicht kontinuierlich, sondern tritt in episodischen Impulse. Es ist bekannt, dass die intermittierende Weise von GnRH Freisetzung notwendig für die Fortpflanzung (2, 3). Koordination der Tätigkeit mehrerer GnRH Neuronen wahrscheinlich zugrunde GnRH-Pulse. Insgesamt Peptid-Gehalt in GnRH-Neurone ist etwa 1,0 pg / Zelle (4), von denen 30% Wahrscheinlichkeit besteht die lösbare Pool. Levels von GnRH während eines Pulses (5, 6), deuten mehrere GnRH Neuronen sind wahrscheinlich in Neurosekretion beteiligt. Ebenso Einheit Aktivität von Hypothalamus Multi-Unit-Aufnahmen während der LH-Freisetzung extrahiert zeigt Veränderungen der Aktivität mehrerer Neurone (7). Die Elektroden mit aufgezeichneten Aktivität während der LH Impulse werden entweder mit GnRH Somata oder Fasern (8) verbunden sind. Daher kann zumindest einige dieser Aktivitäten ergibt sich aus GnRH Neuronen. Die Mechanismen, die dazu führen, dass synchronisiert feuern in hypothalamischen GnRH-Neurone sind unbekannt. Die Aufklärung der Mechanismen, Brennen in GnRH-Neurone zu koordinieren ist ein komplexes Problem. Zunächst werden die GnRH-Neurone relativ wenige. In Nagetiere, gibt es 800-2500 GnRH Neuronen. Es ist nicht klar, dass alle GnRH-Neurone in episodische GnRH Freisetzung beteiligt sind. Darüber hinaus sind GnRH-Neurone diffus verteilt (1). Dies hat unser Verständnis der Koordinierung des Brand kompliziert und hat viele technische Ansätze unlösbar. Wir haben lose Zellen befestigt Aufnahmen in Current-Clamp-Modus zum direkten Nachweis von Aktionspotentialen optimiert und entwickelt eine Aufnahme Ansatz, der für die gleichzeitige Aufnahmen von Paaren von GnRH-Neurone können.

Aktivität in neuronalen Systemen erfordert oft synchrone Aktionspotential Entladungen von Neuronen innerhalb einer bestimmten Population. Zum Beispiel, Impulse von Gonadotropin-Releasing-Hormon (GnRH) wahrscheinlich erfordern deshalb eine koordinierte Aktivität zwischen GnRH-Neurone. Wir präsentieren unsere methodische Ansatz für die zuverlässige Beschaffung gleichzeitige elektrophysiologischen Ableitungen aus dem diffus verteilt GnRH Neuronen.

Dual-Somatische Recordings von Gonadotropin-Releasing Hormone (GnRH) Neuronen von Green Fluorescent Protein (GFP) in Hypothalamus Slices Identified

Das Gonadotropin-Releasing-Hormon (GnRH) ist ein kleines Neuropeptid, das die Freisetzung von Luteinisierendem Hormon (LH) und follikelstimulierendem...

Dieses Video beschreibt ein Verfahren zur Durchführung von dualen anhaftenden Zellaufnahmen von Gonadotropin-freisetzenden Hormonneuronen. Hypothalamische Gehirnschnitte werden entweder in koronarer oder sagittaler Orientierung präpariert. Die Schnitte werden anschließend mit einem Immersionsobjektiv visualisiert, und Pipetten werden über zwei Neuronen positioniert.Widerstandsarme Abschlüsse werden gebildet, indem der positive Druck freigegeben und anschließend negativer Druck auf die somatische Zellmembran ausgeübt wird. Anschließend können Aufzeichnungen im angehefteten Modus durchgeführt werden. Hallo, ich bin Kelly Suiter.Willkommen in meinem Labor der Abteilung für Biologie an der University of Texas San Antonio. Ich bin Peter Heman aus dem Suitor-Labor. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Gewinnung dualer somatischer Ableitungen von Gonadotropin-freisetzenden Hormon-Neuronen und hypothalamischen Schnitten von Mäusen.Wir verwenden dieses Verfahren in meinem Labor, um koordinierte Feuermuster in GNH-Neuronen zu untersuchen. Beginnen wir also. Starten Sie das Verfahren, indem Sie das Gehirn eines Mäuses entfernen, das unter Isofluran-Anästhesie durch Enthauptung euthanasiert wurde.Die Maus, die in dem heutigen Verfahren verwendet wird, exprimiert das grün fluoreszierende Protein unter der Kontrolle des GNRH-Peptid-Promotors, der ausschließlich in GNRH-Neuronen exprimiert wird. Nach der Entnahme legen Sie das Gehirn in kalte, künstliche zerebrospinale Flüssigkeit oder A CSF. Legen Sie das Gehirn mit der dorsalen Seite nach oben, um während des Blockierverfahrens den Hypothalamus freizulegen.Befeuchten Sie das Gehirn kontinuierlich mit kalter ACSF unter Verwendung einer Glaspipette. Um einen sagittalen Schnitt vorzubereiten, entfernen Sie mit einer Rasierklinge das Kleinhirn. Entfernen Sie anschließend die lateralen Regionen des Gehirns.Die rostralen Anteile der Großhirnrinde dienen als Stütze für das Schneiden des Gehirns und zur Befestigung von Silberdrähten, die das Gehirn fixieren. Geben Sie in der Aufzeichnung eine kleine Menge Sekundenkleber auf die Schneidplattform. Heben Sie das Gehirn mit einem Spatel an, führen Sie ein Kim-Tuch an die Oberfläche des Spatels heran und entfernen Sie überschüssiges ACSF vom Gehirn.Danach mit einer Rasierklinge das Gehirn vorsichtig nach vorne auf den Kleber schieben. Es ist wichtig, das Gehirn während des Transfers nicht zu berühren oder herunterzudrücken. Das Eigengewicht des Gehirns sollte ausreichen, um es zu fixieren.Befestigen Sie das Gehirn und die Schneideplattform an einem vibrierenden Mikrotom und füllen Sie die Schneidewanne mit kalter A-CSF. Die kalte Lösung verfestigt das Gehirn und schützt es so vor Schäden. Schneiden Sie während des Vorgangs langsam Schnitte; jeder Schnitt sollte sich frei vom Gehirn lösen und schwimmen.Entnehmen Sie die Schnitte aus der Schneidekammer, sobald sie geschnitten sind, und legen Sie sie in eine Schnitt-Inkubationskammer, die kontinuierlich mit einem Gasgemisch aus 95 % Sauerstoff und 5 % Kohlendioxid versorgt wird, bei einer Temperatur von etwa 32 Grad Celsius in einem warmen Wasserbad für eine bis zwei Stunden. Fahren Sie fort, Schnitte herzustellen und in die Inkubationskammer zu legen. Wenn die Schnitte während des Schneidens anfangen, sich aufzurollen, verringern Sie die Geschwindigkeit, mit der sich das Messer vorwärts bewegt.Unter Verwendung eines vertikalen Ziehgeräts Glaspipetten herstellen. Es wird eine gleichmäßig zugespitzte Spitze mit einer Öffnung von 0,1 Millimetern empfohlen. Anschließend die Pipetten mit Sard 180 4 beschichten, um die Kapazität zu verringern.Verwenden Sie dann eine Heißluftpistole, um die mit Silikon versiegelten Spitzen auszuhärten. Geben Sie eine kleine Menge Lucifer Yellow zu einem aufgetauten 0,5-Milliliter-Aliquot der intrazellulären Lösung hinzu und setzen Sie sie dem Ultraschall aus. Die Lösung sollte gelb erscheinen.Füllen Sie die Pipette mit der gelben intrazellulären Lösung. Dies ermöglicht die Sichtbarmachung der Pipettenspitzen unter Verwendung eines GFP-Filters während des Clamp-Aufzeichnungsverfahrens. Nach einer Inkubationszeit von einer bis zwei Stunden entnehmen Sie eine Schnittstelle aus der Inkubationskammer und überführen sie in die Ablesekammer.Laden Sie die mit Lucifer Yellow intrazellulär gefüllten Pipetten in die Pipettenhalter für jede Kopfstufe. Befestigen Sie dann an jeden Pipettenhalter eine leere Dreimilliliterspritze mit einem Stück Schlauch. Diese werden verwendet, um positiven Druck auszuüben, um das Verstopfen der Pipetten während des Verfahrens zu verhindern.Unter Verwendung des GFP-Filters die Pipettenspitzen visualisieren. Sicherstellen, dass die Schnittpräparation mehr als vier Neuronen aufweist, die für die Ableitung geeignet sind. Ein Neuron von guter Qualität hat annähernd eine Birnenform. Sehr runde Neuronen sowie geschrumpfte Neuronen befinden sich im Allgemeinen im Sterbeprozess. Wählen Sie zwei Neuronen zur Ableitung aus; die ausgewählten Neuronen liegen oft auf unterschiedlichen Ebenen des Schnitts. Stellen Sie mithilfe der Computersoftware den Axoklamm-Verstärker so ein, dass Strominjektionsimpulse durchgelassen werden.Danach mit einem Mikromanipulator die erste Pipette über die größte Oberfläche des Neurons positionieren, also am tiefsten im Schnitt, und die zweite Pipette an dem oberflächlicher liegenden Neuron. Dies verhindert, dass die Positionierung der zweiten Pipette die Position der ersten Pipette verändert. Da sich der Schnitt leicht in der vertikalen Ebene bewegen kann, während die Pipetten in den Schnitt eindringen, senken Sie als Nächstes die erste Pipette auf das erste Neuron ab und geben Sie sofort positiven Druck über die Spritze auf.Der positiven Druck erzeugt eine kleine Delle auf der Oberfläche der Zelle. Sobald die erste Pipette positioniert wurde, kehren Sie zur Oberseite der Ableitungskammer zurück und senken Sie die zweite Ableitungspipette erneut in Position, wobei Sie mit der Spritze positiven Druck aufbringen. Sobald beide Pipetten positioniert sind, verschließen Sie das erste Neuron, indem Sie die Spritze entfernen, um den positiven Druck abzulassen.Membranen gesunder Neuronen haften an der Pipette. Anschließend unter Verwendung eines geringen Mundsaugdrucks ein negatives Potential anlegen, um eine Dichtung mit dem geeigneten Widerstand zu bilden. Falls keine Dichtung erfolgreich zwischen der Pipette und dem Neuron erzeugt wird, das Mikroskopobjektiv und die Pipette von der Schnittfläche nach oben zur Perfusionsspitze bewegen.Ersetzen Sie die verwendete Pipette durch eine saubere Pipette. Nachdem die Pipette gewechselt wurde, kehren Sie zur Schnittstelle zurück und erzeugen Sie mit der neuen Pipette eine Dichtung. Sobald eine lockere Dichtung auf der Grundlage des Widerstands hergestellt wurde, beenden Sie die Strominjektionsimpulse vom Axo-Clamp zum Verstärker.Platzieren Sie die Axo-Klemme als Verstärker in Reihe mit dem AM-Systems-3000-Verstärker, sodass das Ausgangssignal des OC-Klemmen-2-B-Verstärkers als Eingangssignal für den AM-Systems-3000-Verstärker dient. Letzterer Verstärker liefert das Signal für die Datenerfassung. Stellen Sie anschließend eine Dichtung für das zweite Neuron her und konfigurieren Sie die Verstärker neu.Sobald die Dichtungen mit beiden Pipetten hergestellt wurden, beginnen Sie unmittelbar mit der Messung von Aktionspotentialen durch Datenaufnahme. Lucifergelb wurde ausschließlich verwendet, um die Visualisierung zur Demonstration der Doppelaufnahmetechnik zu verbessern. Allerdings ist Lucifergelb für Neuronen toxisch und verändert die Inaktivierung von Natriumströmen, die dem Aktionspotential zugrunde liegen, wenn man die Dichtungen sprengt, um die Neuronen zu füllen.Daher wird in unserer Methode Alexa 568 in Experimenten nach der Aufzeichnung verwendet, bei denen die Membran durchbrochen werden kann, um Neuronen mit Alexa 568 zur anschließenden Histologie zu füllen. Die in diesem Video vorgestellte Methode der Zell-angehefteten Ableitung wurde durch simultane traditionelle Ganzzell-Ableitung und Zell-angeheftete Ableitung von Gonadotropin-freisetzenden Hormon-Neuronen validiert. Wie hier gezeigt, besteht eine vollständige Übereinstimmung zwischen den Aktionspotentialen in der zell-angehefteten Ableitung und der Ganzzell-Ableitung sowohl während langsamen spontanen Feuerns als auch während wiederholten Feuerns.Im linken Bereich sind die Antworten sowohl in der Zell-angehefteten als auch in der Ganzzell-Ableitung auf eine Anwendung einer niedrigen Frequenz simulierter Aktivierung von AMPA-Typ-Rezeptoren dargestellt. Beachten Sie, dass jedem Aktionspotential in der Zell-angehefteten Ableitung ein entsprechendes Aktionspotential in der Ganzzell-Aufzeichnung zugeordnet ist. Der rechte Bereich zeigt die Reaktion des Neurons auf einen hochfrequenten Burst simulierter Aktivierung von AMPA-Typ-Rezeptoren an, wie durch die gestrichelte Linie angegeben.Beachten Sie die Zunahme der Aktionspotentialfrequenz, die sowohl in der Aufzeichnungskonfiguration im Zell-angehefteten Modus als auch in der Ganzzell-Aufzeichnungskonfiguration in Reaktion auf den stimulierten Eingabesprung detektiert wurde. Die Spur G vergrößert den Zeitmaßstab des in D unterhalb der gestrichelten Linie gezeigten Aufzeichnungsabschnitts, wenn die Aktivierungsfrequenz simulierter AMPA-Typ-Rezeptoren erhöht wird. Schließlich besteht Übereinstimmung zwischen den Aufzeichnungen im Zell-angehefteten und im Ganzzell-Modus, wenn ein depolarisierender Strominjektionsimpuls angewendet wird, um die Neuronenzelle zur Ausschüttung von Aktionspotentialen zu veranlassen.Dieses Panel zeigt die Reaktion eines A-G-N-R-H-Neurons auf einen Strominjektionsimpuls in der zellangehefteten Ableitungskonfiguration und in der Ganzzell-Ableitung. Die Einlage in der mittleren Spur vergrößert die Wellenform des detektierten Aktionspotentials. Beachten Sie, dass jedem detektierten Aktionspotential in der zellangehefteten Konfiguration ein entsprechendes, in der Ganzzell-Ableitungskonfiguration detektiertes Aktionspotential zugeordnet ist.Wir haben Ihnen gerade gezeigt, wie man duale somatische Ableitungen in hypothalamischen Schnitten durchführt, wenn man dieses Verfahren anwendet. Es ist wichtig zu bedenken, dass dies Übung erfordert. Das war's also.Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.

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