Name: PuraMatrix Encapsulation of Cancer Cells (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-12-17T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 8 s
Description: Lernen Sie die Kapselung von CAR5-Eierstockkrebszellen in PuraMatrix, einem selbstassemblierenden Peptidgel. Diese 3D-Kulturmethode ermöglicht realistischere in-vivo-Bedingungen für die Krebsforschung.

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Technische Hinweise: <ul><li> Die Gelierung wird durch die Zugabe von Salzen initiiert. Daher ist es entscheidend, dass keine Salze in Kontakt mit PuraMatrix kommen, bis Gelierung gewünscht wird; Exposition gegenüber Salzen sehr niedriger Ionenstärke (zB &lt;0,05 M) wird irreversiblen Gelierung führen. </li><li> Restbestände Lösungen, die bereit sind, können zu einem späteren Zeitpunkt, sofern sie nicht in Kontakt mit Salzen kommen, verwendet werden. Sie brauchen nicht zu wiederholen, Beschallung sorgen. </li><li> Luftblasen entfernt Aliquotierung PuraMatrix in sterilen Röhrchen durch Zentrifugation gefolgt werden. </li><li> Seien Sie sehr vorsichtig bei der Medien ändert sich wie Aspiration leicht stören können die PuraMatrix Bett. </li></ul> Materialien: BD PuraMatrix RAD16 Peptide Hydrogel-1% (Kat. Nr. 354250): Die gesamte Peptid-Konzentration der unverdünnten Mischung 10 mg / ml. <ul><li> Wasser Ultraschallbad oder Vortex </li><li> 96-well Zellkulturschale </li><li> Zellkulturmedien </li><li> Sterilfiltriert H 2 O </li><li> Steriles gefiltertes 20% Saccharose </li><li> Cells (alle bei 5.000 Zellen / Well): OVCAR-5 </li></ul> Alle Schritte müssen unter aseptischen Bedingungen durchgeführt werden. Vorgehensweise: <ol><li> Mit Ultraschall die 1%-PuraMatrix (RAD16) in einem Wasserbad Sonicator für 30 Minuten, um die Viskosität vor zu reduzieren, um zu verwenden. </li><li> Die 1% PuraMatrix Lösung kann nun in sterilen Röhrchen aliquotiert werden, um zukünftige Experimente zu vereinfachen. <ol class="lalpha"><li> Vermeiden Sie die Bildung von Luftblasen, wenn sie bilden einfach Spin-Down der sterilen Röhrchen PuraMatrix bei 1000 rpm (300 xg) für 5 Minuten. </li><li> Die gesamte Peptid-Konzentration der unverdünnten Mischung 10 mg / ml. </li></ol></li><li> Zwei Sätze von 4 Bohrungen werden auf 2,5 mg / ml und 1,25 mg / ml Gesamt-Peptid-Konzentration bzw. beschichtet werden. </li><li> Verdünnen Sie die PuraMatrix in jede Vertiefung mit 0,2 mu m sterilfiltriert 20% Saccharose und 13,3% Saccharose zu insgesamt Peptid-Konzentrationen von 5 mg / ml und 2,5 mg / ml eingestellt, jeweils mit einer Konzentration von 2x BD PuraMatrix in 10% Saccharose zu erreichen. <ol class="lalpha"><li> To Make 20% Saccharose, verdünnte 10 g Saccharose, dann ein Volumen von 50 ml Wasser. </li><li> 13% und 10% Saccharose kann durch Verdünnen der 20% Stammlösung hergestellt werden. <ol class="lroman"><li> 13% Saccharose (je 10 ml): 6,5 ml 20% Saccharose + 3,5 ml sterilem H 2 O. </li><li> 10% Saccharose (je 10 ml): 5,0 ml 20% Saccharose + 5,0 ml sterilem H 2 O. </li></ol></li></ol></li><li> Bereiten Sie einen Master-Mix von PuraMatrix Peptids auf die Anzahl der Bohrlöcher Sie beabsichtigen, Platte basiert. (Siehe Beispiel unten.) Dann Aliquot in einzelne Röhrchen mit 25 ml des Master-Mix. <ol class="lalpha"><li> Der Master-Mix sollte auf das Doppelte der gewünschten Endkonzentration von insgesamt Peptid hergestellt werden, wie es mit dem gleichen Volumen von Zellen während der Beschichtung verdünnt werden. <img src="/files/ftp_upload/1692/1692_fig11.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"></li></ol></li><li> Bereiten Zellsuspensionen von trypsinizing Zellmonolayer Zellkulturen. <ol class="lalpha"><li> 2 ml 0,05% Trypsin EDTA kann für jede T-75 Fläschchen verwendet werden. </li></ol></li><li> Neutralisieren des Trypsins durch Zugabe von Zellkulturmedium mit 10% Hitze-inaktiviertem fetalem Rinderserum (mind. 2 ml Medium pro ml Trypsin in den vorherigen Schritt.) </li><li> Zentrifugieren Sie die Zellen bei 1000 rpm (~ 300 xg) für 5 Minuten, um sich ein Zellpellet zu schaffen. <ol><li> Resuspendieren der Zellen in 10% sterilfiltriert Saccharose. </li><li> Zählen Sie die Zellen und Spin-down wieder bei 1000 Umdrehungen pro Minute (~ 300 xg) für 5 Minuten, um Spuren von Salz in den Medien gefunden zu entfernen. </li></ol></li><li> Resuspendieren OVCAR-5-Zellen in 10% Saccharose bei 2,0 x 10 5 Zellen / ml, so dass die endgültige Zellzahl pro Well werden 5.000 Zellen werden in jede Vertiefung. Die folgenden Schritte sollten zügig durchgeführt werden. </li><li> Add 25 ul des 2,0 x 10 5 Zellen / ml Suspension zum ersten Individuum Röhrchen mit 25 ul des Master-Mix aus PuraMatrix wie in den oben schematisch dargestellt. <ol class="lalpha"><li> Schnell durch Pipettieren (~ 5 mal rauf und runter) Mischung in die Röhre, ohne dabei Luftblasen. </li><li> Dann Pipette die 50 ul Zellsuspension / PuraMatrix Mischung in die entsprechende Vertiefung einer 96-Well-Schale. </li><li> Initiieren Gelierung der BD PuraMatrix durch vorsichtiges Pipettieren 150 ul Zellkulturmedien (RPMI + 10% FBS) an der Seite des Brunnens <img src="/files/ftp_upload/1692/1692_fig12.jpg" alt="Abbildung 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"></li></ol></li><li> Wiederholen Sie die Schritte in 8 dargestellt, bis alle Vertiefungen haben vergoldet worden. </li><li> Nach 30 Minuten ganz sanft zu entfernen ~ 2 / 3 der Medien mit einer 200 ul Pipette auf den pH-Wert des Hydrogels Gleichgewicht zu bringen. <ol class="lalpha"><li> DO NOT USE A VACUUM Aspirator AS THIS THE MATRIX gestört werden </li><li> Setzen Sie die Pipettenspitze in den Brunnen, so dasses berührt nicht die PuraMatrix Bett und entfernen Sie vorsichtig Medien aus dem Brunnen. </li><li> Es sollte darauf geachtet werden, nicht stören die Matrix während der Kultivierung von Zellen in PuraMatrix werden. </li></ol></li><li> Sehr vorsichtig Fügen Sie 150 ml frisches Zellkulturmedium auf der Seite der auch mit mehreren Zellen in PuraMatrix gekapselt. </li><li> Ändern Sie den Zellkulturmedien in jede Vertiefung alle 48 Stunden mit frischem Kulturmedium durch vorsichtiges Wiederholung der Schritte 10 und 11. </li></ol> Repräsentative Ergebnisse: <img src="/files/ftp_upload/1692/1692_fig1tmb.jpg" alt="Abbildung 1" border="0" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. OVCAR-5-Zellen eingekapselt wie in dem oben beschriebenen Protokoll. Die Bilder wurden mit einem inversen Olympus FV1000 Mikroskop mit Spectra-Physics DeepSee Ti ausgestattet: Saphir-Lasers abgestimmt, um 750 nm. Imaging-Sitzungen wurden an den Tagen 1, 3, 5 und 7 post-Beschichtung durchgeführt. Ein langer Arbeitsabstand, Wasser getaucht 40x (Olympus LUMPLFLN 0,8 NA) wurde zu Bild durch die PuraMatrix verwendet. Dreidimensionale Volumina wurden durch den Erwerb von Bildstapel in 1,47 um axiale Schritte gesammelt. Zwei nicht-descanned Detektoren gesammelt die Autofluoreszenz-Emission mit Violett (440-490 nm) und Grün (510-550 nm) Bandpass-Filter. Die endgültigen Bilder und Tiefe Stapel Filme wurden unter Verwendung ImageJ durch die Kombination beider Detektionskanäle. Bitte <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1692/1692_fig1.jpg">klicken Sie hier,</a> um eine größere Version der Abbildung 1 zu sehen.

<ol><li>Gelain, F., Bottai, D., Vescovi, A., Zhang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designer+self-assembling+Peptide+nanofiber+scaffolds+for+adult+mouse+neural+stem+cell+3-dimensional+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Designer self-assembling Peptide nanofiber scaffolds for adult mouse neural stem cell 3-dimensional cultures.</a> PLoS One. 1, e119-e119 (2006).</li>
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puramatrix encapsulation of cancer cells

PuraMatrix Encapsulation of Cancer Cells

Zunehmende Hinweise darauf, dass Kultivierung von Krebszellen in drei Dimensionen genauer rekapituliert die Komplexität der Tumorbiologie. Viele dieser Modelle verwenden rekonstituierte Basalmembran von Tieren, die eine variable Menge von Wachstumsfaktoren und Zytokine, die das Wachstum dieser Zellkultur-Modellen beeinflussen können enthalten abgeleitet. Hier beschreiben wir im Detail die Herstellung und Verwendung von PuraMatrix, ein im Handel erhältliches Selbstmontage Peptid-Gel, das frei von tierischen Materialien und Erregern zu kapseln und zu propagieren Ovarialkarzinom-Zelllinie, OVCAR-5 ist. Wir beginnen mit einer Beschreibung, wie die PuraMatrix vor vorbereiten zu bedienen. Als nächstes zeigen wir, wie man richtig mischen PuraMatrix und Zellsuspension zu den Zellen in das Hydrogel kapseln. Nach der Zugabe von Zellkulturmedien oder Injektion in einer physiologischen Umgebung, die Peptid-Komponente von PuraMatrix schnell selbst montiert in ein 3D-Hydrogel, das im Nanometer-Maßstab faserige Struktur mit einer mittleren Porengröße von 5-200 nm aufweist<sup&gt; 1</sup&gt;. Darüber hinaus zeigen wir, wie man Kulturen in gekapselten PuraMatrix gewachsen zu propagieren. Wenn in PuraMatrix gekapselt, montieren OVCAR-5-Zellen in dreidimensionale acinar Strukturen, die stärker die Morphologie der mikrometastatischen Knötchen in der Klinik als Monolayer in vitro-Modellen beobachtet ähneln. Mit der konfokalen Mikroskopie illustrieren wir das Erscheinungsbild der repräsentativen OVCAR-5-Zellen in PuraMatrix am Tag 1, 3, 5 und 7 nach der Beschichtung verkapselt. Die Verwendung von PuraMatrix zur Kultur Krebszellen sollen zu einem besseren Verständnis der Erkrankung und es uns ermöglichen, Ansprechen auf die Behandlung in mehr klinisch prädiktive Modell-Systemen zu beurteilen.

Dieses Video zeigt, wie Sie kapseln und Kultur Krebszellen in PuraMatrix, ein im Handel erhältliches Selbstmontage Peptid-Gel.

Zunehmende Belege deuten darauf hin, dass die Kultivierung von Krebszellen in drei Dimensionen die Komplexität der Tumorbiologie genauer widerspiegelt. Viele dieser ...

Eindimensionale Zellkultursysteme haben sich als sehr nützliche Werkzeuge zur Untersuchung verschiedener Krankheiten, einschließlich Krebs, erwiesen. Diese Modelle können jedoch die dreidimensionale Umgebung, die in vivo beobachtet wird, nicht nachbilden. In diesem Video wird die Verwendung von reinem Matrixx gezeigt, einem im Handel erhältlichen, selbstassemblierenden Peptidgel, das zur Einschließung und Vermehrung der Ovarialkarzinomzelllinie CAR fünf dient.Die Zellsuspension wird mit dem reinen Matrixx und Zellkultur gemischt. Medium wird hinzugefügt, um die Aktivierung des reinen Matrixx zu initiieren, wenn es in reinem Matrixx eingeschlossen und kultiviert wird, wobei Carv-fünf-Zellen zu 3D-ASIN-R-Strukturen assemblieren, die der Morphologie von mikrometastatischen Knötchen ähneln. Hallo, ich bin Adnan Abbi.Ich bin wissenschaftlicher Mitarbeiter im Labor von Dr. TBA Hassan am Woman Center for Photo Medicine des Massachusetts General Hospital. Heute zeigen wir Ihnen ein Protokoll, wie man eine Ovarialkarzinom-Zelllinie in einer synthetischen Matrix, genannt Pure Matrix, einhüllt und kultiviert. Wir verwenden dieses Modell in unserem Labor, um die Behandlungsansprechen von Ovarialkarzinomen zu bewerten.Beginnen wir nun. Der BD 1 % reine Matrix RAD 16 Peptidhydrogel weist vor der Anwendung eine Gesamtkonzentration an Peptiden von 10 Milligramm pro Milliliter auf. Verringern Sie die Viskosität der reinen Matrix, indem Sie sie 30 Minuten lang in einem Wasserbad beschallen. Führen Sie die Beschallung unter Aufrechterhaltung steriler Bedingungen durch.Geben Sie Aliquote der 1 %igen Reinstmatrixlösung in sterile Röhrchen. Um zukünftige Experimente zu vereinfachen, vermeiden Sie die Bildung von Luftblasen; falls welche entstehen, zentrifugieren Sie die sterilen Röhrchen mit der Reinstmatrix einfach fünf Minuten lang mit 1000 U/min. In dieser Demonstration werden wir zwei Sätze mit jeweils vier Vertiefungen mit 2,5 Milligramm pro Milliliter bzw. 1,25 Milligramm pro Milliliter beschichten. Bereiten Sie entsprechend der Anzahl der zu beschichtenden Vertiefungen – in diesem Fall acht – zwei Master-Mixes aus reiner Matrix-Peptidlösung entsprechend der Gesamtpeptidkonzentration vor.Jede Master-Mix-Lösung sollte in doppelter gewünschter Endkonzentration an Gesamtpetid hergestellt werden, da sie während des Ansätzens mit einem gleichen Volumen an Zellen verdünnt wird, um die Master-Mix-Lösungen mit steriler 10 %iger Saccharose und 13,3 %iger Saccharose auf Gesamtpetidkonzentrationen von fünf Milligramm pro Milliliter bzw. 2,5 Milligramm pro Milliliter anzusetzen, um eine zweifache Konzentration an reinem Matrixx in 10 %iger Saccharose zu erreichen; anschließend 25 Mikroliter der Master-Mix-Lösungen in acht einzelne Röhrchen abfüllen. Die Master-Mix-Lösungen des reinen Matrizes sind nun bereit zur Zellverkapselung. Die Ovarialkarzinomzelllinie CAR fünf wird in diesem Experiment verkapselt und vermehrt, bevor die Zellen vor der Trypsinbehandlung mit 10 Milliliter steriler PBS ohne Calcium und Magnesium für 15 bis 20 Minuten inkubiert werden.Entfernen Sie PBS und geben Sie Trypsin zur Zellmonolayer-Zellkultur hinzu. Neutralisieren Sie das Trypsin, indem Sie Zellkulturmedium mit 10 % hitzeinaktiviertem fetalem Kälberserum hinzufügen. Verwenden Sie mindestens zwei Milliliter Medium pro Milliliter Trypsin, das im vorherigen Schritt verwendet wurde. Überführen Sie anschließend die Zellen in Zentrifugenröhrchen und zentrifugieren Sie sie bei 1000 U/min für fünf Minuten, um einen Zellpellet zu bilden.Nach der Zentrifugation resuspendieren Sie das Zellpellet in 10 % steril filtriertem Saccharose. Zählen Sie die Zellen und zentrifugieren Sie erneut mit 1000 U/min für fünf Minuten. Um Spuren von Salz, das im Medium enthalten ist, zu entfernen, resuspendieren Sie die O-car-fünf-Zellen in 10 % Saccharose bei zwei mal 10 hoch fünf Zellen pro Milliliter, sodass die endgültige Zellzahl pro Vertiefung 5.000 Zellen in jeder Vertiefung beträgt.Die Zellen sind nun bereit für die Einschließung in die Pure Matrixx. Die folgenden Schritte zur Einschließung der Zellen in die reine Matrix müssen schnell durchgeführt werden: Geben Sie 25 Mikroliter der zuvor hergestellten Zellsuspension in das erste einzelne Reagenzglas, das 25 Mikroliter der Master-Mix-Lösung aus Pure Matrixx enthält. Mischen Sie die Lösung schnell durch etwa fünfmaliges Auf- und Abpipettieren im Reagenzglas, ohne Luftblasen einzuschließen.Pipettieren Sie dann die 50 Mikroliter Zellsuspension reine Matrixx-Mischung in das entsprechende Feld einer 96-Loch-Zellkulturschale. Starten Sie die Aktivierung des BD Pure Matrix, indem Sie vorsichtig 150 Mikroliter Zellkulturmedium an die Seite des Wells pipettieren. Wiederholen Sie die Schritte zur Einschließung der Zellen für die verbleibenden Wells.Beachten Sie, dass diese Schritte schnell durchgeführt werden müssen und der gesamte Einschlussvorgang für ein Well abgeschlossen sein sollte, bevor mit dem nächsten begonnen wird. Nachdem alle acht Wells beimpft wurden, inkubieren Sie die Zellen 30 Minuten lang. Nach 30 Minuten geben Sie mit einer 200-Mikroliter-Pipette die Pipettenspitze in das Well, sodass sie das reine Matrixbett nicht berührt, und entfernen vorsichtig das Medium aus dem Well. Etwa zwei Drittel des Mediums müssen entfernt werden, um den pH-Wert des Hydrogels auszugleichen.Verwenden Sie keinen Vakuumaspirator, da dies die Matrix stören würde. Geben Sie anschließend sehr vorsichtig 150 Mikroliter frisches Zellkulturmedium an die Seite des Wells, das Zellen in reiner Matrixx eingeschlossen enthält. Entfernen Sie auf die gleiche Weise wie zuvor zwei Drittel des Mediums und geben Sie frisches Medium zu den verbleibenden Wells hinzu.Ersetzen Sie das Zellkulturmedium in jedem Well alle 48 Stunden durch frisches Kulturmedium. Ocar fünf Zellen wurden wie im weiteren Verlauf gezeigt eingekapselt. Repräsentative 3D-Darstellungen von Bildern der OR-fünf-Zellen, die in reiner Matrix an den Tagen 1, 3, 5 und sieben eingekapselt und kultiviert wurden, sind dargestellt.Wir haben Ihnen soeben gezeigt, wie man die Ovarialkarzinom-Zelllinie CAR fünf in einer Kultur in eine synthetische Matrix namens Pure Matrixx einschließt. Bei Verwendung von Pure Matrixx ist es wichtig zu beachten, dass dieses Protokoll für die O-Car-fünf-Zelllinie optimiert wurde. Jeder Forscher muss das Protokoll für seine spezifische Zelllinie optimieren und feinabstimmen.Und denken Sie daran, bei Mediumwechseln ist es sehr wichtig, das Matrixbett nicht zu stören, da es sehr empfindlich ist; niemals aspirationieren und immer eine Pipette verwenden. Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.

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Forschung

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Biologie

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