Name: Cerebral Blutoxygenierung Messung auf Sauerstoff-abhängige Quenching der Phosphoreszenz Based (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-04T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 58 s
Description: Erfahren Sie die Messung der Sauerstoffspannung in der Hirnmikrovaskulatur bei Ratten und Mäusen mittels sauerstoffabhängiger Phosphoreszenzlöschung. Diese bildgebenden Verfahren ermöglichen die Untersuchung von Sauerstofflieferung und -verbrauch im Gehirn.

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Wir möchten Unterstützung von US-amerikanischen National Institutes of Health gewährt R01NS057476, P50NS010828, P01NS055104, R01EB000790, K99NS067050, R01HL081273 und R01EB007279 und American Heart Association gewähren 0855772D anzuerkennen.

1. Großes Sehfeld Bildgebung von pO2 in kortikalen Gefäße der Ratte <ol><li> Ratten (250 g -350 g) werden zunächst mit Isofluran betäubt, und die Arteria und Vena femoralis sind katheterisiert auf Herzfrequenz, Blutdruck und Blutgase, sowie für intravenöse Infusion zu überwachen. Die Körpertemperatur ist bei 37 ± 0,1 ° C. Tracheotomie durchgeführt wird, und Ratten sind mit einer Mischung aus Luft und Sauerstoff belüftet. </li><li> Blutproben zur Messung der Blutgase sind alle 30-45 min genommen und Beatmung und Anästhesie werden angepasst, um die Blutgase innerhalb der normalen physiologischen Bereich zu halten. </li><li> Ein geschlossener Schädel-Fenster auf dem Scheitelbein 4 mm x 4 mm groß ist für die Bildgebung vorbereitet. Die Knochen und Dura entfernt und die kraniale Fenster ist mit 1,5% Agarose gefüllt und mit einem Mikroskop Deckglas. Eine zusätzliche 1 mm 2 Bohrloch auf dem Stirnbein wird verwendet, um CSD durch intrakortikale Mikroinjektion von KCl (~ 10 ul 1 M) zu induzieren. Extreme Vorsicht ist geboten, um eine Beschädigung der kortikalen Gefäße zu vermeiden. Überschüssige Wärme, mechanische Druck-oder kurzen Zeitraum von Hypoxie kann Bluthirnschranke und zu Undichtigkeiten des Farbstoffes aus dem Gefäßsystem Kompromiss in interstitiellen Raum. </li><li> Eine Maske aus optisch opaken Material ist rund kranialen Fenster platziert. Der Zweck der Maske wird auf Phosphoreszenz Signal, das aus dem Farbstoff, der in das Gewebe von den Rändern der Dura Sache durchgesickert kommt zu absorbieren. Der Farbstoff in den interstitiellen Raum ist die Quelle des sehr hellen Phosphoreszenz, dass die Messung verderben können. Die erhöhte Helligkeit des Farbstoffs in interstitiellen Raum ist das Ergebnis der Aufbau des Farbstoffes in einer Umgebung mit niedrigem Sauerstoffgehalt Druck und niedrigen Abkühlgeschwindigkeit. Der Schaden des Gefäßsystems in Experiment ist daher leicht durch Auftreten von hellen Flecken Phosphoreszenz, in welchem ​​Fall die experimentellen Daten abgelehnt wird anerkannt. </li><li> Nach Abschluss der Operation wird Isofluran eingestellt und Anästhesie ist die Chloralose (50 mg / kg iv Bolus von 40 mg / (kg h) Infusion) eingeschaltet. </li><li> Tier ist auf einem Wagen mit Ventilator, Blutdruck und Temperatur überwachen übertragen. Während die Atmung der Raumluft, wird das Tier schnell auf die Bildgebung Setup verschoben und wieder an den Durchflussmesser mit entsprechenden Gemisch aus Luft und Sauerstoff. </li><li> Die stereotaktischen Rahmen, dass das Tier hält, ist unter dem Ziel gestellt. Der kraniale Fenster in das Sichtfeld unter das Ziel zentriert und parallel zur Bildebene positioniert. </li><li> Der gepulste Laser wird eingeschaltet und auf minimale Pulsenergie. Der Lichtstrahl ist auf Pulsenergie Meter und Pulsenergie geliefert, um die Probe gerichtet wird angepasst, um nicht mehr als 10 mJ / cm 2. Der Strahl iss auf dem kranialen Fenster mit schrägen Einfallswinkel von ~ 60 Grad und Laser iss zentriert ausgeschaltet. </li><li> Blut-Gas-Messungen und Einstellungen der Lüftungs-und Anästhesie durchgeführt werden, bis alle physiologischen Parameter des Tieres wurden im Rahmen der normalen physiologischen Bereich. </li><li> Unter der Annahme, dass das Blut liegt bei rund 7% des Körpergewichts, eine angemessene Höhe der Phosphoreszenz Sonde Oxyphor R3 in 1 ml Kochsalzlösung auf 4 x 10 -5 M Konzentration im Blut der Sonde zu erreichen, ist aufgelöst. Die Sonde Lösung wird über die Vena femoralis injiziert. </li><li> Eine 1 M Lösung von Kaliumchlorid ist vorbereitet und ~ 1 ul ist mit der Spritze durch das Bohrloch auf dem Stirnbein injiziert, um CSD zu induzieren. </li><li> Der Laser wird eingeschaltet und Bildgebung ist unmittelbar nach der Injektion der KCl-Lösung gestartet. Imaging der Phosphoreszenz wird während ca. 10 min durchgeführt. </li><li> Ein weiterer Blut-Gas-Messung durchgeführt, um zu bestätigen, dass tierische physiologische Parameter noch im normalen Bereich. </li><li> Phosphoreszenz Lebensdauern sind für alle Pixel durch Anpassung der einzelnen exponentiellen mit nichtlinearen quadratischen Fitting mit statistischer Gewichtung in Matlab erhalten. Phosphoreszenz Lebensdauern sind die pO2-Werte mit einer empirischen Stern Volmer-like-Beziehung (siehe unten) umgewandelt. </li></ol> 2. Hochauflösende Zwei-Photonen-Imaging-pO2 in kortikalen micro Gefäßsystem der Maus <ol><li> Mäuse sind narkotisiert mit isofluorene und Femoralarterie wird katheterisiert, um die Herzfrequenz, Blutdruck und Blutgase, sowie für die Verwaltung des Farbstoffes zu überwachen. Die Körpertemperatur ist bei 37 ± 0,1 ° C und Tiere sind spontan atmenden ein Gemisch aus Luft und Sauerstoff. </li><li> Ein Schädel-Fenster wird nach ursprünglich von David Kleinfeld und Winfried Denk entwickeltes vorbereitet. Ein guter sollte darauf geachtet werden, um Schäden des Gefäßsystems zu vermeiden, um ein Auslaufen des Farbstoffs in interstitiellen Raum zu verhindern. </li><li> Ein paar Blutproben zur Messung der Blutgase während eines ganzen Vorbereitung Verfahrens getroffen und Beatmung und Anästhesie werden angepasst, um die Blut-Gas haltenes innerhalb der normalen physiologischen Bereich. </li><li> Das Tier ist es, die bildgebenden Einrichtung verlegt. Eine modifizierte stereotaktischen Rahmen, dass das Tier hält, ist unter dem Ziel gestellt. Der kraniale Fenster in das Sichtfeld unter der Olympus 4X Ziel zentriert und parallel zur Bildebene positioniert. </li><li> Ein Bild von der Schädelbasis Fenster wird mit der Digitalkamera durch die Okulare genommen, und die 4X Ziel ist es, mit der Olympus 20fach Objektiv (NA = 0,95) ersetzt. </li><li> Blut-Gas-Messungen und Einstellungen der Lüftungs-und Anästhesie durchgeführt werden, bis alle physiologischen Parameter des Tieres innerhalb einer normalen physiologischen Bereich liegen. </li><li> Unter der Annahme, dass das Blut liegt bei rund 7% des Körpergewichts, eine angemessene Höhe der Phosphoreszenz Sonde PtP-C343 ist in 0,2 ml Kochsalzlösung, um ~ 15 nM Konzentration im Blut der Sonde zu erreichen aufgelöst. Die Sonde Lösung wird über die Femoralarterie injiziert. </li><li> Beginnen Sie das Experiment, indem Sie die gewünschte Zeitintervall für Farbstoff Anregungs-und Emissions-Sammlung an jedem Pixel. </li><li> Erwerben Sie eine Umfrage scannen, die eine langsame 2-dimensionalen Raster-Scan der Phosphoreszenz Intensitätsschwankung, dass das Gefäßsystem Struktur auf der aktuellen Tiefe anzeigt. Das Ziel ist senkrecht zur Schädelbasis Fenster verschoben (Z-Achse) und langsame 2D-Umfrage Scans Phosphoreszenzintensität werden mithilfe des minimal Laserleistung bei 840 nm, die Mikrogefäßen in der Bildebene zu finden. </li><li> An jedem bildgebenden Tiefe, auf die Umfrage-Scan der Phosphoreszenz in dieser Tiefe basieren, sind eine Reihe von Punkten im Gefäßsystem gewählt, und die Aufnahme der Phosphoreszenz zerfällt in jedem Punkt ist für eine vorgegebene Anzahl von durchschnittlich wiederholt. </li><li> Stellen Sie die gewünschte Menge an Mittelung, Messintervall und Experiment Dauer und die Messung gestartet. pO 2-Messungen werden an den ausgewählten Orten an der angegebenen Messintervall für die Dauer des Experiments erworben. </li><li> Während der Messungen die Software erneut leitet die Anregungslasers zu den ausgewählten Orten durch Veränderung der Position des Galvanometers Scanspiegel. Die Steuerung der Galvanometer-Scannern, elektro-optische Modulator, und alle anderen Geräte werden von den Kunden zugeschnittene Software in LabView durchgeführt. </li><li> Phosphoreszenz Lebensdauern sind für alle ausgewählten Punkte durch Anpassung der einzelnen exponentiellen mit nichtlinearen quadratischen Einbau in Matlab erhalten. Phosphoreszenz Lebensdauern sind die pO2-Werte mit einer empirischen Stern Volmer-like-Beziehung (siehe unten) umgewandelt. </li><li> Nach dem Sammeln der Daten in verschiedenen kortikalen Tiefen, injizieren Dextran-konjugierten Fluorescein in Gefäßen für die Abbildung der Mikrovaskulatur Struktur. </li><li> Besorgen Sie sich einen Stapel von strukturellen Bilder des Gefäßsystems, indem Sie die Zwei-Photonen-Imaging von FITC-Fluoreszenz mit einem grünen Kanal in der Vier-Kanal-Detektor. </li><li> Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien und Vorschriften her von Massachusetts General Hospital Unterausschuss für Forschung Animal Care Set durchgeführt. </li></ol> 3. Repräsentative Ergebnisse: <img src="/files/ftp_upload/1694/1694fig1.jpg" alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Panel (a) auf der linken Seite dieser Figur zeigt ein weites Sichtfeld Bild von Sauerstoff Druck vor der Ankunft eines CSD-Welle. Panel (b) auf der rechten Seite zeigt die zeitliche Entwicklung der durchschnittlichen Sauerstoffdruck während CSD Ausbreitung innerhalb der Region von Interesse auf Holz markiert (a). Abbildung 2 (AVI-Film): Dieser Film zeigt die zeitliche Entwicklung der Sauerstoff-Druck in der gesamten kranialen Fenster während der Ausbreitung der CSD-Welle. Maßstabsbalken zeigt Sauerstoffdruck in Millimeter Quecksilbersäule. <img src="/files/ftp_upload/1694/1694fig3.jpg" alt="Abbildung 3"> Abbildung 3. 3D-Projektion der abgebildeten Gefäße Stapel. Die Grautöne repräsentieren eine volumetrische Schiff Maske, erstellt auf der Grundlage der strukturellen Bildes. Gemessen pO 2-Werte sind farblich gekennzeichnet. Scale-Bar ist 200 Mikrometer. Nachdruck mit freundlicher Genehmigung der Nature Publishing Group. 7

<ol><li>Kleinfeld, D., Friedman, B., Lyden, P. D., Shih, A. Y. Targeted occlusion to surface and deep vessels in neocortex via linear and nonlinear optical absorption, Animal Models of Acute Neurological Injuries. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKleinfeld%2C+D+%22Contemporary+Neuroscience+Series%22">Contemporary Neuroscience Series</a>. Chen, J., Xu, Z., Xu, X., Zhang, J. , Humana Press Inc. (2007).</li>
<li>Mostany, R., Portera-Cailliau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Craniotomy+Surgery+Procedure+for+Chronic+Brain+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A Craniotomy Surgery Procedure for Chronic Brain Imaging.</a> J Vis Exp. , (2008).</li>
<li>Lebedev, A. Y., Cheprakov, A. V., Sakadzic, S., Boas, D. A., Wilson, D. F., Vinogradov, S. A., A, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+Phosphorescent+Probes+for+Oxygen+Imaging+in+Biological+Systems%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Materials+%26+Interfaces%22%5BJournal%5D)">Dendritic Phosphorescent Probes for Oxygen Imaging in Biological Systems.</a> Applied Materials & Interfaces. , (2009).</li>
<li>Finikova, O. S., Lebedev, A. Y., Aprelev, A., Troxler, T., Gao, F., Garnacho, C., Muro, S., Hochstrasser, R. M., Vinogradov, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen+microscopy+by+two-photon-excited+phosphorescence%5BTitle%5D)+AND+%22Chemphyschem%22%5BJournal%5D)">Oxygen microscopy by two-photon-excited phosphorescence.</a> Chemphyschem. 9, 1673-1679 (2008).</li>
<li>Sakadžić, S., Yuan, S., Dilekoz, E., Ruvinskaya, S., Vinogradov, S. A., Ayata, C., Boas, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+imaging+of+cerebral+partial+pressure+of+oxygen+and+blood+flow+during+functional+activation+and+cortical+spreading+depression%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Opt%22%5BJournal%5D)">Simultaneous imaging of cerebral partial pressure of oxygen and blood flow during functional activation and cortical spreading depression.</a> Appl Opt. 48, D169-D177 (2009).</li>
<li>Yaseen, M. A., Srinivasan, V. J., Sakadzic, S., Wu, W., Ruvinskaya, S., Vinogradov, S. A., Boas, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+monitoring+of+oxygen+tension+in+cortical+microvessels+with+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Opt+Express%22%5BJournal%5D)">Optical monitoring of oxygen tension in cortical microvessels with confocal microscopy.</a> Opt Express. 17, 22341-22350 (2009).</li>
<li>Sakadzic, S., Roussakis, E., Yaseen, M. A., Mandeville, E. T., Srinivasan, V. J., Arai, K., Ruvinskaya, S., Devor, A., Lo, E. H., Vinogradov, S. A., Boas, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+high-resolution+measurement+of+partial+pressure+of+oxygen+in+cerebral+vasculature+and+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Two-photon high-resolution measurement of partial pressure of oxygen in cerebral vasculature and tissue.</a> Nat Methods. 7, 755-759 (2010).</li>
</ol>

Wir haben gezeigt, zwei Anwendungen der pO2-Messung in kortikalen Mikrovaskulatur auf Sauerstoff-abhängigen Löschung der Phosphoreszenz basiert. Während die erste Methode auf CCD-Bildgebung bietet weites Sichtfeld Überwachung von pO2-, Mess-Partialdruck des Sauerstoffs in kortikalen Mikrovaskulatur auf 2-Photonen-Mikroskopie basieren bietet Kapillare Auflösung und ermöglicht die Abbildung in die Tiefe. Beide Methoden sorgen für hohe Geschwindigkeit und hohes Signal-Rausch-Messungen. Darüber hinaus ist die Phosphoreszenz...

<table><tbody><tr><td>Glycopyrrolat</td><td>Reagenz</td><td>American Regent Inc.</td><td>NDC 0517-4605-25</td><td>Wird zur Kontrolle von pharyngealen, trachealen und bronchialen Sekreten verwendet.</td></tr><tr><td>Lidocain HCL</td><td>Reagenz</td><td>Hospira Inc.</td><td>NDC 0409-4277-01</td><td>Wird als Lokalanästhetikum während Operationen verwendet.</td></tr><tr><td>Desfluran</td><td>Reagenz</td><td>Baxter Internationl Inc.</td><td>NDC 10019-360-40</td><td>Wird als inhalativer Anästhetikum während Operationen und als Vollnarkose bei Experimenten mit Mäusen verwendet.</td></tr><tr><td>Alpha-Chloralose</td><td>Reagenz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0128</td><td>Wird als Vollnarkose bei Experimenten mit Ratten verwendet.</td></tr><tr><td>Fluorescein-Isothiocyanat&amp;#8211;Dextran</td><td>Reagenz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>FD2000S</td><td>Wird verabreicht, um eine Konzentration von ~ 500 nM im Blut zu erreichen.</td></tr></tbody></table>

cerebral blutoxygenierung messung auf sauerstoff-abhängige quenching der phosphoreszenz based

Cerebral Blood Oxygenation Measurement Based on Oxygen-dependent Quenching of Phosphorescence

Die Überwachung der raum-zeitlichen Eigenschaften des zerebralen Blut-und Sauerstoffversorgung des Gewebes ist entscheidend für ein besseres Verständnis der neuro-metabolisch-vaskuläre Beziehung. Entwicklung neuer pO2 Messmodalitäten mit gleichzeitiger Überwachung von pO2 in größeren Sehfelder mit höherer räumlicher und / oder temporale Auflösung wird einen tieferen Einblick in die Funktionsweise des gesunden Gehirns zu aktivieren und haben auch erhebliche Auswirkungen auf die Diagnose und Behandlung von neurovaskulären Erkrankungen wie Schlaganfall, Alzheimer, und Kopfverletzungen. Optische Bildgebungsverfahren haben ein großes Potenzial, um hohe räumlich-zeitliche Auflösung und quantitative Abbildung der pO2 auf Hämoglobin-Absorption im sichtbaren und nahen infraroten Bereich des optischen Spektrums Basis bieten gezeigt. Allerdings stützt sich multispektrale Messung der zerebralen Sauerstoffsättigung auf Photonen Wanderung durch die stark streuenden Hirngewebe. Schätzung und Modellierung von Gewebe optischen Parameter, die dynamischen Veränderungen während des Experiments unterziehen können, ist in der Regel für eine genaue Schätzung der Blutoxygenierung erforderlich. Auf der anderen Seite, sollte eine Schätzung der Sauerstoff-Partialdruck (pO2) auf Sauerstoff-abhängigen Löschung der Phosphoreszenz beruht, nicht signifikant von den Veränderungen in den optischen Parametern des Gewebes beeinflusst werden und stellt ein absolutes Mass der pO2. Experimentelle Systeme, die Sauerstoff-sensitiven Farbstoffen nutzen haben in in-vivo-Studien des perfundierten Geweben sowie für die Überwachung des Sauerstoffgehaltes in Gewebekulturen, die zeigen, dass Phosphoreszenz Abschrecken ist ein potenter Technologie, mit der genauen Sauerstoff Bildgebung in der physiologischen pO2 Bereich demonstriert. Hier haben wir mit zwei verschiedenen bildgebenden Verfahren wie der Messung von pO2 in kortikalen Gefäßen auf Phosphoreszenz lifetime imaging Basis durchführen zu demonstrieren. In ersten Demonstration präsentieren wir großes Sehfeld Bildgebung von pO2 an der kortikalen Oberfläche einer Ratte. Dieses bildgebende Verfahren ist relativ einfach Versuchsaufbau auf einer CCD-Kamera und einer gepulsten grünen Laser basiert. Ein Beispiel für die Überwachung der kortikalen Spreading Depression auf Phosphoreszenz Lebensdauer Oxyphor R3 Farbstoff vorgestellt wurde. In der zweiten Demonstration präsentieren wir Ihnen eine hohe Auflösung Zwei-Photonen-Imaging-pO2 in kortikalen micro Gefäßsystem einer Maus. Der Versuchsaufbau enthält einen speziell angefertigten 2-Photonen-Mikroskop mit Femtosekunden-Laser, elektro-optischen Modulator, und Photon-Counting Photomultiplier. Wir präsentieren ein Beispiel für die Abbildung der pO2 Heterogenität in der kortikalen Mikrovaskulatur einschließlich Kapillaren, mit einem neuartigen PtP-C343 Farbstoff mit verbesserter 2-Photonen-Anregung Querschnitt. Klicken Sie hier, um den zugehörigen Artikel anzuzeigen <a href="http://www.jove.com/Details.php?ID=1731">Synthese und Kalibrierung von Phosphorescent Nanoprobes für Oxygen Imaging in biologischen Systemen.</a>

Wir präsentieren ein experimentelles Verfahren zur Messung der Sauerstoff-Partialdruck (pO2) in zerebralen Gefäßen auf Sauerstoff-abhängigen Löschung der Phosphoreszenz basiert. Tierische Vorbereitung und bildgebenden Verfahren wurden sowohl für großes Sichtfeld CCD-basierten Imaging von pO2 in Ratten und 2-Photonen-Anregung Bildgebung des pO2 bei Mäusen beschrieben.

Cerebral Blutoxygenierung Messung auf Sauerstoff-abhängige Quenching der Phosphoreszenz Based

Die Überwachung der raumzeitlichen Charakteristika der zerebralen Blut- und Gewebeoxygenierung ist entscheidend für ein besseres Verständnis der...

Hallo, ich bin Sava Saje vom Photo Migration Imaging Laboratory von David Bo im Martino Center für Biomedizinische Bildgebung am Massachusetts General Hospital. Und ich bin auch Leiter der David-Bow-Laborgruppe und komme aus demselben Labor. Heute werden wir Ihnen zwei Verfahren zur Messung der Sauerstoffspannung in der kortikalen Mikrozirkulation bei kleinen Nagetieren basierend auf der sauerstoffabhängigen Löschung von Phosphoreszenz zeigen.Wir verwenden diese Techniken in unserem Labor, um die Sauerstoffversorgung und -verbrauch unter normalen und pathologischen Gehirnzuständen zu untersuchen. Beginnen wir also. Bereiten Sie zunächst mehrere Deckgläser vor, die von optisch absorbierenden Masken aus schwarzem Isolierband umgeben sind.Die Masken sollten Öffnungen mit einem Durchmesser von etwa 3,5 Millimetern aufweisen. Diese Deckgläser dienen zum Versiegeln der kranialen Fenster, während die absorbierende Maske das Phosphoreszenzsignal jeglicher Farbstoffe blockiert, die aus den Rändern der kranialen Fenster ausgetreten sind. Bereiten Sie nun das versiegelte kraniale Fenster am Parietalbein vor.Die Einzelheiten der Vorbereitung finden sich in den von dieser Publikation referenzierten Arbeiten von Kleinfeld et al. und Masini et al. Bei dieser Vorbereitung wird die Dura mater entfernt. Stellen Sie sicher, dass die Maske alle Ränder des kranialen Fensters abdeckt.Erstellen Sie nun mit einem Zahnbohrer ein zusätzliches Bohrloch von einem Millimeter Durchmesser im Frontalbein. Dieses Loch wird später zur Induktion einer kortikalen Ausbreitungsdelle verwendet. Achten Sie darauf, die kortikale Gefäßversorgung in keinem Schritt zu beschädigen.Der Aufbau zur Bildgebung besteht aus einem gepulsten Quantel-Brilliant-YAG-Laser mit 532 Nanometern und 10 Hertz, bei dem ein kleiner Teil der Pulsenergie in eine Multimode-Faser eingekoppelt und zur Probe geleitet wird. Die Energie jedes Pulses wird zudem mit einer Photodiode abgetastet. Eine CCD-Kamera dient als Bildsensor.QE von Law Vision ist auf einer vertikalen Z-Plattform montiert. Wir verwenden ein Vierfach-Objektiv von Olympus mit einem Arbeitsabstand von 29 Millimetern. Ein Hochpassfilter mit einer Grenzwellenlänge von 650 Nanometern und eine Tubuslinse mit einer Brennweite von 100 Millimetern sind vor der Kamera montiert, während das Tier positioniert ist.Stellen Sie die Position des Objektivs ein. Stellen Sie nun den Laser auf minimale Impulsenergie ein und schalten Sie ihn ein. Messen Sie die Strahlenergie mit einem optischen Impulsenergiemessgerät und justieren Sie den Q-Schalter.Verzögerungszeit so einstellen, dass die Energie des auf die Probe abgegebenen Pulses 10 Millijoule pro Quadratzentimeter nicht überschreitet. Anschließend sicherstellen, dass alle physiologischen Parameter des Tieres im normalen physiologischen Bereich liegen. Danach eine gewichtsmäßig geeignete Menge der sauerstoffempfindlichen phosphoreszenten Sonde auflösen.Oxy vier R drei, entwickelt von Libi Dev et al., in ein Milliliter Kochsalzlösung, um eine Konzentration von 40 µmol/L im Blut zu erreichen. Injizieren Sie die Lösung langsam in die Femoralvene. Injizieren Sie nun etwa ein µL einer einmolaren Kaliumchloridlösung durch das Bohrloch im Frontalknochen, um eine kortikale Ausbreitungsdelle zu induzieren, und starten Sie die Datenaufnahmesoftware.Die Aufnahme der Phosphoreszenz sollte etwa 10 Minuten dauern. Während des Experiments werden die Phosphoreszenzbilder in Echtzeit auf dem Bildschirm angezeigt. Nach der Aufnahme sollte eine weitere Blutprobe entnommen werden, um zu bestätigen, dass die Blutgase des Tieres weiterhin im normalen physiologischen Bereich liegen.Hier sind einige repräsentative Ergebnisse der Weitfeld-CCD-Bildgebung des PO₂ während der kortikalen Ausbreitungsdelle. Die linke Seite dieser Abbildung zeigt ein Weitfeldbild des Sauerstoffdrucks vor Eintreffen einer CSD-Welle. Die rechte Seite zeigt die zeitliche Entwicklung des durchschnittlichen Sauerstoffdrucks während der CSD-Ausbreitung innerhalb des auf der linken Seite markierten interessierenden Bereichs.Dieses Video zeigt die zeitliche Entwicklung des Sauerstoffdrucks im gesamten kranialen Fenster. Während der Ausbreitung der CSD-Welle zeigt die Maßstabsleiste den Sauerstoffdruck in Millimeter Quecksilber für die Zweiphotonen-Bildgebung der Sauerstoffspannung und der kortikalen Mikrozirkulation einer Maus an. Bereiten Sie das kraniale Fenster wie in der JoVE-Artikelnummer sechs 80 beschrieben vor und führen Sie die Kanüle in die Femoralarterie ein.Zur Bildgebung verwenden wir ein 20x-Infrarot-beschichtetes Wassereintauchobjektiv von Olympus, lösen eine gewichtsmäßig geeignete Menge des Sauerstoff-empfindlichen Phosphoreszenzprobes PTPC 3 43, das von Kova et al. entwickelt wurde, in 0,2 ml physiologischer Kochsalzlösung auf und filtrieren es durch einen 2-Mikrometer-Filter. Nachdem sichergestellt ist, dass die physiologischen Parameter des Tieres im normalen physiologischen Bereich liegen, wird die PTP C3 43-Lösung langsam in die Arteria femoralis injiziert. Die Hauptbestandteile der experimentellen Anordnung sind ein Femtosekundenlaser, eingestellt auf 840 Nanometer, ein elektrooptischer Modulator, Galvanometerscanner, Olympus-Scan- und Tubuslinsen sowie ein Vierkanaldetektor mit PMTs.Ein Detektionskanal enthält sowohl eine PMT als auch einen Diskriminator. Die Photonenanzahl wird mit einer Hochgeschwindigkeits-Digitalkarte erfasst. Alle Aspekte des Experiments werden über eine in LabView und C geschriebene Software gesteuert.Beginnen Sie das Experiment, indem Sie die gewünschten Zeitintervalle für die Anregung des Farbstoffs und die Sammlung der Emission festlegen. Erwerben Sie an jedem Pixel zunächst einen Übersichtsscan, der einen langsamen zweidimensionalen Raster-Scan des Phosphoreszenzintensitätsabfalls darstellt und die Gefäßstruktur in der aktuellen Tiefe zeigt. Wählen Sie anhand des Übersichtsscans intravasale Positionen zur Messung von PO₂ aus. Während der Messungen leitet die Software den Anregungslaser durch Veränderung der Position der galvanometergesteuerten Ablenkspiegel zu den ausgewählten Positionen um.Stellen Sie die gewünschte Anzahl von Mittelungen, das Messintervall und die Versuchsdauer ein und starten Sie die Messung. Es werden zwei PO-Messungen an den ausgewählten Positionen im vorgegebenen Messintervall über die gesamte Versuchsdauer hinweg aufgezeichnet. Nach der Datensammlung an verschiedenen kortikalen Tiefen wird ein mit Dextrin konjugiertes fluoreszierendes Farbstoffmittel in das Gefäßsystem injiziert, um die Bildgebung durchzuführen.Die Struktur der Mikrovaskulatur. Erhalten Sie einen Stapel struktureller Bilder der Gefäße, indem Sie die Zweiphotonen-Bildgebung der FITC-Fluoreszenz unter Verwendung eines grünen Kanals im Vierkanaldetektor durchführen. Hier zeigen wir eine 3D-Projektion des abgebildeten Mikrovaskulatur-Stapels.Die Grautöne stellen eine volumetrische Gefäßmaske dar, die basierend auf dem Strukturbild erstellt wurde. Die gemessenen PO₂-Werte wurden farbkodiert. Die Maßstabsleiste entspricht 200 Mikrometern.Wir haben Ihnen soeben zwei Verfahren zur Messung der Sauerstoffspannung in der kortikalen Mikrozirkulation bei kleinen Nagetieren basierend auf der sauerstoffabhängigen Abklingzeit phosphoreszierender Substanzen gezeigt. Bei der Durchführung dieser Verfahren ist es wichtig, sehr saubere Gehirnoperationen durchzuführen und außerdem Schutzbrillen zu tragen, wenn mit Lasern gearbeitet wird. Das war's.Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.

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Research

Forschung

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Neuroscience

Neurowissenschaften

Wir präsentieren Prinzipien der Sauerstoff-Messungen durch Phosphoreszenz Abschrecken und Überprüfung Gestaltung der Porphyrin-basierte dendritische Nanosensoren für Sauerstoff Bildgebung in biologischen Systemen.

Synthese und Kalibrierung von Phosphorescent Nanoprobes für Oxygen Imaging in Biological Systems

Hier beschreiben wir eine Methode, um direkt zu visualisieren mikroregionale Gewebehypoxie in der Maus...

Erkennung von mikroregionale Hypoxie in Maus-Großhirnrinde Zwei-Photonen-Imaging von endogenen NADH Fluoreszenz

Wir kombinierten Frequenz-Domain-Nahinfrarot-Spektroskopie Maßnahmen der zerebralen Oxygenierung des Hämoglobins mit diffuser Korrelations-Spektroskopie Maßnahmen des zerebralen Blutflusses Index einen Index der Sauerstoff-Stoffwechsel zu schätzen. Wir testeten den Nutzen dieser Maßnahme als Nachttisch Screening-Tool, um die Gesundheit und Entwicklung des Neugeborenen Gehirns zu beurteilen.

Non-invasive optische Messung des zerebralen Metabolismus und Hämodynamik bei Säuglingen

Hypoxie-Simulation beim Menschen ist in der Regel durch das Einatmen hypoxischen Gasgemischen durchgeführt. Für diese Studie wurden Apnoen Tauchern verwendet dynamische Hypoxie beim Menschen zu simulieren. Zusätzlich physiologischen Veränderungen in Desaturierung und Wieder Sättigungskinetik wurden mit nicht-invasive Werkzeuge wie Near-Infrared-Spektroskopie (NIRS) und periphere Oxygenierung Sättigung (SpO 2) bewertet.

Ein Modell Simulieren von klinisch relevanter Hypoxie beim Menschen

Hier präsentieren wir Ihnen eine Methode, die spektroskopische Charakterisierung organischer Moleküle mittels zeitaufgelöste Photolumineszenz-Spektroskopie auf die Nanosekunden-Millisekunde Zeitskala in sauerstofffreien Bedingungen. Methoden, um effizient Sauerstoff aus den Proben zu entfernen und so zu begrenzen, Lumineszenz abschrecken werden ebenfalls beschrieben.

Zeitaufgelöste photophysikalischen Charakterisierung der Triplett-Ernte organische Verbindungen in einer sauerstofffreien Umgebung verwenden eine iCCD Kamera

Wir beschreiben die Verwendung einer neuartigen, Frequenzbereichs-Lumineszenz-Lebensdauerkamera zur Kartierung von 2D O2-Verteilungen mit optischen Sensorfolien. Das Kamerasystem und die Bildanalyseverfahren werden zusammen mit der Vorbereitung, Kalibrierung und Anwendung von Sensorfolien zur Visualisierung der O 2-Mikroumgebung in der Rhizosphäre von Wasserpflanzen beschrieben.

Lumineszenz-Lebensdauer-Bildgebung von O2 mit einem Frequency-Domain-basierten Kamerasystem

Dieses Protokoll zeigt, wie die funktionale Ruhezustandskonnektivität im menschlichen präfrontalen Kortex mithilfe eines maßgeschneiderten diffusen Korrelationsspektroskopieinstruments gemessen wird. Der Bericht behandelt auch praktische Aspekte des Experiments sowie detaillierte Schritte zur Analyse der Daten.

Cerebral Blood Flow-Based Resting State Functional Connectivity of the Human Brain using Optical Diffuse Correlation Spectroscopy

Hier wird ein Protokoll zur nicht-invasiven Überwachung der zerebralen Hämodynamik neurokritischer Patienten in Echtzeit und am Krankenbett mittels diffuser Optik vorgestellt. Insbesondere verwendet das vorgeschlagene Protokoll ein hybrides diffuses optisches System, um Echtzeitinformationen über die zerebrale Sauerstoffversorgung, den zerebralen Blutfluss und den zerebralen Stoffwechsel zu erkennen und anzuzeigen.

Echtzeit-Monitoring neurokritischer Patienten mit diffuser optischer Spektroskopie

Das Protokoll beschreibt die Hochdurchsatz-Sphäroiderzeugung für Bioprinting unter Verwendung der multiparametrischen Analyse ihrer Oxygenierung und ihres Zelltods auf einem Standardfluoreszenzmikroskop. Dieser Ansatz kann angewendet werden, um die Lebensfähigkeit der Sphäroide zu kontrollieren und eine Standardisierung durchzuführen, die für die Modellierung von 3D-Gewebe, Tumormikroumgebung und erfolgreicher (Mikro-) Gewebebiofabrikation wichtig ist.

Erschwingliche Sauerstoffmikroskopie-unterstützte Biofabrikation von mehrzelligen Sphäroiden

Dieser Artikel beschreibt die Verwendung eines neuen, schnellen optischen Bildgebungsgeräts für die makroskopische Photolumineszenz-Lebensdauer-Bildgebung von Proben mit langem Zerfall. Die Integrations-, Bildaufnahme- und Analyseverfahren werden ebenso beschrieben wie die Präparation und Charakterisierung der Sensormaterialien für die Bildgebung und die Anwendung des Imagers bei der Untersuchung biologischer Proben.

Fluoreszenzlebensdauer-Makro-Imager für biomedizinische Anwendungen

Wir beschreiben ein Protokoll zur nicht-invasiven und kontinuierlichen Messung des absoluten mikrovaskulären Blutflussindex und der Blutsauerstoffsättigung mit einem multimodalen Gerät, das auf einer diffusen Nahinfrarotoptik basiert. Anschließend bewerten wir die Stoffwechselrate des Sauerstoffverbrauchs und der reaktiven Hyperämie mit einem Gefäßverschlusstest.

Nicht-invasive Überwachung der mikrovaskulären Sauerstoffversorgung und reaktiven Hyperämie mit hybrider, diffuser optischer Nahinfrarotspektroskopie für die Intensivpflege

Erfahren Sie die Messung der Sauerstoffspannung in der Hirnmikrovaskulatur bei Ratten und Mäusen mittels sauerstoffabhängiger Phosphoreszenzlöschung. Diese bildgebenden Verfahren ermöglichen die Untersuchung von Sauerstofflieferung und -verbrauch im Gehirn.

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