Name: Ein Protokoll für die Produktion von KLRG1 Tetramer (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-01-12T16:01:00.000+00:00
Duration: 7 min 24 s
Description: Lernen Sie die Produktion von KLRG1-Tetrameren für die Analyse von Liganden mittels bakterieller Proteinexpression und IPTG-Induktion. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung immunologischer Rezeptor-Interaktionen.

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Wir danken Dr. Naidenko um Hilfe bei der Optimierung der Rückfaltung Bedingungen. Diese Arbeit wurde vom NIH Forschungsstipendium AI58181 zu Laurent Brossay unterstützt. Cindy Banh wird durch NIH NRSA F31 AI080230 unterstützt. Stephanie Terrizzi und Cindy Banh beitragen gleichermaßen zu dieser Arbeit.

Vorbereitung von Inclusion Bodies <ol><li> Impfen 4 x 500 ml Flaschen TB mit je 50 pg / ml Carbenicillin und Chloramphenicol mit einer Übernachtkultur von Bakterien Ausdruck der KLRG1 Plasmid-Konstrukt. Wenn die OD 0.6 Å erreicht bei 600 nm, mit der Zugabe von 0,4 M IPTG induziert und inkubieren Sie die Kultur für weitere 4 Stunden unter Schütteln bei 37 ° C. </li><li> Resuspendieren die geernteten Zellen in Resuspensionspuffer pH = 8,0 (50 mM Tris-HCl, 25% (W / V) Saccharose, 1 mM EDTA, 10 mM DTT). Hinweis: Pellets können in diesem Stadium eingefroren werden. </li><li> Pool nicht mehr als 60 ml der bakteriellen resuspensions in einem Polypropylen-Becher. Wenn nötig, 60 ml einstellen mit TE-Puffer pH 8,0 und rühren Mischung mit halber Geschwindigkeit. </li><li> Um Rühren zuzusetzen tropfenweise: Lysozym (final = 1 mg / ml), MgCl2 (final = 5 mm), 2 mg DNAse I in 50% Glycerin enthielt 75 mM NaCl, Triton-X100 (final = 1%), DTT ( Finale = 10 mm). </li><li> Mit Ultraschall die Lösung auf Eis für 1,5 min und Zentrifuge die Lysate bei 5.000 RPM für 10 min bei 4 ° C. <ol class="lalpha"><li> Den Überstand. </li><li> 15 ml Waschpuffer pH = 8,0 (50 mM Tris-HCl, 0,5% Triton X-100, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT). </li><li> Auf Eis, beschallen Lösung für 1,5 min, bis das Pellet vollständig resuspendiert ist. </li><li> Zentrifugieren Sie die Proben bei 5.000 RPM für 10 min bei 4 ° C. </li><li> Wiederholen Sie die Wäsche 5 mal. </li></ol></li><li> Wiederholen Sie die 5b mit Waschpuffer ohne Triton X-100, Zentrifuge und resuspendieren in 4 ml TE-Puffer. </li><li> Nehmen Sie das Nassgewicht inclusion bodies Gülle und speichern in TE-Puffer bei einer Konzentration von 30 bis 100 mg / ml. </li></ol> Rückfaltung von KLRG1 <ol><li> Machen Sie 1 L der Rückfaltung pH = 8,0 (0,4 M Arginin-HCl, 0,1 M Tris pH 8 bis 8,3, 2 mM EDTA, 0,2 mM PMSF, 3 EDTA-freie Protease-Inhibitor Tabletten, 5 mM GSH und 0,5 mM GSSG) und Chill bis 4 ° C unter Rühren. </li><li> Bereiten Sie die inclusion bodies für die Injektion in die Faltung Mischung: Es ist ideal, um 5 10 Injektionen zu machen mit jeweils 0,25 0,5 uM Konzentration, so dass die Endkonzentration des Proteins wird 2 3 uM werden. <ol class="lalpha"><li> Melt das Volumen von 50 mg inclusion bodies Gülle in 7 M GnHCl mit 10 mM β-Mercaptoethanol. </li><li> Halten Sie die inclusion bodies / GnHCl Mischung bei 37 ° C für 30 bis 40 min und Vortex alle 5 min ein vollständiges Aufschmelzen gewährleisten (Gülle wird deutlich werden, wenn sie vollständig geschmolzen). </li><li> Zentrifuge bei Höchstgeschwindigkeit für 30 min in Mikrozentrifuge bei 4 ° C und den Überstand in ein 15 ml Zentrifugenröhrchen. Leisten Sie keine der kleinen schwärzlichen Pellet zu übertragen. </li></ol></li><li> Anpassen der Lautstärke mit Injektionspuffer (3 M GnHCl, 10 mM NaAcetate, pH 4.2,10 mM EDTA). </li><li> Inject 1 ml der verdünnten inclusion bodies jede Stunde. Bei der Injektion, mit hoher Geschwindigkeit rühren, 1 ml der verdünnten inclusion bodies tropfenweise mit 2 Sekunden zwischen den einzelnen Tropfen. Wenn Injektion durchgeführt wird, bei niedriger Geschwindigkeit rühren. </li><li> Weiter über Nacht unter Rühren bei niedriger Geschwindigkeit bei 4 ° C. </li></ol> Die Konzentration der Rückfaltung Reaktionen <ol><li> Nach Millipore s Protokoll, konzentrieren sich die 1 L von pre-filtriert (0,22 um filtriert) Rückfaltung Reaktion unter Verwendung einer Amicon Rührzelle und YM10 NMWL 10K Ultrafiltrationsmembran (Millipore) auf ~ 10 ml. </li><li> Konzentrieren Sie sich auf ≤ 2 ml mit einem Centriplus YM-10 10K MWCO (Millipore). </li></ol> Reinigung von KLRG1 Tetramer <ol><li> Richten Sie die AKTAFPLC bei 4 ° C nach GE Healthcare Handbücher. </li><li> Purify das Monomer Form KLRG1 durch Größenausschlusschromatographie über eine Sephacryl S-200 16/60 hochauflösende Säule (GE Healthcare) in 20 mM HEPES und 150 mM NaCl. (Siehe Abbildung 1). </li><li> Konzentrieren Sie sich auf 1 ml mit Centriplus YM-10 10K MWCO (Millipore). </li><li> Verwenden Sie BirA Enzym gemäß Avidity s Protokoll zum KLRG1 Monomer biotinylieren. </li><li> Das freie Biotin wird durch Größenausschlusschromatographie wie in 2 eliminiert. </li><li> KLRG1 Molekül wird durch Mischen KLRG1 Monomer mit 4-fachen molaren Überschuss PE-konjugiertes Streptavidin (BD Biosciences) tetramerisieren. </li></ol> Repräsentative Ergebnisse <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1702/1702fig1.jpg"><img src="/files/ftp_upload/1702/1702fig1tmb.jpg" alt="Abbildung 1" border="0" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"></a> Abbildung 1. Representative positive Ergebnisse aus der AKTA FPLC Größenausschlusschromatographie der refolded KLRG1. Die Grafik zeigt die Trennung der Monomer (83,52 ml), Dimer (56,36 ml) und Multimer (36,26 ml) Form des refolded KLRG1. Der Peak bei 94,25 ml stellt der Puffer auszutauschen.

<ol><li>Tessmer, M. S., Fugere, C., Stevenaert, F., Naidenko, O. V., Chong, H. J., Leclercq, G., Brossay, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KLRG1+binds+cadherins+and+preferentially+associates+with+SHIP-1%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Immunol%22%5BJournal%5D)">KLRG1 binds cadherins and preferentially associates with SHIP-1.</a> Int Immunol. 19, 391-400 (2007).</li>
<li>Grundemann, C., Bauer, M., Schweier, O., von Oppen, N., Lassing, U., Saudan, P., Becker, K. F., Karp, K., Hanke, T., Bachmann, M. F., Pircher, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutting+edge%3A+identification+of+E-cadherin+as+a+ligand+for+the+murine+killer+cell+lectin-like+receptor+G1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cutting edge: identification of E-cadherin as a ligand for the murine killer cell lectin-like receptor G1.</a> J Immunol. 176, 1311-1315 (2006).</li>
<li>Ito, M., Maruyama, T., Saito, N., Koganei, S., Yamamoto, K., Matsumoto, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Killer+cell+lectin-like+receptor+G1+binds+three+members+of+the+classical+cadherin+family+to+inhibit+NK+cell+cytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Killer cell lectin-like receptor G1 binds three members of the classical cadherin family to inhibit NK cell cytotoxicity.</a> J Exp Med. 203, 289-295 (2006).</li>
<li>Li, Y., Hofmann, M., Wang, Q., Teng, L., Chlewicki, L. K., Pircher, H., Mariuzza, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+natural+killer+cell+receptor+KLRG1+bound+to+E-cadherin+reveals+basis+for+MHC-independent+missing+self+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Structure of natural killer cell receptor KLRG1 bound to E-cadherin reveals basis for MHC-independent missing self recognition.</a> Immunity. 31, 35-46 (2009).</li>
<li>Nakamura, S., Kuroki, K., Ohki, I., Sasaki, K., Kajikawa, M., Maruyama, T., Ito, M., Kameda, Y., Ikura, M., Yamamoto, K., Matsumoto, N., Maenaka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((K.+Molecular+basis+for+E-cadherin+recognition+by+killer+cell+lectin-like+receptor+G1+%28KLRG1%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">K. Molecular basis for E-cadherin recognition by killer cell lectin-like receptor G1 (KLRG1).</a> J Biol Chem. , Forthcoming Forthcoming.</li>
</ol>

In diesem Protokoll wird gezeigt, wie man zu reinigen, und Biotinylierung tetramerize KLRG1. KLRG1 Tetramer kann verwendet werden, um KLRG1 Liganden mittels Durchflusszytometrie Label sein. Obwohl Rückfaltungsbedingungen müssen empirisch für jedes Protein getestet werden, könnten auch andere C-Typ-Lektine tetramerisieren mit einem ähnlichen Protokoll. Mit tetramerisieren Proteine ​​als Sonden, Liganden zu Orphan C-Typ Lektin-Rezeptoren möglicherweise identifiziert werden.

<table><tbody><tr><td>BirA-Enzym und Puffer</td><td>Biotinylierungs-Kit</td><td>Avidity</td><td>BIRA500</td><td></td></tr><tr><td>Complete Mini Protease-Hemmnungstabletten, EDTA-frei</td><td>Reagenz</td><td>Roche Group</td><td>11 836 170 001</td><td>oder gleichwertig</td></tr><tr><td>Amicon Rührzelle</td><td>Ausstattung</td><td>EMD Millipore</td><td>Modell #8400</td><td>oder gleichwertig</td></tr><tr><td>YM10 NMWL 10K Ultrafiltrationsmembran</td><td>Filtrationszubehör</td><td>EMD Millipore</td><td>13642</td><td></td></tr><tr><td>15-ml-YM10-Konzentrator</td><td>Filtrationszubehör</td><td>EMD Millipore</td><td>4411</td><td></td></tr><tr><td>AKTAFPLC</td><td>Ausstattung</td><td>GE Healthcare</td><td>18-1900-26</td><td></td></tr><tr><td>Sephacryl S-200 16/60 Hochauflösungssäule</td><td>Ausstattung</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1166-01</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin-PE</td><td>Reagenz</td><td>BD Biosciences</td><td>554061</td><td>oder gleichwertig</td></tr></tbody></table>

ein protokoll für die produktion von klrg1 tetramer

A Protocol for the Production of KLRG1 Tetramer

Killer-Zelle Lektin-like-Rezeptor G1 (KLRG1) ist ein Typ II Transmembran-Glykoprotein inhibitorischen Rezeptor gehört zu den C-Typ Lektin-ähnliche Superfamilie. KLRG1 existiert sowohl als Monomer und als Disulfid-linked-Homodimer. Dieses gut erhaltene Rezeptor befindet sich auf der reifsten und zuletzt aktivierte NK-Zellen als auch auf eine Teilmenge von Effektor / Memory T-Zellen gefunden. Mit KLRG1 Tetramer sowie andere Methoden, E-, N-und R-Cadherine wurden als KLRG1 Liganden identifiziert. Diese Ca 2 +-abhängige Zell-Zell-Adhäsionsmoleküle besteht aus einer extrazellulären Domäne mit fünf Cadherin wiederholt für Zell-Zell-Interaktionen, eine Transmembrandomäne und eine cytoplasmatische Domäne, die an das Aktin-Zytoskelett verknüpft ist. Die Erzeugung der KLRG1 Tetramer war notwendig, um die Identifikation der KLRG1 Liganden. KLRG1 Tetramer ist auch ein einzigartiges Werkzeug, um die Rollen Cadherin und KLRG1 spielen bei der Regulation der Immunantwort und Gewebe Integrität aufzuklären.

Dieses Protokoll beschreibt die Produktion von KLRG1 Tetramer, die ein leistungsfähiges Werkzeug für die Analyse von KLRG1 Liganden ist.

Ein Protokoll für die Produktion von KLRG1 Tetramer

Der Killer cell lectin-like receptor G1 (KLRG1) ist ein inhibitorischer Rezeptor in Form eines Transmembran-Glykoproteins vom Typ II, der zur Superfamilie der C-Typ-Lektin-ähnlichen Rezeptoren gehört. ...

Hallo, ich bin Stephanie Resi aus dem Labor von Lauren Parce am Department für Molekulare Mikrobiologie und Immunologie der Brown University. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Herstellung von K LRG one-Tetrameren. In unserem Labor verwenden wir dieses Verfahren, um K LRG one-vermittelte Interaktionen zu untersuchen.Beginnen wir. Inokulieren Sie zunächst vier 500-Milliliter-Flaschen mit TB-Puffer, die geeignete Antibiotika enthalten, mit Bakterien, die den K LRG-eins-Plasmid-Konstrukt exprimieren, und kultivieren Sie bei 37 Grad Celsius unter Schütteln, bis die OD bei 600 Nanometern den Wert 0,6 erreicht. Induzieren Sie dann die Expression über den T-sieben-Promotor durch Zugabe von 0,4 molarem IPTG und inkubieren Sie die Kultur weitere vier Stunden unter Schütteln bei 37 Grad Celsius. Nach der vierstündigen Inkubation überführen Sie die Bakterien in Zentrifugenröhrchen und zentrifugieren die Kulturen 20 Minuten bei 3000 U/min und 4 Grad Celsius.Falls erforderlich können die Pellets an diesem Punkt bei minus 80 Grad Celsius eingefroren und zu einem späteren Zeitpunkt verwendet werden. Resuspendieren Sie die geernteten Zellen in 30 Milliliter Resus-Suspensionspuffer. Anschließend bakterielle Resus-Suspensionen bis zu einem Volumen von 60 Milliliter in einem Polypropylenbecher sammeln.Falls erforderlich, das Gesamtvolumen mit zusätzlichem TE-Puffer pH 8 auf 60 Milliliter auffüllen und die Mischung bei halber Geschwindigkeit auf einem Heizrührer umrühren, während die gepoolte Resus-Suspension unter Zugabe der folgenden Lösungen umgerührt wird: tropfenweise Lysozym, Magnesiumchlorid, D NS eins, TRITTON X 100 und schließlich DTT.Überführen Sie die Lösung mit einem Fisure-Dismembrator mit Ultraschallwandler bei 30 % Amplitude in Ultrazentrifugenröhrchen. Sonifizieren Sie die Lösung auf Eis für 1,5 Minuten und zentrifugieren Sie das Lysat bei 5.000 U/min für 10 Minuten bei vier Grad Celsius. Dekantieren Sie das Überstand und geben Sie 15 Milliliter Waschpuffer hinzu. Wiederholen Sie die Sonifikation wie zuvor, bis das Pellet vollständig resuspendiert ist, und wiederholen Sie die Zentrifugation. Wiederholen Sie die Schritte Waschen und Pelletieren insgesamt fünfmal.Schließlich resuspendieren Sie das Pellet in Waschpuffer, der kein Triton X-100 enthält. Zentrifugieren Sie erneut und resuspendieren Sie in vier Millilitern TE-Puffer. Dies sind Ihre Einschlusskörperchen.Quantifizieren Sie Ihre Einschlusskörperchen anhand des Feuchtegewichts. Die Einschlusskörperchen-Suspension kann bei vier Grad Celsius in Pufferlagerbeständen mit Konzentrationen von 30 bis 100 Milligramm pro Milliliter aufbewahrt werden. Nachdem die Einschlusskörperchen vorbereitet sind, können Sie sich nun auf die Umfaltung vorbereiten.Beginnen Sie das Faltungsverfahren, indem Sie eine frische Ein-Liter-Flasche Faltungs-Puffer vorbereiten und bei vier Grad Celsius unter leichtem Rühren abkühlen lassen. Danach bereiten Sie sieben Injektionen der Einschlusskörper für die Injektion in den Faltungs-Puffer vor. Erwärmen Sie zunächst die Lagerprobe der Einschlusskörper-Suspension in einem Mikrozentrifugenröhrchen mit einem Endvolumen von 1,4 Milliliter in sieben Mol Guaninhydrochlorid plus 10 Millimolar β-Mercaptoethanol in einem Wasserbad bei 37 Grad Celsius für 30 bis 40 Minuten, bis sie vollständig aufgeschmolzen ist.Alle fünf Minuten vortexen. Sie erkennen, dass das Schmelzen abgeschlossen ist, wenn die Suspension klar wird.Zentrifugieren Sie die geschmolzene Mischung 30 Minuten lang mit maximaler Geschwindigkeit in einer Mikrozentrifuge bei vier Grad Celsius. Achten Sie dann darauf, beim Sammeln des Überstands kein Material aus dem kleinen, dunkelgrauen Pellet mit aufzunehmen. Überführen Sie den Überstand in ein 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen.Stellen Sie das Volumen mit Injektionspuffer auf sieben Milliliter ein, um zu injizieren. Erhöhen Sie zunächst die Rührgeschwindigkeit der Faltmischung auf hoch. Fügen Sie dann einen Milliliter verdünnte Einschlusskörper hinzu.Tropfenweise, wobei zwischen jedem Tropfen zwei Sekunden liegen. Geben Sie jeweils einen Milliliter verdünnte Einschlusskörperchen hinzu, mit einer Stunde Abstand zwischen den Injektionen. Stellen Sie die Rührgeschwindigkeit danach wieder auf niedrig ein.Rühren Sie über Nacht bei vier Grad Celsius mit geringer Geschwindigkeit weiter. Die Proteine sind dann bereit für die Konzentrierung und Reinigung. Um mit der Konzentrierung der refalteten KLRG one-Tetramere zu beginnen.Filtern Sie die Reaktion zunächst mit einem 0,22-Mikrometer-Filter vor. Konzentrieren Sie anschließend die Reaktion von einem Liter auf etwa 10 Milliliter unter Verwendung einer Millipore Amon Rührzelle und einer Ultrafiltrationsmembran mit einer nominalen Molekulargewichtsgrenze von 10 Kilodalton gemäß den Hersteller- und S-Anweisungen. Anschließend konzentrieren Sie die Probe weiter mit einer Millipore Ultrafiltrationsmembran mit einem Molekulargewichtsabschnitt von 10 Kilodalton auf weniger als oder gleich zwei Milliliter.Richten Sie Ihr Chromatographiesystem gemäß den Herstelleranweisungen ein. Wir verwenden das GE Healthcare ACTA-Fast-Protein-Flüssigchromatographiesystem bei vier Grad Celsius mit einer Hochauflösungssäule. Reinigen Sie die Monomerform von K lrg, aufgelöst in 20 Millimolar HEPES und 150 Millimolar Natriumchlorid, mittels Größenausschlusschromatographie.Das injizierte Volumen sollte weniger als 2 % des gesamten Gelvolumens der Säule betragen. Konzentrieren Sie erneut mithilfe einer Ultrafiltrationsmembran von Millipore mit einer Molekulargewichtsabscheidung bei 10 Kilodalton gemäß den Herstelleranweisungen auf ein Endvolumen von einem Milliliter pro KLG-einem-Monomer. Entfernen Sie freies Biotin durch Reinigung wie zuvor mittels Gelpermeationschromatographie, um das Tetramer zu erhalten.Mischen Sie die KL LRG one-Monomere mit einem vierfachen molaren Überschuss an FICO rine-konjugierten Streptavidin-Tetrameren, die nun zur Markierung von Rezeptorliganden verfügbar sind. Dieses Diagramm zeigt ein positives Ergebnis der Trennung von umgefalteten K lrg one-Proteinen mittels Größenausschlusschromatographie von links nach rechts. Die Peaks veranschaulichen die Multimer-, Dimer- und Monomerformen von K LRG one.Der Peak ganz rechts repräsentiert den Pufferaustausch. Obwohl die Faltungsbedingungen für jedes Protein empirisch getestet werden müssen, sollte es möglich sein, andere C-Typ-Lektinrezeptoren mit einem ähnlichen Protokoll zu Tetrameren zu verknüpfen, wodurch die potenzielle Identifizierung weiterer Liganden ermöglicht wird. Wir haben Ihnen gerade gezeigt, wie man das KLRG1-Tetramer bei Durchführung dieses Verfahrens herstellt.Es ist wichtig, daran zu denken, die Induktionsstufen zu überprüfen und die Bedingungen für die Umfaltung strikt einzuhalten. Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.

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Biology

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