Nichtentkalktem Knochen Vorbereitung für Histologie, Histomorphometrisch und Fluorochrom Analysis
8. Januar 2010
Nichtentkalktem Knochenhistologie liefert wichtige Informationen für eine Vielzahl von klinischen und wissenschaftlichen Anwendungen. Es ist technisch anspruchsvoll, vor allem bei großformatigen Proben. Dieses Video zeigt den Prozess der Herstellung guter Qualität Abschnitte und zeigt die technischen Schwierigkeiten und Methoden, mit denen sie zu überwinden.
Und die histologische Untersuchung entkalkten Knochengewebes zeigt die Mikroarchitektur des Knochens, wobei sowohl die mineralisierten als auch die zellulären Bestandteile sichtbar werden, und liefert wichtige Informationen über den Knochenumsatz bzw. Knochenbildung und -resorption. Dies hat eine enorme Bedeutung für eine Vielzahl klinischer und forschungsbasierter Anwendungen. Sie ermöglicht eindrucksvolle Abbildungen und erlaubt Techniken wie die Fluoreszenzanalyse und die histologische Optometrie.
Die Durchführung der Histologie unterhalb verkalkten Knochens ist technisch anspruchsvoll, insbesondere bei großvolumigen Proben. In diesem Video werden die technischen Schwierigkeiten sowie Methoden zur Bewältigung dieser dargestellt, um Schnitte unterhalb verkalkten Knochens zu erhalten. Eine histomorphometrische Beurteilung dieser Schnitte wird nicht behandelt.
Dazu verweisen wir auf die folgende wichtige Publikation. In diesem Video werden die Probenvorbereitung und Fixierungsverfahren, das Einbetten und Schneiden sowohl von Grund- als auch von Schnittpräparaten, die Vorbereitung der Objektträger und die Färbung nach der Gewebegewinnung behandelt. Die Probe.
In diesem Fall wird die zervikale Wirbelsäule des Schafes in einen verschlossenen, undurchsichtigen Behälter mit 10 % phosphatgepufferter Formulierung und Lösung gegeben. Falls eine Fluorochrom-Analyse durchgeführt werden soll, sollte die Probe möglichst wenig Licht ausgesetzt sein. Da Fluorochrome lichtempfindlich sind, wird die Probe anschließend ins Labor gebracht und auf die geeignete Größe zugeschnitten, um die Fixierung zu verbessern und sicherzustellen, dass sie in einen Block passt.
Die Orientierung des Gewebes auf dem Objektträger muss zu diesem Zeitpunkt bekannt sein, damit der Block in der richtigen Ebene präpariert werden kann. Die Sicherheit ist sehr wichtig, und die Instrumente sollten so verwendet werden, dass die Hände von der Klinge ferngehalten werden. Ihr Bereich von Interesse wird nun auf die gewünschte Größe zurechtgeschnitten.
Der endgültige Zuschnitt erfolgt anschließend mit einer kleineren Bandsäge, wodurch weniger Gewebeverlust entsteht. Sobald ein Block auf die gewünschte Größe zugeschnitten wurde, wird er in einen verschlossenen, undurchsichtigen Behälter mit frischer Fixierlösung zur Vervollständigung der Fixierung gegeben. Das Volumen des Behälters sollte etwa das 10-Fache der Größe der Probe betragen.
Um eine ausreichende Fixierung zu erreichen, sollte das Präparat je nach Größe zwischen einer und zwei Wochen in der Fixierlösung verbleiben. Anschließend wird es in 70 % Ethanol überführt. Die Weiterverarbeitung erfolgt dann langsam, da die große Größe der Gewebeproben und die geringe Durchlässigkeit des Knochens eine langsame Diffusion der Lösungsmittel bewirken. Die Dehydrierung wird anschließend mittels ansteigender Ethanolkonzentrationen durchgeführt, gefolgt von einer Klärung in Butanol. Das Präparat wird dabei vor Licht geschützt und unter ständigem Rühren aufbewahrt.
Wir empfehlen etwa eine Woche in jeder Lösung. Der gesamte Prozess dauert daher etwa vier bis sechs Wochen. Dies sollte nicht beschleunigt werden, da dies die endgültige Qualität der Schnitte beeinträchtigen würde.
Es stehen verschiedene Einbettungsoptionen für verkalktes Knochenmaterial zur Verfügung. Die Wahl des Harzes oder der Methacrylat-Verbindung hängt davon ab, welche Untersuchungen durchgeführt werden sollen. Beispielsweise ist die Immunhistochemie mit allen Harzen nicht möglich.
Epoxidharze benötigen UV-Licht zum Aushärten, was die Fluorochrom-Analyse stören würde. Wir empfehlen, die Herstellerspezifikationen zu konsultieren, bevor eine sorgfältige Auswahl getroffen wird. Wir verwenden TEVI 7, 100, da dies schöne geschnittene und geschliffene Schnitte für die Lichtmikroskopie und die Fluorochrom-Analyse ermöglicht und kosteneffizient ist.
Bei der Einbettung ist zu beachten, dass die Dichte des Knochens und die Dichte des Einbettmediums gut aufeinander abgestimmt sein sollten. Dies ist besonders wichtig beim späteren Schneiden der Blöcke, insbesondere für Mikroschnittaufnahmen. Die Mischung wird gemäß den Herstelleranweisungen hergestellt und kräftig geschüttelt. Es kann sinnvoll sein, zunächst unbeschichtete Proben einzubetten, um den Protokollablauf zu optimieren.
Im Gegensatz zu Paraffin ist dieser Schritt irreversibel. Die Blöcke werden mit der Schneidfläche nach unten in die Form gelegt. Die Form wird größer als der Block sein, um Halt und Festigkeit zu gewährleisten.
Die Infiltration mit Methacrylat sollte langsam durchgeführt werden, um eine maximale Infiltration des Methacrylats in den Knochen zu ermöglichen. Auch hier sollte die Lichteinwirkung minimiert werden. Nach einer Woche Infiltrationslösung wird die Infiltrationslösung gewechselt und die Aushärtungslösung hinzugefügt.
Anschließend wird eine Trägerplatte angefertigt. Dafür verwenden wir Tevit 30 40. Die Form wird dann abgezogen, und der Block ist nun fertig.
Die Schleifschnitttechnik erzeugt größere Schnitte mit einer Dicke zwischen 20 und 50 Mikrometern. Sie ist nützlich für die Fluoroanalyse, da dickere Schnitte eine intensivere Fluoreszenz erzeugen. Für die Herstellung des Schleifschnitts wird ein Mikrotom benötigt, vorzugsweise mit einer Diamantklinge. Wir verwenden eine gekrümmte Diamantklinge mit 0,6 Millimeter Durchmesser.
Ein Schmiermittel ist unerlässlich. Wir bevorzugen ein petroleumbasiertes Schmiermittel, obwohl auch silikonbasierte Schmiermittel gut wirken. Anschließend wird der Block in die Klemme eingesetzt.
Es wird in der Makrofassung befestigt und der Block zur Klinge hin vorgeschoben. Der erste Schnittabschnitt legt die Schneidfläche frei und orientiert den Schnitt. Er sollte entsorgt werden.
Das Mahlen ist ein langsamer Prozess und sollte nicht beschleunigt werden. Es sollte ausreichende Schmierung gewährleistet werden, während der Schnitt durchgeführt wird. Anschließend wird er auf einen Objektträger gelegt.
Es kann je nach Bedarf gereinigt und poliert werden. Der Schnitt neigt dazu, sich aufzurollen, daher empfehlen wir, einen Teil eines Sandwichbeutels darüberzulegen und ihn flach zu halten, während ein weiterer Objektträger darauf fixiert wird.
Anschließend wird es eine Stunde lang in einen Inkubator bei 60 bis 80 Grad Celsius gestellt. Dieser Schritt macht ein Methacrylat weicher und unterstützt, dass der Schnitt flach am Objektträger haftet. Hier sehen wir ein kombiniertes fluoreszierendes Bild von drei verschiedenen Fluorochromen, die in monatlichen Abständen injiziert wurden.
Dies ermöglicht die Identifizierung der Mineralisationsstelle zu einem bestimmten Zeitpunkt. Die Dosen und die Herstellung dieser Markierungen sind im Text angegeben. Der Mikroschnitt liefert dünne Schnitte, die sich am besten für die Lichtmikroskopie eignen.
Es handelt sich um einen technisch anspruchsvollen Prozess. Wir empfehlen die Verwendung eines Sledge-Mikrotoms, da es zusätzliche Stabilität beim Schneiden dieser harten Blöcke bietet. Es können verschiedene Klingen verwendet werden, darunter Hartmetallklingen aus Wolframcarbid.
Wir empfehlen jedoch eine Klinge aus rostfreiem Stahl, da diese bei Bedarf leicht und häufig erneut geschärft werden kann. Die Klinge sollte so ausgerichtet sein, dass sie einen Winkel von 45 Grad mit dem Block bildet. Die Dichte des Methacrylats ist von vielen Faktoren abhängig, darunter die Luftfeuchtigkeit im Raum.
Der Block sollte daher auf einer trockenen Oberfläche gelagert werden. Eine Weichmachung kann bei Bedarf erreicht werden, indem ein feuchtes Papier auf den Block aufgelegt wird; es können mehrere Schnitte erforderlich sein, um die geeigneten Schneidbedingungen für einen qualitativ hochwertigen Schnitt zu erreichen. Auch hier werden die Sandwich-Tüte und der zusätzliche Objektträger festgeklemmt, um den Schnitt zu glätten, bevor er in den Inkubator gegeben wird.
Die Färbung ähnelt der Standard-Histologie mit Paraffineinbettung, mit dem Unterschied, dass das Einbetten in Wachs offensichtlich nicht erforderlich ist. Zu den üblichen Färbemethoden für Knochen gehören VSA mit Safranin-Gegenfärbung, Safranin, Ol-Gelbgrün und Masson-Trichrom nach Goldner. Auf die Protokolle hierfür wird im Text verwiesen.
Die Reagenzien werden vor der Verwendung ausgewählt und filtriert. Golden. Die Färbung wird häufig in der histo-optometrischen Diagnostik verwendet. Wir empfehlen, die Färbungen zunächst an Testpräparaten zu optimieren.
Nach jedem Schritt kann der Objektträger unter dem Mikroskop überprüft werden, um die korrekten Färbungen sicherzustellen. Dies ermöglicht es, die richtigen Einwirkzeiten für jede Komponentenfärbung zu erreichen. Sobald die Färbung standardisiert und optimiert ist, werden alle Objektträger aus dem Experiment gleichzeitig in einer Halterung mit demselben Protokoll gefärbt, um Färbungsvariabilität zu vermeiden, die die thermische Geometrie beeinflussen könnte.
Die Objektträger werden dann auf standardisierte Weise verschoben. Wir wünschen Ihnen viel Erfolg bei Ihrem Experiment.
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Übersicht
Die undezimierte Knochenhistologie ist entscheidend für das Verständnis der Knochenmikroarchitektur, einschließlich mineralisierter und zellulärer Bestandteile. Dieses Video veranschaulicht die technischen Herausforderungen und Methoden zur Herstellung qualitativ hochwertiger Schnitte aus großen Proben.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Knochenhistologie
- Klinische Anwendungen
- Forschungsmethoden
Hintergrund
- Knochenumsatz und -bildung sind lebenswichtig für die Gesundheit.
- Undekalkifizierte Schnitte liefern detaillierte Bilder der Knochenstruktur.
- Methoden wie die Fluoreszenzanalyse verbessern die Auswertung.
- Bei großen Proben ergeben sich Herausforderungen in der histologischen Aufbereitung.
Zweck der Studie
- Den Prozess zur Gewinnung qualitativ hochwertiger undekalcifizierter Knochenschnitte demonstrieren.
- Technische Schwierigkeiten bei der histologischen Aufbereitung hervorheben.
- Lösungsansätze zur Überwindung dieser Herausforderungen bereitstellen.
Verwendete Methoden
- Herstellung von undekalkifizierten Knochenpräparaten.
- Techniken zum Schneiden großer Präparate.
- Methoden der visuellen Beurteilung.
- Vorführung histologischer Techniken.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Herstellung hochwertiger Knochenschnitte.
- Identifizierung häufiger technischer Herausforderungen.
- Effektive Methoden zur Überwindung von Vorbereitungsschwierigkeiten.
- Verbessertes Verständnis der mikroskopischen Knochenarchitektur.
Schlussfolgerungen
- Die undekalkifizierte Knochenhistologie ist unerlässlich für klinische und forschungsbezogene Anwendungen.
- Technische Herausforderungen können mit geeigneten Methoden effektiv bewältigt werden.
- Hochwertige Schnitte liefern wertvolle Erkenntnisse zum Knochengesundheitszustand.
Häufig gestellte Fragen
Aussagekräftige Branchenrelevanz
Die undezementierte Knochenhistologie ermöglicht die direkte Visualisierung mineralisierter und zellulärer Knochenbestandteile und liefert entscheidende Daten zur Knochenumsatzrate, -bildung und -resorption. Dieser Ansatz unterstützt die Zielvalidierung in Modellen skelettaler Erkrankungen, indem die native Gewebearchitektur für eine quantitative Analyse erhalten bleibt. Die Methode erhöht die Vorhersagesicherheit in präklinischen Studien, da durch Fluoreszenzmarkierungen eine longitudinale Beurteilung der Mineralisationsdynamik möglich ist.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen, indem sowohl mineralisierte als auch zelluläre Knochenkompartimente für die mechanistische Analyse erhalten bleiben.
- Operativer Wert: Unterstützt die biologische Risikominimierung durch direkte Beobachtung von Knochenbildungs- und -resorptionsprozessen in krankheitsrelevanten Proben.
- Translationeller Wert: Fördert das Vertrauen in Zielstrukturen, indem die Korrelation histologischer Endpunkte mit funktionellen Ergebnissen in präklinischen Modellen ermöglicht wird.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Bietet quantitative Ergebnisse zur histomorphometrischen und fluorochromen Analyse für die standardisierte Beurteilung von Knochenmineralisierungsraten.
- Operativer Wert: Ermöglicht die Reproduzierbarkeit des Assays durch standardisierte Protokolle für das Schneiden, Färben und Abbilden von Schnitten, die auf große Probensätze anwendbar sind.
- Translationeller Wert: Unterstützt die Eignung für die Wirkstoff-Screening-Phase, indem quantitative, zeitlich aufgelöste Mineralisierungsdaten bereitgestellt werden, die für die Bewertung von Substanzen in der skelettalen Pharmakologie geeignet sind.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Bietet eine krankheitsrelevante Systemkontinuität, indem die langfristige Verfolgung des Knochenumsatzes von der Entdeckung bis zur präklinischen Validierung ermöglicht wird.
- Operationaler Wert: Unterstützt risikoadjustierte Entscheidungen zur Weiterentwicklung durch die Bereitstellung quantitativer, histomorphometrisch validierter Daten zum Knochenphänotyp.
- Translationeller Wert: Verbessert die prädiktive Risikominimierung durch direkte Korrelation von Fluorochrommarkierungsmustern mit zeitlichen Mineralisierungsereignissen in therapeutischen Interventionsstudien.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode integriert sich in den Entdeckungsprozess von der frühen Target-Validierung über die Identifizierung von Leitverbindungen bis hin zur präklinischen Wirksamkeitsprüfung, insbesondere für knochenwirksame Therapeutika und die skelettale Sicherheitspharmakologie.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die Hypothesenprüfung und die Aufklärung von Signalwegen, indem sie eine direkte Visualisierung der Aktivität von Osteoblasten und Osteoklasten in undekalzifiziertem Gewebe ermöglicht.
- Screening: Stellt Bereitschaft für Assays sicher, indem standardisierte Protokolle zum Schleifen und Schneiden von Schnitten genutzt werden, die quantifizierbare Fluoreszenz- und histomorphometrische Ergebnisse liefern.
- Analytik: Bietet quantitative abhängige Messgrößen wie die Mineraleinbaugeschwindigkeit, die Knochenbildungsrate und fluorochrombasierte Mineralisierungszeitlinien für den Vergleich zwischen verschiedenen Versuchsbedingungen.
- Translationale Forschung: Verbindet Forschungsergebnisse mit der präklinischen Kontinuität, indem sie die longitudinale Beurteilung der Knochenumsatzdynamik ermöglicht, die für die Validierung von Modellen für Skeletterkrankungen entscheidend ist.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare Histologieplattform für Programme der skeletalen Pharmakologie durch standardisierte Abläufe zur Harteinbettung, zum Schneiden und Färben, die auf verschiedene Knochenmodelle und therapeutische Modalitäten anwendbar sind.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Vorhersagegenauigkeit durch direkte, quantitative Beurteilung von Knochenbildung und -resorption ohne Entkalkungsartefakte.
- Operativer Wert: Standardisierung und Reproduzierbarkeit mittels validierter Einbettungs-, Schnitt- und Färbeprotokolle für große, dichte Proben.
- Strategischer Wert: Verbesserte Go/No-Go-Entscheidungen in der Entwicklung skelettaler Therapeutika durch Verringerung mechanistischer Unschärfen bei Knochenumsatzendpunkten.
- Portfolio-Wirkung: Risikoadjustierte Priorisierung knochenwirksamer Kandidaten anhand histomorphometrisch validierter präklinischer Wirksamkeits- und Sicherheitssignale.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse in der Knochenhistologie, Techniken zur Harteinbettung sowie Protokolle zum Umgang mit Fluorochromen.
- Benötigt spezialisierte Geräte, darunter Säge-Mikrotome, Makrotome mit Diamantklingen und lichtgeschützte Umgebungen für die Aufarbeitung, um die Stabilität der Fluorochrome sicherzustellen.
- Setzt eine standardisierte Vorgehensweise zwischen Teams bei Fixierung, Dehydrierung und Infiltrationszeiten voraus, um die Schnittqualität bei großen, gering durchlässigen Proben sicherzustellen.
- Erfordert Anpassungen an unterschiedliche Knochendichten und Probengrößen, was Einbettungsmedien mit angepasster Dichte und verlängerte Aufarbeitungszeiten notwendig macht.
- Beinhaltet praktische Einschränkungen wie irreversible Einbettungsschritte, Lichtempfindlichkeit der Fluorochrome sowie Schnittwelligkeit, die eine mechanische Glättung während der Montage erfordert.
