Mosaic Zebrafisch Transgenese zur Beurteilung Enhancer-Sequenzen

Hallo, ich bin Erica Kgi aus dem Labor von Shannon Fisher in der Abteilung für Zell- und Entwicklungsbiologie an der University of Pennsylvania. Ich bin Chris Weber, ebenfalls vom Fisher Lab. Und ich bin Shannon Fisher.

Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Analyse der Funktion von Enhancer-Elementen mittels Zebrafisch-Transgenese. Wir verwenden dieses Verfahren, um die transkriptionellen Regulation von Genen zu untersuchen, die für die Skelettentwicklung wichtig sind. Also lasst uns loslegen.

Um nicht-kodierende Sequenzen zu identifizieren, die Kandidatengene umgeben, verwenden wir den Algorithmus fast cons, der als Track auf dem UC SC Genome-Browser zugänglich ist. Wir interessieren uns in erster Linie für Gene, die während der Skelettentwicklung exprimiert werden, aber der gleiche Ansatz kann verwendet werden, um alle Gene zu untersuchen, die in der frühen Entwicklung exprimiert werden. In dem hier gezeigten Beispiel haben wir konservierte Sequenzen identifiziert.

In dem Intervall um das humane Bumper-Gen untersuchen wir das gesamte Intervall zu den benachbarten Genen und bestimmen einen niedrigen größenspezifischen Log-Score-Cutoff, der ungefähr den oberen 5% der nicht-kodierenden Sequenz entspricht. Nach der Auswahl der Sequenzen entwerfen Sie Primer unter Verwendung von Primer drei, um jede Sequenz aus dem Humangenom zu amplifizieren. DNA-Primer sollten ausgewählt werden, um die konservierte Region plus 30 oder mehr Basenpaare auf jeder Seite zu amplifizieren. Amplifizieren Sie die Region of Interest mit hochwertiger Polymerase unter Verwendung menschlicher genomischer DNA und verwenden Sie molekularbiologische Standardverfahren im Labor, um das amplifizierte Produkt in einen Expressionsvektor zu klonen.

Der in diesem Protokoll verwendete Vektor ist PG wc FOS GFPA Gateway. Zielvektor. Nach der Vektorerstellung soll transponiert werden.

Das für die Transposition erforderliche Enzym wird zunächst in vitro mit dem M message M Machine Kit von Ambion und dem PGB 600 Plasmid transkribiert, bevor experimentelle Injektionen durchgeführt werden. Testen Sie jede Charge von Transponierungen auf Wirksamkeit, indem Sie einen bekannten Verstärker wie die Maussocken injizieren. 10 Verstärker.

Zur Vorbereitung der Injektionen ziehen Sie die für die Mikroinjektion verwendeten Nadeln aus einem Filamentkapillarglas mit einem Durchmesser von 1,2 Millimetern auf einem Sutter P 97 Mikropipettierabzieher. Verwenden Sie ein Programm, das eine starke Spitze mit einer scharfen Verjüngung ergibt, um mit einer sauberen Rasierklinge und einem Mikrometerschieber in intakte Corions einzudringen. Brechen Sie die Spitzen von Hand unter einem Stereomikroskop auf einen Außendurchmesser von ca. 15 Mikrometern.

Die Nadeln können einen Tag lang in einer abgedeckten Auffangschale aufbewahrt werden. Halten Sie die Zebrafischpopulation am Tag vor der Durchführung von Mikroinjektionen in einem regelmäßigen Hell-Dunkel-Zyklus mit 14 Stunden Licht unter Standardbedingungen aufrecht. Bereiten Sie die Fische auf zeitlich begrenzte Paarungen in kleinen Zuchtbecken vor.

Platzieren Sie drei Weibchen oder zwei Männchen pro Tank in parallelen Reihen am Morgen der Mikroinjektionen, kurz nachdem der Lichtzyklus begonnen hat. Kombinieren Sie Männchen und Weibchen in sauberem, systembehandeltem Wasser für die Eiproduktion. Kontrollieren Sie die Fische regelmäßig und sammeln Sie die Eier innerhalb weniger Minuten nach der Produktion, um gut synchronisierte Chargen zu erhalten.

Halten Sie die Eierproduktion für zwei bis drei Stunden aufrecht, indem Sie den ganzen Morgen über frische Fischgruppen mit einem 5,5-Zoll-Glas mit breiter Öffnung und einer Pipette kombinieren, die mit einem Latexkolben ausgestattet ist. Die entnommenen Embryonen werden in Gruppen von 50 Embryonen in 60 x 15 Millimeter große Petrischalen sortiert, die teilweise mit Embryonalmedium gefüllt sind. Markieren Sie die gesammelte Zeit auf dem Deckel jeder Schüssel.

Für jedes entnommene Gelege von Embryonen bewahren Sie eine Schale mit 50 Embryonen für die nicht injizierte Kontrolle zwischen den Eizellentnahmen auf. Bereiten Sie frische Injektionslösungen vor, indem Sie die folgenden Zutaten in einem Mikrofuge-Röhrchen mischen und auf Eis lagern. Legen Sie die Injektionsnadeln in Auffangschalen und füllen Sie sie mit 1,5 bis zwei Mikrolitern Injektionslösung.

Durch das Pipettieren tropfen 500 Nanoliter auf das breite Ende jeder Nadel. Die Flüssigkeit wird durch Kapillarwirkung zur Spitze gezogen. Bereiten Sie mindestens zwei Nadeln für jede Injektionslösung vor.

Legen Sie die gefüllte Nadel in den Handnadelhalter einer pneumatischen Picopumpe oder eines ähnlichen Druckinjektors. Konfiguriert und angeschlossen an einen Stickstofftank gemäß den Anweisungen des Herstellers. Kalibrieren Sie das Einspritzvolumen, indem Sie den Durchmesser der Tröpfchen messen, die auf einem Mikrometerschlitten in das Mineralöl ausgestoßen werden, in der Regel eine Einspritzzeit von 120 Millisekunden.

Bei einem Druck von 20 PS werde ich mit einem Stereomikroskop bei sechs- bis zehnfacher Vergrößerung ein Tröpfchen von etwa einem Nanoliter erzeugen. Halten Sie den Embryo mit einer feinen Pinzette an Ort und Stelle und schieben Sie die Injektionsnadel mit gleichmäßigem Druck durch das Corion in das Eigelb eines Embryos im Einzell- oder frühen Zweizellstadium, positionieren Sie die Nadelspitze im Eigelb direkt unter den Blastomeren, stoßen Sie etwa einen Liter Injektionslösung aus und ziehen Sie die Nadel für jedes Konstrukt zurück, das wir mehr als oder gleich 200 Embryonen injizieren, nachdem die Injektion abgeschlossen ist. Sortieren Sie die Embryonen, indem Sie unbefruchtete Eizellen, beschädigte Embryonen und fehlgeschlagene Injektionen oder Embryonen ohne Phenolrot in den Gotteslästerern entfernen.

Anschließend inkubieren wir die Embryonen und das Embryomedium bei 28,5 Grad Celsius, bis der geeignete Zeitpunkt für die Beobachtungen erreicht ist. Jetzt zeigen wir Ihnen einige repräsentative Ergebnisse von Enhancer-Elementen, die gewebespezifische Muster der GFP-Expression im Zebrafischembryo erzeugen. Wir untersuchen Gene, die in Knochen oder Knorpel exprimiert werden.

Hier ist ein Beispiel für ein Enhancer-Element stromaufwärts des Acan-Gens, das die Expression im kranialen Gesichtsknorpel drei Tage nach der Befruchtung reguliert. Hier ist ein weiterer Enhancer, diesmal aus dem Bumper-Gen, das die Expression in Knochenzellen reguliert. Nach fünf Tagen der vielen Enhancer, die wir identifiziert haben, finden wir wenig Korrelation zwischen der Lokalisation relativ zum Gen und der Regulation der Expression.

Bei der Auswahl der zu testenden Sequenzen ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass ein Enhancer Hunderte von Kilobasen stromaufwärts oder stromabwärts eines Gens oder in einem der Introns sein kann, wie sie in diesem Embryo zu sehen sind. Ein erheblicher Teil der Sequenzen scheint die gewebespezifische Expression nicht zu regulieren. Diese zeigen oft eine sehr geringe Fluoreszenz oder können einige verstreute Zellen an zwei gemeinsamen Stellen für die ektopische Expression, der Epidermis und der Skelettmuskulatur, aufweisen.

Wir haben Ihnen gerade gezeigt, wie Sie potenzielle Enhancer-Elemente durch Sequenzerhaltung identifizieren und ihre Funktion durch Mosaik-Transgenese im Zebrafisch testen können. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, die Qualität Ihrer DNA und RNA für Injektionen zu untersuchen. Achten Sie auch darauf, alle Ihre injizierten Embryonen sorgfältig zu untersuchen, insbesondere wenn Sie nur eine Expression in einer kleinen Gruppe von Verkäufen erwarten.

Das war's also. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.