Name: Live-Imaging von Zellbewegung und Aktin-Zytoskelett von einzelnen Neuronen und Zellen der Neuralleiste in Zebrafisch-Embryos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-02-03T16:25:00.000+00:00
Duration: 10 min 52 s
Description: Lernen Sie Live-Imaging einzelner Neuronen und Neuralleistenzellen in Zebrafisch-Embryos. Diese Methode ermöglicht die Analyse von Zellbewegung und Aktin-Zytoskelett-Dynamik mittels konfokaler Fluoreszenzmikroskopie.

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Diese Arbeit wurde vom NIH R01 unterstützt NS042228 zu MCH Die Olympus FV1000 konfokalen mit einem NIH gemeinsame Instrumente zu gewähren S10RR023717 der UW Zoologisches Institut (PI Bill Bement) erworben wurde. Erica Andersen, Namrata Asuri und Matthew Lehm trugen gleichermaßen zu dieser Veröffentlichung.

1. Versammlung der Injektion Dias und Imaging-Folien Injection Folien: <ol><li> Bereiten Sylgard Silikon-Elastomer gemäß den Anweisungen des Herstellers. </li><li> Verwenden Sie die Sylgard zu binden drei Standard-Objektträger aus Glas zusammen durch das Stapeln einer Folie auf der Oberseite der Kreuzung der beiden anderen Folien, die side-by-side angeordnet sind an den langen Kanten. Der Oberschlitten schafft eine rechtwinklige Ecke oder "Mauer" zwischen oben und unten gleitet. </li><li> Lassen Sylgard gesetzt Nacht. Diese Folien sind wiederverwendbar. </li></ol> Imaging slide: <ol><li> Wir verwenden Edelstahl rechteckig zugeschnitten auf die gleiche Größe eines Standard-Glasobjektträger (75mm x 25mm x 1mm), so dass die Kammer passt den Diahalter auf dem Mikroskoptisch. Ein 1,5 cm großes Loch in der Mitte des Rechtecks ​​schneiden. </li><li> Bringen Sie eine 22 mm 2 Deckglas auf das Metall Rechteck mit Sylgard. Verwenden Sie gerade genug Sylgard gründlich Deckglasränder. Um das Bild auf einem inversen Mikroskop wird Embryonen auf dieser Deckglas montiert werden und bebildert von der Unterseite. </li><li> Lassen Sylgard gesetzt Nacht. Diese Folien sind wiederverwendbar und gereinigt mit 70% Ethanol zwischen den Anwendungen. </li></ol> 2. Vorbereitung von DNA-Konstrukten Um auszudrücken, ein Transgen in einer Gewebe-spezifischen Art und Weise wird das Gen von Interesse hinter einer Zell-spezifische Promotor kloniert. Wir verwenden eine cis-regulatorische Element des Zebrafisch-Gen neurogenin1 (-3.1ngn1) 2 oder die SOX10 Gen (-4.9sox10) 3 zum Ausdruck in sensorischen Neuronen oder Neuralleistenzellen Laufwerk bzw.. Zur Visualisierung Zelle und Membran Dynamik, drücken wir zytoplasmatische oder Membran-lokalisierte Fluorophore. Um das Bild F-Aktin-Verteilung, drücken wir DNA, die das Calponin Homologie Domäne von Utrophin fusioniert mCherry (UtrCH-mCherry). Die UtrCH-mCherry Biosensor-Sonde ermöglicht die Visualisierung von F-Aktin ohne Beeinträchtigung Aktindynamik 1. Wir erzeugen diese DNA-Konstrukte mit dem Invitrogen Gateway-Rekombination-basierte Klonen Strategie 4 und Vektoren in der Zebrafisch Tol2kit 5 vorgesehen. <ol><li> Generieren Expressionsvektor (s) mit Multisite-Gateway-Technologie und Vektoren aus dem Zebrafisch Tol2kit 5. Plasmide enthalten die TOL2 Rückgrat von pT2KXIGDin. </li><li> Purify Plasmid-DNA mit QIAfilter Plasmid Midi Prep Kit (QIAGEN Inc.) und eluieren in sterilem Wasser. DNA muss nicht zur Injektion linearisiert werden. </li></ol> 3. Die Injektion von DNA-Konstrukten <ol><li> Verdünnen Sie die DNA auf eine Endkonzentration von 10-50 pg / ml DNA in 0,2% Phenolrot (für die Visualisierung während der Injektion) in Wasser. </li><li> Fill und kalibrieren Nadel: Back-füllen gezogen Kapillarnadel mit etwa 1 ul DNA-Lösung und setzen Sie sie in den Nadelhalter des Injektionsgeräts (wir verwenden eine Picospritzer). Mit einer feinen Pinzette, brechen die Spitze vor der Nadel, so dass die Spitze Öffnung ca. 10 mm im Durchmesser ist. Messen Sie den Durchmesser des Tropfens in Mineralöl mit einem Okularmikrometer. Stellen Sie den Druck Dauer Einstellung auf ein Tröpfchen von ca. 1 nl Volumen zu bekommen. </li><li> Sammeln Sie 1-Zell-Stadium Embryos in E3 Embryo Medium (5mm NaCl, 0,17 mm KCl, 0,33 mm CaCl 2, 0,33 mm MgSO 4 * 7H 2 O, pH 7,0). </li><li> Transfer ca. 30-60 Embryonen zur Injektion schieben und die Position der Embryonen in den rechten Winkel Ecke zwischen der oberen und unteren Folien gebildet. Entfernen Sie die meisten der E3 so, dass die Embryonen, um die Folie durch die Oberflächenspannung gehalten werden. </li><li> Verwenden Sie einen gebogenen Sezieren pin Embryonen zu drehen, so wird die Zelle gegen die Wand der Injektion gleiten. </li><li> Verwenden Sie einen Mikromanipulator, um die Nadel durch den Embryo Chorion Führung durch das Eigelb und in die einzelne Zelle des Embryos. Inject 0,5-1 nl DNA-Lösung in die Zelle. </li><li> Übertragen Sie die Embryonen in Petrischalen in E3 und inkubieren bei 28,5 ° C. Falls erforderlich, kann die Entwicklung durch Inkubieren Embryonen bei einer niedrigeren Temperatur verlangsamt werden. </li></ol> 4. Montage Embryonen für die Bildgebung <ol><li> Entfernen Sie das Chorion von Embryonen mit feinen Pinzetten etwa eine Stunde vor Embryonen die gewünschte Alter für die Bildgebung (ca. 14-17 Stunden nach der Befruchtung für unsere Zwecke) zu erreichen. </li><li> Wählen Embryonen mit markierten Zellen mit einem Binokular mit Fluoreszenz ausgestattet. Wir verwenden ein 4X Objektiv (40-facher Vergrößerung) auf einem Nikon AZ100 Umfang wegen seiner Kombination aus großem Arbeitsabstand und starker Vergrößerung. </li><li> Ein Embryo in eine Mikrozentrifugenröhrchen mit etwa 50 ul E3 mit 0,2% Tricaine Betäubung (Konzentration 10X). </li><li> Add 500 ul 1% Agarose für niedrigen Schmelzpunkt in E3 mit 10 mM HEPES (gehalten bei 42 ° C), Verdünnung der Tricaine bis zu einer Endkonzentration von 0,02%. </li><li> Sofortüberweisung der Embryo in einem Agarose-Drop auf dieDeckglas der bildgebenden Dia mit einer breiten Bohrung Glaspipette. </li><li> Bevor die Agarose erhärtet, Position des Embryos, so dass die Region mit markierten Zellen nach unten gegen den Boden Deckglas (dorsal unten für Neuralleistenzellen und dorsolateral bis zum Rückenmark sensorischen Neuronen). </li><li> Montieren Bildgebung Kammer: Coat eine Seite eines Kunststoff-Ring (2 cm Außendurchmesser, 3 mm hoch) mit Silikon Vakuumfett und bringen das Metall Bildgebung gleiten. Coat auf der anderen Seite des Rings mit Fett. </li><li> Füllen Sie die Kammer mit E3 mit 10 mM HEPES und 0,02% Tricaine. Seal der Kammer oben durch die Anbringung eines 22 mm 2 Deckglas nach oben gefettete Oberfläche des Ringes. </li></ol> 5. 4D-Bildgebung von Zell-Verhalten auf dem Olymp FV1000 konfokalen Mikroskop mit IX81 Die Details der Bildaufnahme wird auf die Besonderheiten Ihres Mikroskop-System ab. Hier beschreiben wir die Zeitraffer-Übernahme-Prozess für die Olympus FV1000 konfokalen Mikroskop. Siehe vorherige JoVE Protokoll für Zeitraffer-Aufnahme mit dem Zeiss LSM 510 konfokalen System 6. <ol><li> Legen Sie die Imaging-Kammer in den Diahalter auf dem Mikroskoptisch und konzentrieren sich auf den Embryo mit einem 10X oder 20X Ziel unter Durchlicht. </li><li> Wechseln Sie zu einem 60X Objektiv (NA von 1,2 oder höher) und konzentrieren sich auf markierten Zelle mit Epifluoreszenz. Wir verwenden entweder eine Öl-Immersion (UPLSAPO 60xO NA 1,35) oder Eintauchen in Wasser (UPLSAPO 60xW NA 1,20) Objektiv. </li><li> In der FV-Software (Version 1.7c), auf XY zu wiederholen, um Laser-Scanning zu beginnen. </li><li> Passen Erwerb Einstellungen und Bildaufnahme Kontrollen (Laserleistung, Scan-Geschwindigkeit, HV, Verstärkung und Offset-Werte) zu signalisieren, zu optimieren und dabei Laserleistung auf ein Minimum (25% oder niedriger) zu Gewebeschäden zu verhindern und zu reduzieren Ausbleichen. </li><li> Zum Erwerb einer Z-Serie, stellen Sie den oberen und unteren Grenzen der z-Stack, zusammen mit Schrittweite. Sicherstellen, dass die Tiefe Symbol so engagiert, dass die XY Sweep icon XY und Z hervorgehoben hat. Erfassung starten, indem Sie die XYZ-Sweep-Symbol. </li><li> Zum Erwerb einer Zeitraffer-Serie, das Zeitintervall und Anzahl von Zeitpunkten unter dem TimeScan Rubrik der Übernahme Fenster Einstellungen. Klicken Sie auf das Icon in der Zeit Image Acquisition Control Window, so dass die XY Sweep icon XY (Z) und T hervorgehoben hat. Starten Übernahme durch Klicken auf die XY (Z) T Sweep-Symbol. </li><li> Alternativ kann die TimeController verwendet werden, um die Einrichtung eines Zeitraffer werden. Diese Programmierung ist nützlich bei der Generierung großer Datenmengen, wie sie nicht mehr als Speicherzuweisung. Unter Gerät öffnen TimeController Fenster. Erstellen Sie eine neue Imaging Task. Das Bild-Parameter-Fenster wird geöffnet. Klicken Sie auf den FV Status, um Erwerb Einstellungen zu aktualisieren. Stellen Sie sicher, Speichern und Löschen sind unter der Überschrift Terminate überprüft. Set Ausgang Dateinamen ein und klicken auf OK, um die Einstellungen zu speichern und das Fenster schließen. Verwenden Sie die Loop-Funktion, um das gewünschte Zeitintervall und Anzahl der Zeitpunkte festgelegt. Klicken Sie auf Fertig und Start der Akquisition zu beginnen. Die Pause und Z-Shift-Funktion kann verwendet werden, um während Bildgebung konzentrieren werden. </li></ol> 6. Repräsentative Ergebnisse Die Figuren und Filme zeigen Beispiele von sensorischen Neuronen und Neuralleistenzellen mit Membran-gezielte Fluorophore oder die Aktin-Biosensor-Sonde markiert. <img src="/files/ftp_upload/1726/1726fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1 Konfokale Bilder (z-Projektionen) einer Tg (ngn1: gfp-CAAX). Transgenen Embryos mit 25 injiziert pg ngn1: mCherry-CAAX DNA. Die mCherry-CAAX Etiketten ein Neuron rot (A) in einem Hintergrund mit allen Rohon-Beard sensorischen Neuronen gekennzeichnet grün (B). C) zusammengefügte Bild der beiden grünen und roten Kanälen. Balken = 50 um. <img src="/files/ftp_upload/1726/1726fig2.jpg" alt="Abbildung 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2 Confocal z-Projektionen von Neuronen in Embryonen mit ~ 20 pg ngn1 injiziert:.. MCherry-UtrCH DNA A) Rohon-Beard sensorischen Neurons in 16,5 hpf Embryo. F-Aktin-Signal wird in das Wachstum Kegel (Pfeilspitzen) und in Vorsprüngen entlang neugebildeten Axone stark. B) Neuron in 20 hpf Embryo starke F-Aktin-Signal zeigt in Wachstum Kegel von verzweigten peripheren Axon (Pfeilspitzen) und schwächeres Signal in reiferen zentralen Axone (Pfeile). Balken = 50 um.

<ol><li>Burkel, B. M., von Dassow, G., Bement, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Versatile+fluorescent+probes+for+actin+filaments+based+on+the+actin-binding+domain+of+utrophin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+motility+and+the+cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">Versatile fluorescent probes for actin filaments based on the actin-binding domain of utrophin.</a> Cell motility and the cytoskeleton. 64, 822-832 (2007).</li>
<li>Blader, P., Plessy, C., Strahle, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+regulatory+elements+with+spatially+and+temporally+distinct+activities+control+neurogenin1+expression+in+primary+neurons+of+the+zebrafish+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">Multiple regulatory elements with spatially and temporally distinct activities control neurogenin1 expression in primary neurons of the zebrafish embryo.</a> Mech Dev. 120, 211-218 (2003).</li>
<li>Wada, N., Javidan, Y., Nelson, S., Carney, T. J., Kelsh, R. N., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hedgehog+signaling+is+required+for+cranial+neural+crest+morphogenesis+and+chondrogenesis+at+the+midline+in+the+zebrafish+skull%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Hedgehog signaling is required for cranial neural crest morphogenesis and chondrogenesis at the midline in the zebrafish skull.</a> Development. 132, 3977-3988 (2005).</li>
<li>Cheo, D. L., Titus, S. A., Byrd, D. R., Hartley, J. L., Temple, G. F., Brasch, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concerted+assembly+and+cloning+of+multiple+DNA+segments+using+in+vitro+site-specific+recombination%3A+functional+analysis+of+multi-segment+expression+clones%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Concerted assembly and cloning of multiple DNA segments using in vitro site-specific recombination: functional analysis of multi-segment expression clones.</a> Genome Res. 14, 2111-2120 (2004).</li>
<li>Kwan, K. M., Fujimoto, E., Grabher, C., Mangum, B. D., Hardy, M. E., Campbell, D. S., Parant, J. M., Yost, H. J., Kanki, J. P., Chien, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Tol2kit%3A+a+multisite+gateway-based+construction+kit+for+Tol2+transposon+transgenesis+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">The Tol2kit: a multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs.</a> Dev Dyn. 236, 3088-3099 (2007).</li>
<li>O'Brien, G. S., Rieger, S., Martin, S. M., Cavanaugh, A. M., Portera-Cailliau, C., Sagasti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+axotomy+and+time-lapse+confocal+imaging+in+live+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos.</a> J Vis Exp. 24, (2009).</li>
<li>Berndt, J. D., Clay, M. R., Langenberg, T., Halloran, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rho-kinase+and+myosin+II+affect+dynamic+neural+crest+cell+behaviors+during+epithelial+to+mesenchymal+transition+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Rho-kinase and myosin II affect dynamic neural crest cell behaviors during epithelial to mesenchymal transition in vivo.</a> Dev Biol. 324, 236-244 (2008).</li>
</ol>

Die optimale Konzentration der injizierten DNA variiert je nach Größe und Stärke der Promotor-Konstrukt und sollten empirisch ermittelt werden. Die Injektion von zu viel DNA kann zu ungesunden Embryonen mit umfangreichen Zelltod führen, während zu wenig in einem sehr kleinen Teil der injizierten Embryonen exprimieren das Transgen führen wird. Die DNA-Expression korreliert mit der Stärke des Fluorophor-Signal, das von Zelle zu Zelle variiert. Während Sortierung Embryonen unter Epifluoreszenz, schließen diejenigen mit seh...

<table><tbody><tr><td>Tricain (Ethyl-3-aminobenzoat-Methansulfonat)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5040-250G</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard-Silikon-Elastomer-Kit</td><td>Dow Corning</td><td>184</td><td></td></tr><tr><td>QIAfilter-Plasmid-Midi-Kit</td><td>Qiagen</td><td>12243</td><td></td></tr><tr><td>Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt</td><td>Invitrogen</td><td>15517-014</td><td></td></tr><tr><td>Picospritzer</td><td>Parker Hannifin Corporation</td><td>051-0302-900</td><td></td></tr></tbody></table>

live-imaging von zellbewegung und aktin-zytoskelett von einzelnen neuronen und zellen der neuralleiste in zebrafisch-embryos

Live Imaging of Cell Motility and Actin Cytoskeleton of Individual Neurons and Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

Der Zebrafisch ist ein ideales Modell für die Bildgebung Zelle Verhaltensweisen während der Entwicklung in vivo. Zebrafisch-Embryos werden extern befruchtet und damit leicht zugänglich in allen Phasen der Entwicklung. Darüber hinaus ermöglicht die optische Klarheit hochauflösende Bildgebung von Zell-und molekulare Dynamik in die natürliche Umgebung des intakten Embryo. Wir sind mit einem Live-Imaging-Ansatz zur Zelle Verhalten während Neuralleiste Zellmigration und das Auswachsen und Führung des neuronalen Axonen zu analysieren. Live-Bildgebung ist besonders hilfreich für das Verständnis der Mechanismen, die Zellbewegung Prozesse regulieren. Zur Visualisierung Details der Zellbewegung, wie protrusive Aktivität und Molekulardynamik, ist es vorteilhaft, einzelne Zellen markieren. In Zebrafisch, ergibt Plasmid-DNA Injektion eine vorübergehende Mosaik Expressionsmuster und bietet deutliche Vorteile gegenüber anderen Zellmarkierung Methoden. Zum Beispiel, transgenen Linien oft label gesamten Zellpopulationen und damit kann die Visualisierung der feinen Vorsprünge (oder Veränderungen in der molekularen Verteilung) in einer einzelnen Zelle im Dunkeln. Darüber hinaus ist die Injektion von DNA in der Ein-Zell-Stadium weniger invasiv und präziser als Farbstoff Injektionen in späteren Phasen. Hier beschreiben wir eine Methode zur Kennzeichnung von einzelnen Entwicklungsländern Neuronen oder Neuralleistenzellen und Imaging ihr Verhalten in vivo. Wir injizieren Plasmid-DNA in 1-Zell-Stadium Embryonen, die in Mosaik Transgenexpression Ergebnisse. Die Vektoren enthalten Zell-spezifische Promotoren, fahren die Expression eines Gens von Interesse in einer Untergruppe von sensorischen Neuronen oder Neuralleistenzellen. Wir geben Beispiele von Zellen mit Membran gezielt GFP oder mit einem Biosensor-Sonde, die Visualisierung von F-Aktin ermöglicht in lebenden Zellen mit 1 bezeichnet. Erica Andersen, Namrata Asuri und Matthew Lehm trugen gleichermaßen zu dieser Arbeit.

Dieses Protokoll beschreibt Abbildung von einzelnen Neuronen oder Neuralleistenzellen in lebenden Zebrafisch-Embryonen. Diese Methode wird verwendet, um zelluläre Verhaltensweisen und Aktin-Lokalisierung mittels Fluoreszenz konfokalen Zeitraffer-Mikroskopie zu untersuchen.

Live-Imaging von Zellbewegung und Aktin-Zytoskelett von einzelnen Neuronen und Zellen der Neuralleiste in Zebrafisch-Embryos

Der Zebrafisch ist ein ideales Modell für die Bildgebung von Zellverhalten während der In-vivo-Entwicklung. Zebrafischembryonen werden extern befruchtet und sind daher leicht ...

Um das Verhalten einzelner Zellen in vivo abzubilden, wird in Zebrafischembryonen plasmidfreie DNA injiziert, die einen zellspezifischen Promotor enthält, der die Expression eines Fluoreszenzfarbstoffs oder Biosensors steuert. Dynamische Veränderungen in der Wirkung und Verteilung werden in vivo mithilfe eines Biosensors visualisiert, der auf der F-Wirkung und Bindedomäne von Utrophin basiert. Neu befruchtete Embryonen werden entlang der Injektionsrille ausgerichtet und in der Ecke positioniert, die sich zwischen der oberen und unteren Objektträgerplatte bildet.Die DNA, die Fluorofarben oder Biosensoren codiert, wird in die Zelle injiziert. Am nächsten Tag werden die Embryonen in Aros montiert.Auf dem Bildgebungsträger werden die Embryonen so positioniert, dass die markierten Zellen unten liegen, und die Kammer wird mit einem Deckglas versiegelt. Hallo, ich bin Erica Anderson vom Labor von Mary Hallin und den Abteilungen für Zoologie und Anatomie an der University of Wisconsin Madison. Ich bin Nam Tauri, ebenfalls aus dem Hallin-Labor.Und ich bin Matt Clay aus dem Hallin-Labor. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Live-Bildgebung einzelner markierter Zellen in Zebrafischembryonen. Wir verwenden dieses Verfahren im Labor, um die Zellmotilität und Aktindynamik während des Axonwachstums und der Migration neuraler Crest-Zellen zu untersuchen.Beginnen wir also. Um Injektionsobjektträger herzustellen, bereiten Sie zunächst das Cyl-Guard-Silikonelastomer gemäß den Herstelleranweisungen vor. Mischen Sie 10 Teile der Elastomer-Grundmasse mit einem Teil Härter.Verwenden Sie die Zylinderschutzvorrichtung, um drei Standard-Glasmikroskopobjektträger miteinander zu verbinden. Legen Sie zwei Objektträger mit den langen Kanten nebeneinander. Tragen Sie ARD auf den dritten Objektträger auf und platzieren Sie ihn auf die anderen beiden Objektträger.Verwenden Sie gerade genug Kleber, um die Objektträger abzudichten, ohne dass Überschuss zwischen den Objektträgern austritt. Überschüssiger Kleber kann am folgenden Tag mit einem Rasierklingenblatt entfernt werden. Lassen Sie die SIL-Abdeckung über Nacht aushärten, bevor Sie die Objektträger abbilden.Wir verwenden rechteckige Edelstahlplatten, die auf die gleiche Größe wie ein Standard-Glasobjektträger zugeschnitten sind und in deren Mitte ein Loch mit einem Durchmesser von 1,5 Zentimetern ausgeschnitten ist. Ein Deckglas mit einer Kantenlänge von 22 Millimetern wird mit Sylgard auf der Edelstahlplatte befestigt. Sowohl die Injektions- als auch die Abbildungsobjektträger sind wiederverwendbar und können zwischen den Anwendungen mit 70 % Ethanol gereinigt werden, gefolgt von einer Spülung mit Wasser, bevor Embryonen injiziert werden.Verdünnen Sie die DNA auf eine Endkonzentration von 10 bis 50 Mikrogramm pro Milliliter. DNA in 0,2 % Phenolrot in Wasser. Das Phenolrot ermöglicht die Sichtbarmachung während der Injektion.Füllen und kalibrieren Sie als Nächstes die Nadel. Füllen Sie die apolare Kapillarnadel rückwärts mit etwaigen Mikrolitern DNA-Lösung auf. Warten Sie, bis die Nadel vollständig gefüllt ist, und setzen Sie sie anschließend mit feinen Pinzetten in den Nadelsitz der Injektionsvorrichtung ein.Brechen Sie die Spitze der Nadel ab, sodass die Öffnung der Spitze einen Durchmesser von etwa 10 Mikrometern aufweist. Messen Sie den Durchmesser des Tröpfchens in Mineralöl mit einem Okularmikrometer. Um das Injektionsvolumen zu berechnen, stellen Sie die Dauer-Einstellung des Pico-Spritzers entsprechend ein.Der Tröpfchendurchmesser beträgt also 0,12 Mikrometer oder etwa ein Nanoliter Volumen. Eine Dauer von 10 bis 30 Millisekunden ist typisch. Sammeln Sie Einzelzellstadium-Embryonen in E3-Embryomedium und überführen Sie etwa 30 bis 60 Embryonen auf die Injektionsplatte.Positionieren Sie die Embryonen entlang der Kante der oberen Objektträgerplatte und entfernen Sie den größten Teil des E3, sodass die Embryonen durch die Oberflächenspannung an der Platte gehalten werden, wobei eine gebogene Präpariernadel verwendet wird. Drehen Sie die Embryonen, bis die Zelle an der Wand der Injektionsplatte anliegt. Führen Sie die Nadel mit einem Mikromanipulator durch die Chorion des Embryos, durch das Eiweiß und in die einzelne Zelle des Embryos hinein.Injizieren Sie 0,5 bis einen Nanoliter DNA-Lösung in die Zelle. Überführen Sie die injizierten Embryonen in Petrischalen mit E3 und stellen Sie sie in einen Inkubator bei 28,5 Grad Celsius. Falls erforderlich, kann die Entwicklung verlangsamt werden, indem die Embryonen am Tag nach der Injektion bei niedrigerer Temperatur inkubiert werden.Bereiten Sie die Embryonen etwa eine Stunde vor Erreichen des gewünschten Alters für die Bildgebung vor. Entfernen Sie die CORs mit feiner Pinzette von den Embryonen. In der Regel beginnen wir mit der Bildgebung der Embryonen etwa 14 bis 17 Stunden nach der Befruchtung.Wählen Sie anschließend Embryonen mit markierten Zellen unter Verwendung eines Fluoreszenz-ausgestatteten Stereomikroskops aus; wir verwenden ein Forex-Objektiv an einem Nikon-Z-100-Mikroskop aufgrund seiner Kombination aus großer Arbeitsdistanz und hoher Vergrößerung. Geben Sie einen Embryo in ein Mikrozentrifugenröhrchen mit etwa 50 Mikrolitern V drei. Fügen Sie Trica-Stock und geschmolzenes 1 % Low-Melting-Point-Agarose hinzu, um mit einer Weitbore-Glaspipette eine Endkonzentration von 0,02 % Trica herzustellen.Überführen Sie das Embryo unverz&uuml;glich in einer Agrobakterien-Tropfen auf die Deckglasunterlage des Bildgebungsslides, bevor die Aros-L&ouml;sung aush&auml;rtet; positionieren Sie das Embryo so, dass der Bereich mit markierten Zellen nach unten gegen das untere Deckglas gerichtet ist. Danach montieren Sie die Bildgebungskammer. Bestreichen Sie eine Seite eines Plastikrings mit Silikon-Vakuumfett und befestigen Sie ihn an der Metallunterlage f&uuml;r die Bildgebung.Bestreichen Sie die andere Seite des Rings mit Fett. Füllen Sie die Kammer mit E3, das 10 Millimolar HEPES und 0,02 % Trica enthält. Verschließen Sie die Oberseite der Kammer, indem Sie einen 22 mm² großen Deckglaser auf die gefettete Oberfläche des Rings aufsetzen. Das Embryo ist nun bereit für die 4D-Bildgebung, wie im nächsten Abschnitt gezeigt wird.Die Einzelheiten der Bildaufnahme hängen von den spezifischen Eigenschaften Ihres Mikroskopsystems ab. Hier demonstrieren wir den Zeitrafferaufnahmeprozess für das konfokale Mikroskop Olympus FB 1000. Siehe vorherigen JO-Protokoll für die Zeitrafferaufnahme mit dem konfokalen Zeiss-LSM-fünf-10-System.Platzieren Sie die Abbildungskammer in den Objektträgerhalter auf dem Mikroskoptisch und fokussieren Sie den Embryo mit einem 10x- oder 20x-Objektiv. Wechseln Sie unter Durchlichtbeleuchtung zu einem 60x-Objektiv mit einer numerischen Apertur von 1,2 oder höher und fokussieren Sie eine markierte Zelle mit Epifluoreszenz in der FV-Software. Klicken Sie auf „xy wiederholen“, um den Laserscan zu starten.Passen Sie die Aufnahmeeinstellungen und Bildaufnahmesteuerungen an, um die Bildaufnahme einer Z-Serie zu optimieren. Stellen Sie die oberen und unteren Grenzen des Zack sowie die Schrittgröße ein. Aktivieren Sie das Tiefensymbol im Fenster der Bildaufnahmesteuerung und starten Sie die Aufnahme, indem Sie auf das XY,Z-Suite-Symbol klicken, um eine Zeitrafferserie aufzunehmen.Stellen Sie das Zeitintervall und die Anzahl der Zeitpunkte unter dem Zeit-Scan ein. Überschrift im Erfassungseinstellungsfenster, klicken Sie auf das Zeit-Symbol im Bildaufnahme-Steuerungsfenster und starten Sie die Erfassung, indem Sie auf das XYZT-Suite-Symbol klicken. Hier präsentieren wir repräsentative Filme und Bilder einzelner markierter Zellen.Wenn einzelne Neuronen markiert sind, werden ihre Axone nicht durch andere markierte Zellen verdeckt, sodass die OD-Ausstülpungen an Axonen und Wachstumskonen deutlich sichtbar sind. Dieser Film zeigt ein sensorisches Neuron, das mit dem membrangezielten Marker tagRFP markiert ist. Es bildet zwei Axone in entgegengesetzte Richtungen aus, die aus dem Bildfeld hinauswachsen.Ein drittes Axon erstreckt sich orthogonal vom Zellkörper und bildet Verzweigungen. Ebenso ermöglicht die Markierung einzelner Neuralleistenzellen die Abbildung feiner zellulärer Fortsätze, die mit der Zellmotilität assoziiert sind. Hier sind zwei Neuralleistenzellen mit membranzielgerichtetem GFP markiert.Sie zeigen eine ausgeprägte Vorwärtsaktivität während der Migration in anteriorer Richtung. Es ist oft hilfreich, einzelne Zellen innerhalb einer transgenen Linie zu markieren, um Wechselwirkungen zwischen benachbarten Zellen innerhalb einer Population sichtbar zu machen. Dieses Bild zeigt ein Embryo mit stabiler Expression von GFP in allen Sinnesneuronen, das mit DNA injiziert wurde, die Tag-RFP kodiert, um ein Neuron vor dem Hintergrund grüner Neuronen rot zu färben, nach Injektion der DNA, die kodiert.Die Aktin-Biosensorsonde zeigt ein stärkeres Signal in Wachstumskonen und dynamischen Ausstülpungen entlang neu gebildeter Axone im Vergleich zum Zellkörper. In einem späteren Stadium bleibt das Signal in Wachstumskonen stark, während reife Axone ein deutlich schwächeres Signal aufweisen. Soeben haben wir Ihnen gezeigt, wie man die Live-Bildgebung einzelner markierter Neuronen und Neuralleistenzellen in Zebrafischembryonen durchführt.Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, Embryonen auszuwählen, in denen die DNA nicht in ausreichend hohen Mengen exprimiert wird, um Toxizität oder Zelltod hervorzurufen. Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

In diesem Video zeigen wir eine Methode, mit der sich entwickelnden Gehirn Wirbeltiere in Live Zebrafischembryonen bei einzelnen Zelle Auflösung durch konfokale Mikroskopie zu analysieren. Dazu gehört auch die Methode, mit der wir spritzen die Single-Cell-Zebrafischembryo und anschließend montieren und Bild das sich entwickelnde Gehirn.

Live-Imaging der Zebrafisch embryonalen Gehirn durch konfokale Mikroskopie

Schlüssel zum Verständnis der morphogenetischen Prozesse, die der frühe Embryo Form ist die Möglichkeit, Bild-Zellen in hoher Auflösung. Wir beschreiben hier eine Methode zur Kennzeichnung einzelner Zellen oder kleine Gruppen von Zellen in ganzen Zebrafisch-Embryos mit Membran-bezogene Green Fluorescent Protein.

Labeling und Imaging Cells in der Zebrafisch Hinterhirn

Die vorliegende Video zeigt eine Methode, die nutzt die Kombination von Elektroporation und konfokale Mikroskopie, um Live-Aufnahmen zu den einzelnen neuronalen Vorläuferzellen im sich entwickelnden Zebrafisch Vorderhirn führen.

Zeitraffer-Live-Imaging von klonal verbundenen neuronalen Vorläuferzellen in der Entwicklung von Zebrafisch Vorderhirnneuronen

Sterbenden Zellen werden extrudiert aus epithelialen Geweben durch konzertierte Kontraktion der benachbarten Zellen ohne Unterbrechung Barrierefunktion. Die optische Klarheit zu entwickeln Zebrafisch bietet ein hervorragendes System der Extrusion in lebenden Epithelien zu visualisieren. Hier beschreiben wir Methoden zu induzieren und Bild Extrusion in der Larven Zebrafisch Epidermis auf zellulärer Auflösung.

Live-Bildgebung von Zell Extrusion aus der Epidermis der Entwicklung von Zebrafisch

Quelle: Williams, A. L., et al. Multi-Photonen-Zeitraffer-Bildgebung zur Visualisierung der Entwicklung in Echtzeit: Visualisierung von wandernden Neuralleistenzellen in Zebrafischembryonen. J. Vis. Exp. (2017)Dieses Video zeigt ein Multi-Photonen-Zeitraffer-Bildgebungsprotokoll, um die Migration von Neuralleistenzellen in einem Zebrafischembryo in Echtzeit mit hoher Auflösung zu visualisieren.

Visualisierung der Migration von Neuralleistenzellen in einem Zebrafischembryo mit Hilfe von Multiphotonen-Zeitraffer-Bildgebung

Die Abbildung des dynamischen Verhaltens von Organellen und anderen subzellulären Strukturen in vivo kann Aufschluss über ihre Funktion unter physiologischen und Krankheitsbedingungen geben. Hier stellen wir Methoden vor, mit denen zwei Organellen, Zentrosomen und Mitochondrien, genetisch markiert und ihre Dynamik in lebenden Zebrafischembryonen mittels Weitfeld- und Konfokalmikroskopie abgebildet werden können.

Imaging subzellulärer Strukturen in der Living Zebrafischembryo

Die hier beschriebenen Protokolle ermöglichen die Untersuchung der elektrischen Eigenschaften erregbarer Zellen unter den meisten nicht-invasiven physiologischen Bedingungen, indem Zebrafischembryonen in einem in vivo-System zusammen mit einem auf Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer (FRET) basierenden genetisch kodierten Spannungsindikator (GEVI) verwendet werden, der selektiv in dem interessierenden Zelltyp exprimiert wird.

Biosensing Motor Neuron Membran Potenzial in Live Zebrafisch Embryos

Eine Kombination der erweiterten optischen Techniken der Laser-scanning-Mikroskopie mit langen Wellenlänge Multi-Photonen Fluoreszenzanregung wurde implementiert, um hochauflösende, dreidimensionale, Echtzeit-Bildgebung der Neuralleiste Migration mit Tg (Sox10:EGFP) und Tg (Foxd3:GFP) Zebrafish Embryos zu erfassen.

Multi-Photonen-Time Lapse Imaging Entwicklung in Echtzeit zu visualisieren: Visualisierung der Migration Neuralleisten-Zellen in den Zebrafish Embryos

Wir demonstrieren eine Methode, die die Vorteile der schnellen konfokalen Rastermikroskopie nutzt, um Live-Bildgebung von Mikrogliazellen im sich entwickelnden optischen Tectum des Zebrafisches durchzuführen und so die Dynamik dieser Zellen in vivo zu analysieren.

Live-Bildgebung und Charakterisierung der Mikroglia-Dynamik im Zebrafischembryo

Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll vor, um die neuronale Aktivität in Gehirnregionen transgener Zebrafische, die GCaMP-Kalziumindikatoren exprimieren, mittels konfokaler Mikroskopie zu untersuchen.

Im lebenden Organismus Konfokale Fluoreszenzbildgebung der durch sensorische Stimulation induzierten neuronalen Aktivität bei teilweise gefesselten Zebrafischlarven

Die neuromuskuläre Verbindung der Zebrafischlarve ist ein attraktives Modell für die Untersuchung der synaptischen Physiologie. Es ist für viele experimentelle Techniken zugänglich, einschließlich Elektrophysiologie und optischer Bildgebung. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Abbildung der synaptischen Übertragung mit einer pHluorin-basierten Sonde unter einem aufrechten Epifluoreszenzmikroskop.

Live-Bildgebung des synaptischen Vesikelrecyclings in der neuromuskulären Verbindung von sezierten Zebrafischlarven

Lernen Sie Live-Imaging einzelner Neuronen und Neuralleistenzellen in Zebrafisch-Embryos. Diese Methode ermöglicht die Analyse von Zellbewegung und Aktin-Zytoskelett-Dynamik mittels konfokaler Fluoreszenzmikroskopie.

Live-Imaging von Zellbewegung und Aktin-Zytoskelett von einzelnen Neuronen und Zellen der Neuralleiste in Zebrafisch-Embryos

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