Live-Imaging von Zellbewegung und Aktin-Zytoskelett von einzelnen Neuronen und Zellen der Neuralleiste in Zebrafisch-Embryos

Um das Verhalten einzelner Zellen in vivo abzubilden, wird Plasma-DNA, die einen zellspezifischen Promotor enthält, der die Expression einer Flora oder eines Biosensors antreibt, in Zebrafischembryonen injiziert. Dynamische Änderungen der Wirkung in der Verteilung werden in vivo mit Hilfe eines Biosensors auf Basis des F-Effekts und der Bindungsdomäne von Utrophin sichtbar gemacht. Frisch befruchtete Embryonen werden entlang des Injektionsschiebers aufgereiht und in der Ecke positioniert, die zwischen dem oberen und dem unteren Objektträger gebildet wird.

DNA, die für Fluor-Fours oder Biosensoren kodiert, wird in die Zelle injiziert. Am nächsten Tag. Die Embryonen werden in Aros montiert.

Auf dem Objektträger werden die Embryonen mit den markierten Zellen nach unten positioniert und die Kammer mit einem Deckglas verschlossen. Hallo, ich bin Erica Anderson vom Labor von Mary Hallin und den Abteilungen für Zoologie und Anatomie an der University of Wisconsin Madison. Ich bin Nam Tauri, ebenfalls vom Hallin Lab.

Und ich bin Matt Clay vom Hallin Lab. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Live-Bildgebung von individuell markierten Zellen in Zebrafisch-Embryonen. Wir verwenden dieses Verfahren in einem Labor, um die Zellmotilität und Aktindynamik während des Axonwachstums und der Migration von Neurokammzellen zu untersuchen.

Also lasst uns loslegen. Um die Injektionsschieber zuerst zu montieren, bereiten Sie cyl guard Silikonelastomer gemäß den Anweisungen des Herstellers vor. Mischen Sie 10 Teile der Elastomerbasis mit einem Teil Härter.

Verwenden Sie den Zylinderschutz, um drei Standard-Objektträger aus Glas miteinander zu verbinden. Ordnen Sie zwei Folien nebeneinander an den langen Rändern an. Wenden Sie ARD auf die dritte Folie an und legen Sie sie auf die beiden anderen Folien.

Verwenden Sie gerade so viel Zigarre, dass die Objektträger versiegelt sind, ohne dass überschüssiges Wasser zwischen den Objektträgern hervorquillt. Überschüssige Schüsse können am nächsten Tag mit einer Rasierklinge entfernt werden. Lassen Sie den SIL-Schutz über Nacht einwirken, um Objektträger zu bebildern.

Wir verwenden Rechtecke aus Edelstahl, die auf die gleiche Größe wie ein Standard-Glasmikroskop-Objektträger zugeschnitten sind, mit einem 1,5 Zentimeter großen Loch in der Mitte. Auf dem Stahlrechteck wird ein 22 Millimeter großer, quadratischer Deckglas mit Syl-Schutz befestigt. Sowohl die Injektionspräparate als auch die bildgebenden Objektträger sind wiederverwendbar und können zwischen den Anwendungen mit 70 % Ethanol gereinigt werden, gefolgt von einer Spülung mit Wasser vor der Injektion der Embryonen.

Verdünnen Sie die DNA auf eine Endkonzentration von 10 bis 50 Mikrogramm pro Milliliter. DNA in 0,2% Phenylrot in Wasser. Das Phenylrot ermöglicht die Visualisierung während der Injektion.

Füllen und kalibrieren Sie anschließend die Nadel. Füllen Sie die Apol-Kapillarnadel mit ca. Mikrolitern DNA-Lösung auf. Warten Sie, bis sich die Nadel gefüllt hat, und führen Sie sie dann mit einer feinen Pinzette in den Nadelhalter des Injektionsgeräts ein.

Brechen Sie die Spitze von der Nadel ab, so dass die Spitzenöffnung einen Durchmesser von etwa 10 Mikrometern hat. Messen Sie den Durchmesser des Tröpfchens in Mineralöl mit einem Okularmikrometer. Um das Injektionsvolumen zu berechnen, passen Sie die Dauer der Pico-Schorle an.

Der Tröpfchendurchmesser beträgt also 0,12 Mikrometer oder etwa einen Nanoliter Volumen. Typisch ist eine Dauer von 10 bis 30 Millisekunden. Entnahme von Embryonen im Zellstadium in E 3-Embryo-Medium und Transfer von etwa 30 bis 60 Embryonen auf den Objektträger.

Positionieren Sie die Embryonen entlang des Randes des oberen Objektträgers und entfernen Sie den größten Teil des E drei, so dass die Embryonen durch Oberflächenspannung mit einem gebogenen Präparierstift am Objektträger gehalten werden. Drehen Sie die Embryonen so, dass die Zelle an der Wand des Injektionsobjektträgers anliegt. Verwenden Sie einen Mikromanipulator, um die Nadel durch das Embryokorion durch das Eigelb in die einzelne Zelle des Embryos zu führen.

Injizieren Sie 0,5 bis einen Nanoliter DNA-Lösung in die Zelle. Übertragen Sie die injizierten Embryonen in Petrischalen in E drei und legen Sie sie in einen Inkubator bei 28,5 Grad Celsius. Falls erforderlich, kann die Entwicklung verlangsamt werden, indem die Embryonen am Tag nach der Injektion bei niedrigerer Temperatur inkubiert werden.

Bereiten Sie die Embryonen etwa eine Stunde bevor die Embryonen das gewünschte Alter für die Bildgebung erreichen, für die Bildgebung vor. Entnehmen Sie die CORs mit einer feinen Pinzette aus den Embryonen. Wir beginnen in der Regel etwa 14 bis 17 Stunden nach der Befruchtung mit der Bildgebung von Embryonen.

Als nächstes wählen wir Embryonen mit markierten Zellen mit einem Präpariermikroskop aus, das mit Fluoreszenz ausgestattet ist, und verwenden ein Forex-Objektiv an einem Nikon a Z 100-Zielfernrohr, da es einen großen Arbeitsabstand und eine hohe Vergrößerung kombiniert. Setzen Sie einen Embryo in ein Mikrofuge-Röhrchen mit etwa 50 Mikrolitern V drei ein. Geben Sie Trica-Brühe hinzu und schmelzen Sie Agros mit einem niedrigen Schmelzpunkt, um mit einer breiten Borg-Glaspipette eine Endkonzentration von 0,02 % Trica zu erreichen.

Übertragen Sie den Embryo sofort in einem Agro-Tropfen auf das Deckglas des Objektträgers, bevor der Aros aushärtet, positionieren Sie den Embryo so, dass die Region mit den markierten Zellen nach unten gegen den unteren Deckschirm zeigt. Bauen Sie anschließend die Bildgebungskammer zusammen. Beschichten Sie eine Seite eines Kunststoffrings mit Silikon-Vakuumfett und befestigen Sie es auf dem Metallbild.

Schieben Sie die andere Seite des Rings mit Fett ein. Füllen Sie die Kammer mit E drei mit 10 Millimolar Haufen und 0,02 % Trica versiegelte die Kammeroberseite, indem Sie einen 22 Quadratmillimeter großen Deckglas an der oberen gefetteten Oberfläche des Rings befestigten. Der Embryo ist nun bereit für die Vier-D-Bildgebung, wie im nächsten Abschnitt gezeigt wird.

Die Details der Bildaufnahme hängen von den Besonderheiten Ihres Mikroskopsystems ab. Hier demonstrieren wir den Zeitraffer-Aufnahmeprozess für das konfokale Mikroskop FB 1000 von Olympus. Siehe vorheriges JO-Protokoll für die Zeitrafferaufnahme mit dem konfokalen Zeiss LSM five 10.

Setzen Sie die Bildgebungskammer in den Objektträgerhalter auf dem Mikroskoptisch ein und fokussieren Sie den Embryo mit einem 10-fach- oder 20-fach-Objektiv. Schalten Sie bei Durchlicht auf eine 60-fache objektive numerische Apertur von 1,2 oder höher um und fokussieren Sie in der FV-Software auf eine markierte Zelle mit Epi-Fluoreszenz. Klicken Sie auf xy repeat, um den Laserscanvorgang zu starten.

Passen Sie die Aufnahmeeinstellungen und die Bildaufnahmesteuerung an, um das Bild für die Aufnahme einer Z-Serie zu optimieren. Legen Sie die obere und untere Grenze des Zack zusammen mit der Schrittgröße fest. Aktivieren Sie das Tiefensymbol im Steuerungsfenster für die Bildaufnahme und starten Sie die Aufnahme, indem Sie auf das Symbol XY, Z Suite klicken, um eine Zeitrafferserie aufzunehmen.

Legen Sie das Zeitintervall und die Anzahl der Zeitpunkte unter dem Zeitscan fest. Klicken Sie im Fenster mit den Aufnahmeeinstellungen auf das Zeitsymbol im Steuerungsfenster für die Bildaufnahme und starten Sie die Aufnahme, indem Sie auf das Symbol für die XYZT-Suite klicken. Wir präsentieren hier repräsentative Filme und Bilder von einzelnen markierten Zellen.

Wenn einzelne Neuronen markiert werden, werden ihre Axone nicht von anderen markierten Zellen verdeckt und somit sind die OD-Erweiterungen an Axonen und Wachstumskegeln deutlich sichtbar. Dieser Film zeigt ein sensorisches Neuron, das mit einem membrangesteuerten Tag RFP markiert ist. Er erstreckt sich über zwei Axone in entgegengesetzte Richtungen, die aus dem Gesichtsfeld herauswachsen.

Ein drittes Axon erstreckt sich orthogonal vom Zellkörper aus und bildet Veräste. In ähnlicher Weise ermöglicht die Markierung einzelner Neuralleistenzellen die Abbildung feiner zellulärer Prozesse, die mit der Zellmotilität verbunden sind. Hier werden zwei Neuralleistenzellen mit membrangesteuertem GFP markiert.

Sie zeigen eine ausgeprägte protrusive Aktivität, während sie in anteriore Richtung wandern. Oft ist es sinnvoll, einzelne Zellen innerhalb einer transgenen Linie zu markieren, um Wechselwirkungen zwischen benachbarten Zellen innerhalb einer Population sichtbar zu machen. Dieses Bild zeigt einen Embryo mit stabiler GFP-Expression in allen sensorischen Neuronen, dem das DNA-kodierende Tag RFP injiziert wurde, um ein Neuron rot zu markieren, während grüne Neuronen in die DNA-Kodierung injiziert wurden.

Die Aktin-Biosensorsonde zeigt im Vergleich zum Zellkörper eine stärkere Signalwirkung in Wachstumskegeln und dynamischen Vorsprüngen entlang neu gebildeter Axone. In einem späteren Stadium bleibt das Signal in den Wachstumskegeln stark, während reife Axone ein deutlich schwächeres Signal aufweisen. Wir haben Ihnen gerade gezeigt, wie Sie Live-Bildgebung von individuell markierten Neuronen und Neuralleistenzellen in Zebrafischembryonen durchführen können.

Bei diesem Verfahren ist es wichtig, Embryonen zu wählen, bei denen die DNA nicht hoch genug exprimiert wird, um Toxizität oder Zelltod zu verursachen. Das war's also. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.