Name: Synthese und Kalibrierung von Phosphorescent Nanoprobes für Oxygen Imaging in Biological Systems (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-03-03T17:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 38 s
Description: Lernen Sie die Synthese und Kalibrierung phosphoreszierender Nanosonden für die Sauerstoffbildgebung in biologischen Systemen. Diese Methode nutzt Platin- und Palladium-Porphyrin-Dendrimere für präzise Messungen.

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Unterstützung der Zuschüsse EB007279 und HL081273 von der NIH USA gedankt.

1. Allgemeine Beschreibung der Sauerstoff Messprotokoll (Dieser Abschnitt hat keine Wirkung, ist aber von entscheidender Bedeutung für das Verständnis der Rest des Papiers. Es gefilmt kann zum Beispiel sein, als eine Folge von ein paar Power Point Folien, begleitet von der Stimme.) 1,1) Die Sonde in das Medium von Interesse geliefert wird, zum Beispiel im Blut oder interstitielle Flüssigkeit eines Tieres injiziert. 1,2) Das Objekt (Oberfläche des Gewebes) ist mit dem Licht einer geeigneten Wellenlänge beleuchtet, um die Sonde in den angeregten Triplett-Zustand zu fördern. Typischerweise Anregung erfolgt über die Ein-Photonen-Mechanismus. Doch im Fall von speziellen Zwei-Photonen-enhanced-Sonden kann die Anregung über die Zwei-Photonen-Mechanismus, der mit den Sonden in der hochauflösenden Mikroskopie-Anwendungen ermöglicht erfolgen. Ein-Photonen-Anregung generell weniger räumliche Auflösung, erfordert aber einfacher Instrumentierung und können in Ein-Punkt-Messungen mit LED-basierten Glasfaser-phosphorometers verwendet werden. 1,3) Phosphoreszenz von der Sonde emittierten stammt aus dem langlebigen Triplett-Zustand. Die Sondenmolekül müssen speziell ausgelegt werden, um hohe Quantenausbeute der Triplett-Zustand geben und emittieren Phosphoreszenz statt Fluoreszenz. Während in den Triplett-Zustand, kann die Sonde collisional Begegnungen mit Sauerstoffmoleküle, die de-aktivieren Sie die Triplett-Zustand erleben können - ". Abschrecken" einen Prozess namens In Abwesenheit von Sauerstoff, die Lebensdauer des Triplett-Zustand, und damit der Phosphoreszenz Verfall, ist τ 0. In Anwesenheit von Sauerstoff wird die Phosphoreszenz Lebensdauer (τ) als Folge der Löschung verkürzt. Es gibt eine direkte Beziehung zwischen der Lebensdauer des Triplett-Zustand und die Menge an Sauerstoff in die Umwelt. Dies ist der bekannte Stern-Volmer-Beziehung, die die Lebensdauer (τ) der Phosphoreszenz verbindet Sauerstoffkonzentration [O 2] (oder Sauerstoff-Partialdruck pO 2): <img src="/files/ftp_upload/1731/1731equation.jpg" alt="Gleichung" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Gleichung"> In biologischen Systemen ist Sauerstoff bei weitem die effektivste Quencher der Phosphoreszenz, die die Phosphoreszenz Abschreckverfahren sehr selektiv zu Sauerstoff macht. 1,4) Um die Lebensdauer t zu messen, werden die emittierten Photonen in phosphoreszierenden Zeit binned. Zum Beispiel, nach dem Anregungspuls, vielleicht 200 Photonen in den ersten 15 Mikrosekunden erfasst werden, 150 Photonen in den nächsten 15 Mikrosekunden gesammelt, und so weiter, bis keine Photonen gesammelt werden. Die Zahlen in den Behälter gegen die Zeit aufgetragen geben die Phosphoreszenz Fäulnis, die analysiert werden, um die Lebensdauer τ Ausbeute ist. In Bildgebung, ist dieses Verfahren in jedem Pixel des Bildes angewendet, was zu Phosphoreszenz Lebensdauer Karten. Messungen der Lebensdauer sind unempfindlich gegen die Heterogenitäten der Sonde Verteilung über das Objekt, das gemeinsam für biologische Proben ist. So berichten Lebenszeiten nur auf Sauerstoff. Lifetimes τ sind in Sauerstoff-Konzentrationen mit der Stern-Volmer-Beziehung umgewandelt. 2. Bau von phosphoreszierenden Sonden Phosphorescent Sonden für Sauerstoff-Messungen in biologischen Systemen bestehen aus phosphoreszierenden Chromophore (Kerne), in Käfige von Dendrimeren aufgebaut gekapselt - sehr regelmäßigen hyperverzweigten Polymeren [3]. Dendrimere schützen die Kerne von Wechselwirkungen mit der Umwelt und die Kontrolle der Geschwindigkeit der Sauerstoff-Diffusion an die Kerne, die es ermöglicht, die Empfindlichkeit und Dynamik der Sonden (k q in der Stern-Volmer-Beziehung) zu optimieren. Die Termini der Dendrimere sind mit chemisch inerten hydrophilen Polyethylenglykol (PEG) modifiziert, so dass die Sonden hoch wasserlöslich und verhindert deren Wechselwirkungen mit biologischen Makromolekülen. Phosphorescent Kerne der Sonden sind Pt-oder Pd-Komplexe von Porphyrinen und π-erweiterten Porphyrine. π-Extended Porphyrine Porphyrine in die Pyrrolringe mit externen aromatischen Fragmenten fusioniert sind. π-Extension ermöglicht Abstimmung der Sonden spektroskopischen Eigenschaften an die Anforderungen eines bestimmten Imaging-Anwendung (z. B. Mikroskopie vs Tomographie) zu befriedigen. Als Beispiel beschreiben wir Synthese von Pd tetaaryltetrabenzoporphyrins (PdAr 4 TBP) [4]. PdAr 4 TBP ist über leistungsfähige Absorptionsbanden im fernen roten Teil des Spektrums und starke Phosphoreszenz, auch für die biologische Sauerstoff-Messungen geeignet. Die Synthese von PdAr 4 TBP ist besteht aus folgenden Schritten: 2,1) Vorbereitung der tetraaryltetracyclohexenoporphyrins (Ar4TCHP) von Lindsey Kondensation [5] tetrahydroisoindole mit substituierten Benzaldehyden. Um eine 0,01 M Lösung von tetrahydroisoindole (1 eq) in CH &lt;sub&gt; 2 Cl 2 der aromatischen Aldehyd (1 eq) wurde unter Argon zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde für 10 min im Dunkeln bei RT BF 3 XET 2 O (0,2 eq) wurde zugegeben und die Reaktionsmischung wurde bei Raumtemperatur für weitere 2 h gerührt DDQ (1 eq) zugegeben und das Gemisch wurde über Nacht unter ständigem Rühren gelassen. Die Lösung wurde mit 10% aq Na 2 SO 3 gewaschen, 10% aq Na 2 CO 3, 5% aq. HCl und schließlich mit Sole. Die organische Phase wurde über Na 2 SO 4 getrocknet, dann im Vakuum konzentriert. Tert-Butyl-Ether-Mischung zu geben, Ar 4 TChP als grünes Pulver - Der Rückstand wurde aus CH 2 Cl 2 umkristallisiert. Die Erträge sind etwa 50%. 2,2) Insertion von Pd zu erhalten PdAr 4 TCHPs. Free-Basis Porphyrine (1 eq) wurden mit PdCl 2 oder Pd (OAc) 2 (1.2 eq) in siedendem CH 3 CN in Gegenwart eines Überschusses von Et 3 N (20 eq) behandelt. Der Umsatz wurde durch UV-Vis-Spektroskopie überwacht (Lösungsmittel CH 2 Cl 2-AcOH) und als abgeschlossen, nachdem die Soret-Bande von Diktaten auf 468-472 nm verschwunden. Die Mischung ließ man abkühlen, verdünnt mit CH 2 Cl 2 und durch eine dünne Schicht von Celite auf Pd (0) zu entfernen. Das Lösungsmittel wurde verdampft und der Rückstand wurde durch Chromatographie an Kieselgel mit CH 2 Cl 2 als Lösungsmittel gereinigt. Dunkelrot Fraktion gesammelt wurde, wurde das Lösungsmittel verdampft, um Ziel-PdAr 4 TCHPs in nahezu quantitativer Ausbeute. 2,3) PdAr 4 TBP Jahre waren durch Oxidation von PdAr 4 TCHPs mit dem 2-fachen Überschuss von DDQ (16 eq) in THF unter Rückfluss erhitzt vorbereitet. Während siedendem, änderte sich die Farbe von dunkel-rot bis tief-grün. Das Lösungsmittel wurde eingedampft, der Rückstand mit CH 2 Cl 2 verdünnt, mit 10% aq Na 2 SO 3, Wasser und Sole. Die organische Phase wurde über Na 2 SO 4 getrocknet und im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wurde durch Chromatographie an Kieselgel (Laufmittel CH 2 Cl 2) gereinigt. Die erste dunkelgrüne Fraktion wurde gesammelt, konzentriert im Vakuum auf 85-90% der als blau-grünes Pulver PdAr4TBP ist zu geben. 2,4) Peripheral Estergruppen Pd Tetrakis-(3,5-dibutoxycarbonylphenyl)-Tetrabenzoporphyrin (PdAr4TBP) wurden hydrolysiert mit 10-facher Überschuss an KOH in 1% (v / v) Wasser / THF bei RT. Das Lösungsmittel wurde aus dem Niederschlag des gebildeten Kaliumsalze von Carbonsäurederivaten PdAr4TBP ist dekantiert. Die Feststoffe wurden in Wasser gelöst, gerührt für weitere 2 h, mit konz. HCl auf pH ~ 4-5. Der erhaltene Niederschlag wurde durch Zentrifugieren isoliert, mit Wasser gewaschen und im Vakuum getrocknet. Schützen Dendronen. Jeder einzelne Zweig der Dendrimer heißt dendron. Schützen Dendrone sind aus Aryl-Glycin (AG) Bausteinen aufgebaut. AG Dendrone kann leicht aus billigen Ausgangsstoffen synthetisiert und isoliert werden in hoher Reinheit und Ausbeute durch Chromatographie-free-Methoden. Synthese von Generation 2 (G2) AG-dendron besteht aus folgenden Schritten: 2,4) Synthese der Bausteine, Boc-geschützte 3,5-dicarboxyphenyl glycineamide und 3,5-dibutoxycarbonylphenyl glycineamide, mit der Fischer Haloacyl Halogen-Methode. 2,5)-Kupplung der Bausteine ​​mit CDMT / NMM Peptidkopplung Chemie. 2,6) Entschützen der Schwerpunkt Aminogruppe durch Rühren der Lösung der G2 dendron in TFA 2 h bei RT 2,7) Für die Montage der höheren Generation Dendrone sind Kupplung / Entschützung Schritte wiederholt. Dendrimer Montage ist durch die Kopplung des entschützten Dendronen PdAr4TBP (oder andere Porphyrin) mit dem HBTU / DIPEA Kopplungschemie erreicht. 2,8) werden zunächst die Boc-Schutzgruppen aus den dendron entfernt. Zum Beispiel wurde Boc-geschützten G3 dendron (0,58 g) in TFA (15 ml) gelöst und die Mischung wurde bei RT 2h reagieren. Die Säure wurde durch Rotationsverdampfung entfernt, was die dendron als TFA-Salz. Der Rückstand wurde in trockenem NMP (10 ml) gelöst und ein paar Tropfen DIPEA wurden hinzugefügt, um die Spuren von TFA zu stillen. 2,9) Vor Beginn der Kupplungsreaktion ist es entscheidend, um sich vollständig aufzulösen Porphyrin. So wurde zum Beispiel Pt tetracarboxyphenylporphyrin (0,061 g) in trockenem NMP (65 ml) unter Erhitzen auf 140 ° C gelöst für 10 min unter Stickstoff strömen. 2,10) Die Lösung auf Raumtemperatur abgekühlt wurde HBTU (0,211 g) zugegeben und das Gemisch wurde für 5 min gerührt. 2,11) DIPEA (0,35 ml) wurde zu dem Gemisch in einer Portion zugegeben, unmittelbar gefolgt von der Zugabe des Lö gefolgtauf der TFA-Salz der dendron in NMP (siehe 2,8), und die Mischung wurde über Nacht unter Rühren. 2,12) Das Gemisch wurde in 3% aq gegossen. NaCl (350 ml), und der entstandene Niederschlag wurde durch Zentrifugation gesammelt und mit Wasser gewaschen, MeOH und Et 2 O durch wiederholte Aussetzung / Zentrifugation, um das Ziel Porphyrin-Dendrimer erhalten. 2,13) ​​zu den peripheren Estergruppen hydrolysieren, wurde das Dendrimer zuerst mit NMe 4 OH (~ 5 mM) in DMSO / MeOH über 20-60 min Dauer, durch die vollständige Entfernung des Lösungsmittels behandelt, gefolgt. Dieses Verfahren erlaubt es uns, Dendrimere mit ausreichenden Zahl von Carboxylatgruppen zu Wasserlöslichkeit geben zu generieren. Zur Vervollständigung der Hydrolyse wurde das Dendrimer mit 0,1 N wässriger NaOH (overnight) behandelt. Als Ergebnis konnte rein Porphyrin-Dendrimer-Carbonsäuren in 80-95% Ausbeute isoliert werden. Änderung der Dendrimer-Peripherie. An dieser Stelle, ausgehend von der gleichen Porphyrin-Dendrimer, entweder ein-oder Zwei-Photonen-Sonden synthetisiert werden können. Im ersten Fall werden alle peripheren Carboxylgruppen mit PEG-Einheiten verändert - eine Methode, wie PEGylierung bekannt. Im letzteren Fall sind mehrere Carboxylgruppen zunächst mit Zwei-Photonen-Antenne Chromophore (Cumarin-343) modifiziert mit Ethylendiamin (EDA)-Linker, gefolgt von PEGylierung der verbleibenden Carboxylgruppen [6]. Gekoppelt Dendrimere wurden PEGylierte mit monomethoxyoligoethyleneglycolamine (m-PEG-NH 2, Av. MW 1000) mit HBTU / DIPEA Kopplungschemie. 2,14) Zu einer Lösung des dendron in NMP (oder DMF) (1-10 mM) 1,25-fachen Überschuss von HBTU zugegeben und die Reaktionsmischung wurde bei RT für 10 min gerührt. 6,25-fachen Überschuss von DIPEA zugegeben, gefolgt von der sofortigen Zugabe von 1,25-fachen Überschuss von m-PEG-NH2. Die Reaktionsmischung wurde 2 Tage bei RT gerührt. Diethylether zur Reaktionsmischung zugegeben wurde, wurde der gebildete Niederschlag durch Zentrifugation und wieder ausgefällt aus THF durch Zugabe von Diethylether getrennt. 2,15) Endreinigung wurde mit Größenausschlusschromatographie durch das Sammeln der ersten Front Phase erreicht. PEGylierte Porphyrin-Dendrimer wurde in einer kleinen Menge THF (~ 15 ml) gelöst und auf der Oberseite eine Chromatographiesäule mit Polystyrol SEC Phase (Biorad, Biobeads S-X1) gefüllt. Die Säule wurde mit reinem THF eluiert und die dunkle Band bewegt sich mit der Front gesammelt wurde. 2,16) THF wurde am Rotationsverdampfer entfernt und das verbleibende Material wurde im Vakuum getrocknet. 3. Probe Charakterisierung Photophysikalische Charakterisierung umfasst Messungen der Sonde Absorptions-und Emissionsspektren, Phosphoreszenz Lebensdauer τ 0 und Stern-Volmer-Sauerstoff-Konstanten k q unter physiologischen Bedingungen. 3,1) Die Absorptions-und Emissionsspektren sind unter Umgebungsbedingungen mit Standard-Instrumentierung (Spektralphotometer und stetige Fluorometer) erhalten. ~ 1 uM Lösungen der Sonde verwendet wird. 3,2) Als nächstes wird der Stern-Volmer Eichkurve erhalten. Dies ist die wichtigste Messung, weil es uns um die Lebensdauer der Sonde auf die Sauerstoffkonzentration beziehen können. 3,3) eine Lösung der Sonde in PBS-Puffer (pH 7,2) wird in einem speziellen zylindrischen Küvette, die innerhalb der temperierten Kammer positioniert ist, in einem lichtundurchlässigen Käfig mit Anschlüssen für Anregung und Emission optischer Fasern platziert. Die Fasern werden in engen Kontakt mit der Küvette im Inneren der Kammer in den rechten Winkel Geometrie gebracht. 3,4) Die Küvette wird mit einem Stopfen verschlossen, in die ein hochempfindliches Clark-Typ Sauerstoffelektrode (CK-Sauerstoff-Elektrode) eingefügt wird. Der Stopfen enthält auch zwei Nadel-Anschlüsse für Ein-und Austritt von Argon. Die Elektrode wird in die Lösung eingetaucht, während die Nadeln nur für die Strömung des Gases fließen über der Lösung Oberfläche zu versehen. Zunächst wird Argon nicht mit dem Einlass verbunden. 3,5) wird die Temperatur auf den gewünschten Wert (in der Regel 36-37 ° C) eingestellt und die Lösung wird unter Rühren zur Äquilibrierung links. 3,6) Die Anregung Faser ist die Anregung Anschluss eines digitalen phosphorometer, von einem PC betrieben wird. Die Lichtquelle in der phosphorometer ist ein High-Power-LED, deren Ausgang wird durch einen 333 kHz D / A-Board gesteuert. Die Emission Faser ist eine andere optische Schnittstelle des phosphorometer, was zu einer stark IR-empfindliche APD (Avalanche-Fotodiode) gekoppelt ist. Der Ausgang der Diode wird verstärkt und in die A / D-Kanal der gleichen Steuerkarte, die Synchronisation zwischen dem Anregungs-und Emissions-Kanälen ermöglicht. 3,7) Die Steuerungssoftware alTiefs Generation von Anregungspulsen beliebiger Länge (zB 5 oder 10 ms), durch Sammlung von Phosphoreszenz Zerfall während einer willkürlich gewählten Zeitraum (typischerweise 2-3 ms) gefolgt. Zeit für ein einziges Leben Messung erforderlich ist typischerweise 0.5-1 s, jedoch können die Messungen so schnell wie 10-20 pro Sekunde erreicht werden. 3,8) Die Ausgabe der Sauerstoff-Elektrode wird verstärkt und in ein anderes A / D Board gerichtet auf dem gleichen PC. Dies ist eine niedrige Frequenz Bord (1 kHz max), die verwendet werden, um die Elektrode Strom bei ausgewählten Zeiträumen Datensatz. Das Programm für die Aufnahme der Elektrode Daten läuft gleichzeitig mit dem phosphorometer Software. 3,9) Sobald die Temperatur der Lösung ist äquilibriert werden sowohl die phosphorometer und die Elektrode Programme gleichzeitig initialisiert führen Messungen alle 10 s. Deren Ausgänge werden synchron in zwei separaten Dateien protokolliert. Danach wird Argon zu der Einlassöffnung auf der Küvette Stopfen verbunden. 3,10) Wie Argon strömt über die Oberfläche des gerührten Lösung, es ersetzt allmählich Sauerstoff. Dies führt zu einer Abnahme der Elektrode Strom und eine Erhöhung der Phosphoreszenz Lebensdauer, die durch die phosphorometer gemessen wird. Normalerweise wird der Sauerstoff verdrängt bilden die Lösung ganz nach ca. 2 h, während welcher Zeit die Daten vollständig automatisch in Dateien protokolliert. 3,11) Nach dem Ende der Titration ausführen, werden die Elektroden-Daten und die Phosphoreszenz Lebzeiten in eine Standard-Analyse-Programm (zB Miocrocal Origin) importiert. Die Elektrode aktuellen hängt linear von der Sauerstoffkonzentration, und für die Elektrode verwendet, ist es praktisch Null auf Null Sauerstoff. Bei Atmosphärendruck ist pO 2 bekannt (etwa 150 mm Hg). So kann die Elektrode direkt an den Sauerstoff Skala umgewandelt werden, und die Handlung der inversen Phosphoreszenz Lebensdauer vs pO 2 konstruiert werden kann. Dieses Grundstück ist mit einer geraden Linie mit der Methode der kleinsten Quadrate, um den Sauerstoff Abschrecken konstant kq wie seine Neigung zu geben ausgestattet. Phosphoreszenz Lebensdauer t0 wird entweder aus dem gleichen Ausrichtung (wie die Umkehrung der Intercept) oder direkt aus der Messung bei Null-Sauerstoff erhalten. 3,12) Falls erforderlich, die Titration wiederholt wird, indem eine Lösung der Sonde in Gegenwart von Albumin - ein Protein, das in das Blutplasma in hohen Konzentrationen - in, um die Bedingungen zu emulieren trafen sich in der realen experimentellen System (Blut eines Tieres in vivo). Die erhalten Stern-Volmer Plots sollten identisch sein, wenn das Dendrimer ist der Schutz der Sonde gut und PEG-Gruppen zu isolieren die Sonde von Kontakten mit Albumin. Andernfalls wird die Sonde und der Proteine ​​im Blut interagieren, und das wird zu einer veränderten Stern-Volmer Plot führen, daß eine Doppeldeutigkeit in Sauerstoff-Messungen. So erhalten Kalibrierkonstanten sind in bildgebenden Experimenten, bei denen der Sauerstoff-Konzentrationen sind a priori unbekannt verwendet.

<ol><li>Vanderkooi, J. M., Maniara, G., Green, T. J., Wilson, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optical+method+for+measurement+of+dioxygen+concentration+based+on+quenching+of+phosphorescence%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">An optical method for measurement of dioxygen concentration based on quenching of phosphorescence.</a> J. Biol. Chem. 262, 5476-5482 (1987).</li>
<li>Rumsey, W. L., Vanderkooi, J. M., Wilson, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+of+phosphorescence%3A+A+novel+method+for+measuring+the+distribution+of+oxygen+in+perfused+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Imaging of phosphorescence: A novel method for measuring the distribution of oxygen in perfused tissue.</a> Science. 241, 1649-1651 (1988).</li>
<li>Lebedev, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+phosphorescent+probes+for+oxygen+Imaging+in+biological+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Acs+Applied+Materials+and+Interfaces%22%5BJournal%5D)">Dendritic phosphorescent probes for oxygen Imaging in biological systems.</a> Acs Applied Materials and Interfaces. 1, 1292-1304 (2009).</li>
<li>Finikova, O. S., Cheprakov, A. V., Beletskaya, I. P., Carroll, P. J., Vinogradov, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+versatile+synthesis+of+substituted+tetrabenzoporphyrins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Organic+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Novel versatile synthesis of substituted tetrabenzoporphyrins.</a> Journal of Organic Chemistry. 69, 522-535 (2004).</li>
<li>Lindsey, J. S., Schreiman, I. C., Hsu, H. C., Kearney, P. C., Marguerettaz, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rothemund+and+Adler-Longo+Reactions+revisited%3A+Synthesis+of+tetraphenylporphyrins+under+equilibrium+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Organic+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Rothemund and Adler-Longo Reactions revisited: Synthesis of tetraphenylporphyrins under equilibrium conditions.</a> Journal of Organic Chemistry. 52, 827-836 (1987).</li>
<li>Lebedev, A. Y., Troxler, T., Vinogradov, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+of+metalloporphyrin-based+dendritic+nanoprobes+for+two-photon+microscopy+of+oxygen%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Porphyrins+and+Phthalocyanines%22%5BJournal%5D)">Design of metalloporphyrin-based dendritic nanoprobes for two-photon microscopy of oxygen.</a> J. Porphyrins and Phthalocyanines. 12, 1261-1269 (2008).</li>
</ol>

<table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"&gt;<tr<td<strong&gt; Abkürzung</strong<strong</strong</td&gt;<td<strong&gt; Vollständiger Name</strong<strong</strong</td&gt;</tr&gt;<tr<td&gt; NMP</td&gt;<td&gt; N-Methylpyrrolidinon</td&gt;</tr&gt;<tr<td&gt; TFA</td&gt;<td&gt; Trifluoressigsäure</td&gt;</tr&gt;<tr<td&gt; DIPEA</td&gt;<td&gt; Diisopropylethylamin</td&gt;</tr&gt;<tr<td&gt; HBTU</td&gt;<td&gt; 2 - (1H-Benzotriazol-1-yl) -1,1,3,3-tetramethyluroniumhexafluorophosphat</td&gt;</tr&gt;<tr<td&gt; DMSO</td&gt;<td&gt; Dimethylsulfoxid</td&gt;</tr&gt;<tr<td&gt; CDMT</td&gt;<td&gt; CDMT = 1-Chlor-3 ,5-dimethoxytriazine</td&gt;</tr&gt;<tr<td&gt; NMM</td&gt;<td&gt; NMM = N-methylmorfoline</td&gt;</tr&gt;</table

synthese und kalibrierung von phosphorescent nanoprobes für oxygen imaging in biological systems

Synthesis and Calibration of Phosphorescent Nanoprobes for Oxygen Imaging in Biological Systems

Sauerstoff-Messung durch Phosphoreszenz Abschrecken [1, 2] besteht aus folgenden Schritten: 1) wird die Sonde in das Medium von Interesse (zB Blut oder interstitielle Flüssigkeit) geliefert, 2) das Objekt wird mit Licht einer geeigneten Wellenlänge beleuchtet, um zu begeistern die Sonde in die Triplett-Zustand, 3) die emittierte Phosphoreszenz gesammelt, und ihr zeitlicher Verlauf wird analysiert, um die Phosphoreszenz Lebensdauer, die in die Sauerstoff-Konzentration (oder Partialdruck pO umgewandelt wird Ertrag<sub&gt; 2</sub&gt;). Die Sonde muss nicht mit der biologischen Umgebung interagiert und in einigen Fällen bis 4 sein) ausgeschieden aus dem Medium auf der Messung der Fertigstellung. Jeder dieser Schritte stellt Anforderungen an das molekulare Design von den phosphoreszierenden Sonden, die die einzige invasive Komponente des Messprotokolls darstellen. Hier beschreiben wir das Design von dendritischen phosphoreszierende Nanosensoren für Sauerstoff-Messungen in biologischen Systemen. Die Sonden bestehen aus Pt oder Pd-Porphyrin-basierte polyarylglycine (AG)-Dendrimere, peripher mit Polyethylenglykol (PEG)-Reste modifiziert. Für eine effektive Zwei-Photonen-Anregung kann Termini der Dendrimere mit Zwei-Photonen-Antenne Chromophore, die die Anregungsenergie einzufangen und leiten es in den Triplett-Kerne der Sonden über intramolekulare FRET (Förster Resonance Energy Transfer) geändert werden. Wir beschreiben die wichtigsten photophysikalischen Eigenschaften der Sonden und präsentieren detaillierte Kalibrierprotokolle.

Wir präsentieren Prinzipien der Sauerstoff-Messungen durch Phosphoreszenz Abschrecken und Überprüfung Gestaltung der Porphyrin-basierte dendritische Nanosensoren für Sauerstoff Bildgebung in biologischen Systemen.

Synthese und Kalibrierung von Phosphorescent Nanoprobes für Oxygen Imaging in Biological Systems

Die Sauerstoffmessung mittels Phosphoreszenzlöschung [1, 2] umfasst die folgenden Schritte: 1) die Sonde wird in das entsprechende Medium eingebracht (z. B. Blut ...

Wir stellen den Aufbau phosphoreszierender Sonden für Sauerstoff auf der Basis von Platin- und Palladium-Porphyrin-DERs vor. Die Sonden bestehen aus metallischen Porphyrinkernen, die Dendrone enthalten, sowie einer peripheren hydrophilen Polyethylenglykolschicht; der Aufbau der Sonden und ihre Kalibrierung werden in dieser Arbeit erläutert. Hallo, mein Name ist Luis Sinks.Ich arbeite hier an der Abteilung für Biochemie und Biophysik der University of Pennsylvania mit Professor Sergei OV zusammen. Ich bin Emmanuel Losis, ebenfalls von der Vina. Ich bin auch von der, und ich bin Sergei. Biologische Sauerstoffmessungen mittels Phosphor und Abklingmessung nutzen exogene Phosphorsonden, die direkt in das Medium der Untersuchung eingeführt werden.Blut- oder Interstitialflüssigkeitssonden sind die einzigen invasiven Bestandteile des Messverfahrens, die besondere Aufmerksamkeit bei ihrer Konstruktion erfordern. Heute stellen wir Ihnen ein Verfahren zur Synthese und Kalibrierung dendritischer phosphoreszierender Nanosonden für die Sauerstoffmessung in biologischen Systemen vor. Mithilfe dieses Verfahrens synthetisieren und charakterisieren wir Sonden für halb- und zweifache Sauerstoffmessungen.Beginnen wir also. Bevor wir mit der Herstellung von Sonden beginnen, erläutern wir zunächst die grundlegende Theorie hinter der Phosphoreszenz von Sonden. Die Phosphoreszenz stammt aus dem langlebigen Triplettzustand.Das Sondenmolekül muss so ausgelegt sein, dass es einen hohen Quantenausbeute des Triplettzustands liefert und Phosphoreszenz anstelle von Fluoreszenz emittiert. Die Anregung der Sonden erfolgt entweder über einen Einphotonenprozess oder im Fall spezieller zweiphotonenverstärkter Sonden über einen Zweiphotonenmechanismus. Die Einphotonenanregung bietet im Allgemeinen eine geringere räumliche Auflösung, erfordert jedoch einfachere Instrumentierung und kann bei Einzelpunkt-Messungen mit LED-basierten faseroptischen Phosphorimetern verwendet werden.Im Triplettzustand kann die Sonde kollisionsartige Begegnungen mit Sauerstoffmolekülen erfahren, die den Triplettzustand deaktivieren können – ein Prozess, der als Löschung bezeichnet wird. Daher wird in Gegenwart von Sauerstoff die Phosphoreszenzlebensdauer verkürzt. Als Folge der Löschung wird die Abhängigkeit der Lebensdauer des Triplettzustands von der Menge an Sauerstoff in der Umgebung durch die Stern-Volmer-Gleichung beschrieben.Bei In-vivo-Experimenten wird die Sonde in das Blut oder die interstitielle Flüssigkeit eines Tieres eingebracht, und die Gewebeoberfläche wird mit Licht einer geeigneten Wellenlänge beleuchtet, um die Sonde in ihren angeregten Triplettzustand zu überführen. Um die phosphoreszente Lebensdauer zu messen, werden die emittierten phosphoreszenten Photonen zeitlich aufgezeichnet. Beispielsweise könnten nach dem Anregungspuls 3.609 Photonen in den ersten fünf Mikrosekunden erfasst werden, 1.421 Photonen in den nächsten fünf Mikrosekunden und so weiter, bis keine Photonen mehr registriert werden.Die Anzahlen in den Intervallen, aufgetragen gegen die Zeit, ergeben den Phosphoreszenzzerfall, der zur Bestimmung der Phosphoreszenzlebensdauer analysiert wird. Bei der Bildgebung wird dieses Verfahren auf jedes Pixel des Bildes angewendet, wodurch Phosphoreszenzlebensdauer-Karten entstehen. Lebensdauermessungen sind unempfindlich gegenüber Heterogenitäten in der Verteilung des Probes im gesamten Objekt, was bei biologischen Proben häufig vorkommt.Jetzt sehen wir uns an, wie man Sonden herstellt. Beginnen Sie die Synthese, indem Sie ein aromatisches Aldehyd zu einer 0,01-molaren Lösung von Tetrahydroisoindol hinzufügen. Rühren Sie das Reaktionsgemisch 10 Minuten lang im Dunkeln bei Raumtemperatur um.Anschließend Borontrifluoriddiethyletherat zugeben und weitere zwei Stunden unter Rühren umsetzen. Danach Dichlorcyanbenzoquinon oder DDQ hinzufügen, wodurch eine Farbänderung von blassrot nach tiefgrün erfolgt, und das Gemisch über Nacht unter kontinuierlichem Rühren stehen lassen. Am nächsten Tag die Lösung waschen und trocknen, anschließend im Vakuum eindampfen.Die Kristallisation des Rückstands ergibt das Zielprodukt als grünes Pulver. Die Ausbeuten liegen typischerweise bei etwa 50 %. Als Nächstes behandeln Sie das freie Porphyrin-Basis mit Palladium(II)-acetat. Überwachen Sie die Umsetzung mittels UV/VIS-Spektroskopie.Die Umsetzung ist abgeschlossen, sobald das Seifenband des Dion im Bereich zwischen 468 und 472 Nanometern verschwunden ist. Das Porphyrin wird durch Säulenchromatographie an Kieselgel isoliert. Zur Herstellung von Palladium-tetra-benzoporphyrin wird das Palladium-tetra-cycloporphyrin oxidiert.Während des Refluxierens wechselt die Farbe von dunkelrot zu tiefgrün; verdampfen Sie das Lösungsmittel, verdünnen Sie den Rückstand mit Dichlormethan, waschen Sie, trocknen Sie und konzentrieren Sie die organische Phase unter Vakuum. Nach der Chromatographie an Kieselgel isolieren Sie Palladium-tetra-benzoporphyrin als blaugrünes Pulver. Danach hydrolysieren Sie die peripheren Estergruppen des Palladium-tetra-benzoporphyrins.Behandeln Sie zunächst den Tetra-Benzoporphyrin-Ester mit Base in Tetrahydrofuran. Setzen Sie dann die Hydrolyse mit wässriger Base fort, fällen Sie den Porphyrin durch Zugabe von Salzsäure aus und trocknen Sie ihn unter Vakuum. Damit ist die Synthese des Porphyrins abgeschlossen.Jetzt sehen wir uns an, wie man Entronen synthetisiert. Bevor die Sonden zusammengesetzt werden, müssen die Entronen, also die Äste des Denmark, vorsynthetisiert werden. Wir verwenden Aero gly, gleiche DERs, die bequem aus kostengünstigen Studienmaterialien mithilfe chromatrographiefreier Methoden hergestellt werden können.Therone mit Aminogruppen an ihren Fokalpunkten werden anschließend an die Caril-Gruppen auf dem Phy gebunden, das wir Ihnen gerade gezeigt haben, wie man es herstellt. Danach werden die Estergruppen am Rand des DME hydrolysiert, ähnlich wie die Carboxylgruppen am Rand des Porphyrins. Ab diesem Punkt können ausgehend von der Porphyrin-DME-Polycarbonsäure entweder ein- oder zweiphotonische Sonden synthetisiert werden, um die zweiphotonischen Sonden herzustellen.Befestigen Sie zunächst divergent einige Zweiphotonen-Antennen-Fragmente an mehreren Carboxylgruppen am Rändern des Dimers. Fahren Sie nun mit der Modifizierung der verbleibenden Carbonsäurereste am Dimer fort. Geben Sie zunächst ein 1,25-faches Überschuss an HBTU zu einer hochkonzentrierten Lösung des Porphyrin-Rimers und rühren Sie das Reaktionsgemisch 10 Minuten bei Raumtemperatur.Fügen Sie nun Diisopropylethylamin und Methoxypolyethylenglykolamin hinzu. Rühren Sie das Reaktionsgemisch zwei Tage bei Raumtemperatur und geben Sie dann Ethylether zu. Trennen Sie das entstehende Präzipitat durch Zentrifugation ab und fällen Sie es mehrmals aus Tetrahydrofuran um, indem Sie Diethylether zugeben.Schließlich wird die Sonde mittels Größenausschlusschromatographie an Polystyrolkügelchen unter Verwendung von Tetraedran als Lösungsmittel gereinigt. Nun betrachten wir die Charakterisierung und Kalibrierung der Sonde. Die Absorptions- und Emissionsspektren der Sonde werden unter Umgebungsbedingungen mit einmolaren Sonde-Lösungen unter Verwendung eines Standard-Spektrophotometers und eines stationären Fluorimeters aufgenommen.Als Nächstes wird zur Erstellung der Stern-Ulmer-Kalibrationskurve, mit deren Hilfe sich die Lebensdauer des Probes mit der Sauerstoffkonzentration verknüpfen lässt, eine Lösung des Probes in ein spezielles zylindrisches Vete gegeben. Das Vete befindet sich in einer temperaturgeregelten Kammer, die sich wiederum in einem lichtundurchlässigen Gehäuse mit Anschlüssen für Anregungs- und Emissions-Lichtwellenleiter befindet. Das Vete wird mit einem Stopfen verschlossen, in den eine hochsensible Sauerstoffelektrode vom Clark-Typ eingeführt ist.Der Stopfen verfügt außerdem über zwei Nadeleinstichstellen für Ein- und Auslass von Argon. Stellen Sie die Temperatur auf 36 bis 37 Grad Celsius ein und lassen Sie die Lösung unter Rühren stehen, bis sie das Gleichgewicht erreicht hat. Schließen Sie die Anregungsfaseroptik an die Anregungsöffnung eines digitalen Phosphoperimeters an, der von einem PC gesteuert wird.Die Lichtquelle und der Phos-Perimeter bestehen aus einer Hochleistungs-LED, deren Ausgang über eine 333-Kilohertz-Digital-zu-Analog-Platine gesteuert wird. Die Emissionsfaser ist mit einem weiteren optischen Anschluss des Phos-Perimeters verbunden, der mit einer infrarotempfindlichen Lawinen-Photodiode gekoppelt ist. Das Signal der Diode wird verstärkt und in den AD-Kanal derselben Steuerplatine eingespeist, wodurch eine Synchronisation zwischen Anregungs- und Emissionskanal ermöglicht wird.Die selbstgeschriebene Steuerungssoftware erzeugt Anregungsimpulse beliebiger gewünschter Dauer, gefolgt von der Erfassung des Phosphoreszenzabklingens. Der Ausgang des Sauerstoffelektrodenverstärkers wird verstärkt und auf eine weitere analoge Digitalkarte im selben PC geleitet. Dabei handelt es sich um eine Niederfrequenzkarte mit einer maximalen Frequenz von einem Kilohertz, die dazu dient, den Elektrodenstrom zu ausgewählten Zeitpunkten aufzuzeichnen, typischerweise zehnmal pro Sekunde.Sobald die Lösungstemperatur ausgeglichen ist, werden sowohl der Phos-Perimeter als auch die Elektrodenprogramme gleichzeitig initialisiert. Um Messungen alle 10 Sekunden durchzuführen, werden ihre Ausgabewerte synchron in zwei separate Dateien protokolliert. Anschließend wird Argonne mit dem Einlassanschluss des Vet-Ventils verbunden.Während Argon über die Oberfläche der gerührten Lösung strömt, verdrängt es nach und nach den Sauerstoff. Dies führt zu einer Abnahme des Elektrodenstroms und einer Zunahme der Phosphor-Lebensdauer, die mit dem Phos-Perimeter gemessen wird. Üblicherweise wird Sauerstoff vollständig aus der Lösung verdrängt.Ungefähr zwei Stunden nach Abschluss der Titration werden die Elektrodendaten und die Phosphorlebensdauern in ein Standard-Analyseprogramm importiert, das eine Darstellung der inversen Phosphorlebensdauer gegen den Sauerstoffpartialdruck erstellt. Diese Darstellung wird mittels der Methode der kleinsten Quadrate mit einer Geraden gefittet, wobei die Steigung der Geraden die Sauerstoff-Löschkonstante ergibt. Die phosphoreszierende Lebensdauer wird entweder aus demselben Fit oder direkt aus der Messung bei Sauerstoffkonzentration null erhalten.Die Titration kann unter Verwendung einer Lösung der Sonde in Gegenwart von Albumin wiederholt werden, einem Protein, das im Blutplasma vorkommt, um die in vivo im Blut eines Tieres vorherrschenden Bedingungen nachzuahmen. Die erhaltenen Stern-Volmer-Diagramme sollten identisch sein, wenn der ER die Sonde schützt. Nun, und die PEG-Gruppen isolieren die Sonde von Kontakt mit Albumin.Der hier vorgeschlagene Ansatz umfasst ausgewählte Schritte zur Synthese von Sauerstoff, anschließend die Behandlung der Proben und deren Kalibrierung. Bei der Kalibrierung ist es wichtig sicherzustellen, dass die Bedingungen denen des betreffenden biologischen Systems so nahe wie möglich kommen.Es ist wichtig sicherzustellen, dass das Sondenmolekül nicht durch Biomoleküle wie Albumin beeinflusst wird. Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihrem Experiment.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

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