Robotik und Dynamic Image Analysis für Studies of Gene Expression in pflanzlichen Geweben

Bei diesem Verfahren wird die Dynamik der Genexpression in Pflanzengeweben mit Hilfe von Robotern über die Zeit abgebildet, zunächst werden Limabohnensamen sterilisiert und zwischen angefeuchteten Papiertüchern in einen Gewebekulturbehälter zur Keimung gelegt. Nach vier Tagen werden die Coans entfernt und mit einem DNA-Konstrukt bombardiert, das einen mit GFP fusionierten Promotor enthält. Coan wird in Petrischalen platziert und auf ein zweidimensionales, speziell entwickeltes Roboter-Bilderfassungssystem montiert. Der Roboter ist so programmiert, dass er 100 Stunden lang stündlich Bilder von jedem Gewebestück aufnimmt.

Die Bilder werden einer Bildanalyse unterzogen, d. h. quantitativen Daten über die Intensität der GFP-Expression im Laufe der Zeit. Hallo, ich bin John Finer, der Direktor des Plant Transformation Laboratory am Department of Horticulture and Crop Science an der Ohio State University. Ich bin Carlos Herandez Garcia, Doktorand im Abschlusslabor an der Ohio State University.

Heute wird Carlos Ihnen das Protokoll vorstellen, das wir für die Analyse der Genexpression und des Pflanzengewebes mit dem grün fluoreszierenden Protein entwickelt haben. Wir verwenden dieses Verfahren, das wir im Labor entwickelt haben, um die Dehnung der OD-Aktivität zu messen. Um dies zu tun, wird unsere erste Krone stromaufwärts des GFP-Gens gebildet, das unsere Reportergene sind.

Ich zeige Ihnen, wie wir die Promotorsteuerung in Lima Ven Cataly einführen und eine App auf unser maßgeschneidertes robotergestütztes Bilderfassungssystem senden. Zum Schluss gehe ich noch auf unser Protokoll für die Bildanalyse ein. Also los geht's: Beginnen Sie mit diesem Verfahren: Oberflächensterilisierte Limabohnensamen mit Standardverfahren.

Legen Sie die sterilisierten Samen in magentafarbene GA-Siebener Behälter zwischen Schichten aus feuchten und Papiertüchern und inkubieren Sie sie vier Tage lang bei 25 Grad Celsius. Hier verwenden wir einen Expressionsvektor mit hoher Kopienzahl, der für Promotor- und Promotorelementanalysen nützlich ist. Dieser Vektor enthält das GFP-Gen, das verwendet wird, um die Funktion des Promotors oder des Promotorelements in transformierten Geweben etwa ein bis zwei Stunden vor dem Beschuss sichtbar zu machen.

Verbrauchsteuer Limabohnen CU Leadin aus den Samenschalen. CU-Leadin, das für den Beschuss geeignet ist, sollte gelb bis hellgrün, flach und frei von Beschädigungen sein, die die weitere Bildanalyse beeinträchtigen könnten. Unmittelbar nach der Exzision wurde 12 cu Leadin in eine Petrischale mit OMS-Kulturmedium gegeben, das MS-Salze B, fünf Vitamine, 3 % Saccharose und 0,2 % Gelrate bei einem pH-Wert von 5,7 enthält. Anschließend fällt das DNA-Konstrukt auf M 10 Wolframpartikel aus und resuspendiert die Partikel zunächst unmittelbar vor der Verwendung in sterilem Wasser auf eine Konzentration von 100 Milligramm pro Milliliter.

Geben Sie dann in ein 0,6-Milliliter-Fuge-Röhrchen 25 Mikroliter Partikel, fünf Mikroliter DNA mit einem Mikrogramm pro Mikroliter, 25 Mikroliter 2,5 molare Calciumchlorid und 10 Mikroliter 100 millimolare Spermien. Inkubieren Sie das DNA-Präparat fünf Minuten lang auf Eis, entfernen Sie dann 50 Mikroliter der Lösung und entsorgen Sie sie auf den Partikeln. Die DNA-beschichteten Partikel, die am Boden des Röhrchens verbleiben, werden durch Vortexen wieder suspendiert.

Und sofort nach dem Vortexen entfernen Sie zwei Mikroliter Eloqua. Wiederholen Sie diesen Vortexing-Schritt. Jedes Mal, wenn ein Eloqua entfernt wird, sollten die beschichteten Partikel auf Eis gehalten und innerhalb von 15 Minuten verwendet werden.

Nachdem die DNA auf die Partikel aufgetragen ist, geben Sie zwei Mikroliter Partikel durch die Oberseite eines Spritzenfilters in der Mitte eines Filtersiebs. Platzieren Sie dann den Spritzenvorsatzfilter in der Filterhalteeinheit in der Partikelzuflusspistole oder der PIG-Kammer. Eine Limabohnen-Co-Blei mit der axialen Seite nach oben auf eine Leitwand legen, die aus einem Sieb besteht, das auf den Boden eines Becherglases geschmolzen ist.

Platzieren Sie die Schallwand, die als Plattform zur Unterstützung des Gewebes während des Beschusses verwendet wird, in der Kammer der Teilchenkanone. Um das Gewebe zu bombardieren, öffnen Sie zuerst das Ventil, das zum Vakuum führt, um die Kammer zu evakuieren. Wenn das Vakuum 760 Millimeter Quecksilbersäule erreicht, aktivieren Sie den Magneten und lassen Sie das Helium frei, um die Partikel anzutreiben.

Der Heliumdruck, der zur Beschleunigung von Teilchen verwendet wird, beträgt 50 bis 60 PSI. Nach dem Teilchenbeschuss das Vakuumleitungsventil schließen und das Vakuum mit dem Auslassventil ablassen. Wenn das Vakuum abgelassen wird, öffnen Sie die Kammertür, um das beschossene Co-Leadin herauszunehmen und das Co-Leadin auf der Dal-Seite zurückzubringen.

Bis zu OMS-Kulturmedium zur Quantifizierung und Erstellung von Expressionsprofilen. Bombardieren Sie mindestens drei Co-Leadin für jedes DNA-Konstrukt. Eine Positivkontrolle, die ein gut untersuchtes Genexpressionsprofil liefert, ist ebenfalls enthalten.

Die Co-Leadin sind nun bereit für die Bildgebung. Schalten Sie die Quecksilberlampe ein und warten Sie 30 Minuten, bis sich die Lampe erwärmt hat. Schalten Sie die Stromquellen für die SPOT R-T-C-C-D-Kamera und die Motorsteuerung ein, die die Bewegung der speziell entwickelten Roboterplattform steuert, die acht Platten fasst.

Stellen Sie das Filterset für die GFP-Detektion ein, indem Sie das GFP-Set mit zwei Filtern auf 480 Nanometer Anregung und 510 Nanometer Emission an einem MZ L Drei-Präpariermikroskop auswählen. Sterilisieren Sie anschließend die verdickten Petrischalendeckel aus Polycarbonat, indem Sie sie mit 70 % Ethanol besprühen. Die speziellen Deckel, die zum Abdecken des Petrischale-Bodens verwendet werden, verhindern Kondensation während der Bildaufnahme.

Platzieren Sie die Platten mit dem beschossenen Cuan auf der Roboterplattform und ziehen Sie die seitliche Stellschraube fest, um sie in Position zu bringen. Öffnen Sie nun die benutzerdefinierte Softwareanwendung, die sowohl die Robotikplattform als auch die Bildaufnahme steuert. Öffnen Sie auch den Software-Weißlicht-Controller-Schalter mit der Software und richten Sie die Plattform in die Ausgangsposition aus.

Dies geschieht vor dem Eingehen von Positionen. Wählen Sie für jedes Coddle Leadin auf der Registerkarte "Motor" die erste Platte aus. Die Plattform positioniert das Zentrum der Petrischale unter dem Objektiv des Mikroskops.

Positionieren Sie mit den Fahrabstandstasten die erste CU LEADIN präzise für die Bildaufnahme. Bewegen Sie den Kuschelblei mit der Live-Modus-Funktion in den entsprechenden Betrachtungsbereich. Für das erste Kuschelblei stellen Sie mit den manuellen Knöpfen am Präpariermikroskop den Fokus ein und stellen die Vergrößerung auf 1,6-fach ein. Nachdem Sie den Interessenbereich festgelegt haben, klicken Sie auf die Schaltfläche Diese Position hinzufügen.

Die Software fügt die Koordinaten dieses Bereichs zu einer Positionsplandatei hinzu und die Plattform kehrt zur Mitte der Plattensatzpositionen für alle verbleibenden Coens auf den Platten zurück. Verwenden Sie die Schaltflächen für den Bewegungsabstand mit den drei manuellen Nivellierschrauben, die sich unter jeder Platte auf der Roboterplattform befinden, um den Fokus für den verbleibenden Coan auf derselben Platte einzustellen. Nachdem alle Koordinaten aller Koordinaten eingegeben wurden, speichern Sie die Koordinaten des Positionsplans.

Geben Sie die Bilderfassungsparameter ein, wie z. B. die Art des Lichts, das für GFP blau ist, und die Belichtungseinstellung, und geben Sie an, wo die Bilder gespeichert werden sollen, wie im beigefügten schriftlichen Protokoll beschrieben. Gehen Sie zur Registerkarte Aufnahmezeitsteuerung und legen Sie das Zeitintervall für die Bildaufnahme und die Gesamtzahl der Zyklen der Bilderfassung fest. Bilder werden in der Regel stündlich für 100 Stunden gesammelt.

Generierung klar definierter Genexpressionsprofile. Starten Sie die Bildaufnahme, indem Sie die Registerkarte "Positionsplan" öffnen und dann auf die Schaltfläche "Zeitplan ausführen" klicken. Isolieren Sie das Bilderfassungssystem am Ende der 100-Stunden-Bildaufnahme von Fremdlicht.

Die hochauflösenden Bilder mit jeweils etwa fünf Megabyte stehen für die Bildanalyse bereit. Verwenden Sie Image Ready, um die 100 sequenziellen Images aus jedem Ordner zusammenzustellen. Importieren Sie alle sequenziellen Bilder als Frames und ändern Sie ihre Größe auf 800 x 600 Pixel, um die Bildverarbeitung zu beschleunigen.

Verwenden Sie als Nächstes Markierungen auf einer neu eingeführten Ebene, die in allen Frames sichtbar ist, und verwenden Sie ausgewählte GFP-Punkte in der Bildreferenz. Richten Sie jedes Bild manuell aus, wenn die Ausrichtung abgeschlossen ist, löschen Sie die als Referenz verwendete Ebene und speichern Sie die Datei als einzelne PSD-Datei. Exportieren Sie außerdem alle Frames als einzelne MOV-Datei mit der höchsten Auflösung.

Die Dateien sind nun bereit, mit der GFP-Quantifizierung zu beginnen. Verwenden Sie Bild J, um die MOV-Datei zu öffnen und einen Bereich von 400 x 300 Pixeln zuzuschneiden. Teilen Sie dann die sequenziellen Bilder mit dem RGB-Teilungswerkzeug für Rot- und Grünkanäle in Rot-, Blau- und Grünkanäle auf.

Subtrahieren Sie die Hintergrundfluoreszenz mit dem subtrahierten gemessenen ROI für jedes Slice-Plugin-Tool. Berechnen Sie den GFP-Ausdruck, indem Sie die Schwellenwerte anpassen und ein Plugin verwenden, das den mittleren Graustufenwert pro Pixel und die Gesamtzahl der GFP-ausgedrückten Pixel misst. Kopieren Sie die Ausgabewerte in Bild J.Fügen Sie abschließend die Ausgabewerte für den grünen und roten Kanal in Microsoft Office ein.

Excel für weitere Datenbearbeitung, um Ihnen eine Vorstellung von den Ergebnissen der Bildausrichtung zu geben. Diese erste Animation zeigt die Ungenauigkeit der Neupositionierung der Roboterplattform während des 100-stündigen Experiments. Die Punktbewegung ist ein Artefakt, das sich aus der Unfähigkeit der Roboterplattform ergibt, nach der manuellen Bildausrichtung zu jedem Zeitpunkt in die exakt gleiche Position zurückzukehren, die GFP-Exprimationszellen können leicht beobachtet werden und die einzigartigen Funktionen dieses Tracking-Systems werden leicht visualisiert.

Da diese Animation die Anmerkung wiederholt, zeigen die GFP-exprimierenden Zellen, die eingekreist sind, die rot eingekreiste Zelle einen sehr schnellen Rückgang der Expression 18 bis 20 Stunden nach dem Bombardement, während die Zelle, die weiß eingekreist ist, einen verzögerten Beginn der GFP-Expression zeigt. Abgesehen von den Animationen ermöglicht dieses Verfahren eine schnelle Quantifizierung der GFP-Expression im Zeitverlauf im Zielgewebe der Limabohnen. Diese repräsentativen Ergebnisse zeigen die vergleichende Quantifizierung der Promotorintensität unter Verwendung des CAMV 35 S-Promotors und vier verschiedener Sojabohnen-Promotoren.

Wir haben Ihnen gerade gezeigt, wie man DNA in das Catalin des Keimens einführt. Die Lima-Venensamen platzieren das Catalin auf dem Roboter, sammeln Bilder für die Bildanalyse und analysieren diese Bilder. Wir verwenden dieses Verfahren routinemäßig in unserem Labor zur Validierung von Promotoren für Klonpflanzen.

Man kann eine große Menge an Daten aus der Einführung verschiedener Pflanzenpromotoren generieren. Dieses Verfahren ist jedoch kompliziert mit vielen Schritten, die schief gehen können, wenn dieses Verfahren durchgeführt wird, ist es wichtig, mit frischem Leinenbohnensaatgut zu beginnen oder zumindest hochwertiges Saatgut zu verwenden, das ordnungsgemäß gelagert wurde. Es ist auch wichtig, den Bombard-Cut-Deckel schnell auf den Roboter zu bekommen und den dicken Deckel des Tiernapfes zu verwenden, um Kondensationsprobleme zu minimieren.

Und zu guter Letzt beachten Sie bitte, dass das GFP, das wir verwenden, eine andere Version namens SGFP ist, vorne Gen HIN Lab an der Harvard University. Dieses GFP ist nicht sehr stabil und eignet sich möglicherweise besser zur Verfolgung schneller Veränderungen der Genexpression. Und das sind wir dafür, dass wir uns zuschauen.

Und viel Glück bei Ihren Experimenten.