Robotik und Dynamic Image Analysis für Studies of Gene Expression in pflanzlichen Geweben

Bei diesem Verfahren werden die Dynamik der Genexpression in Pflanzengeweben über die Zeit mittels Robotik abgebildet. Zunächst werden Limabohnensamen sterilisiert und zwischen angefeuchteten Papiertüchern in einem Gewebekulturbehälter zur Keimung platziert. Nach vier Tagen werden die Keimblätter entfernt und mit einem DNA-Konstrukt, das einen an GFP fusionierten Promotor enthält, beschossen. Die in Petrischalen befindlichen Keimblätter werden auf einem zweidimensionalen, speziell entwickelten robotischen System zur Bildaufnahme montiert. Der Roboter ist so programmiert, dass er stündlich über einen Zeitraum von 100 Stunden Bilder von jedem Gewebestück aufnimmt.

Die Bilder werden einer Bildanalyse unterzogen, die quantitative Daten über die Intensität der GFP-Expression im Zeitverlauf liefert. Hallo, ich bin John Finer, Leiter des Labors für Pflanzentransformation im Fachbereich Gartenbau- und Pflanzenwissenschaften an der Ohio State University. Ich bin Carlos Herandez Garcia, Doktorand im Finer-Labor an der Ohio State University.

Heute wird Carlos Ihnen den von uns entwickelten Protokoll zur Analyse der Genexpression in Pflanzengeweben unter Verwendung des grün fluoreszierenden Proteins vorstellen. Wir verwenden dieses im Labor entwickelte Verfahren zur Messung der OD-Aktivität. Dazu klonieren wir zunächst unseren Promotor upstream des GFP-Gens, welches unser Reportergen ist.

Ich zeige Ihnen, wie wir die Promotorkontrolle in die Lima-Venen-Cataly einführen und eine Anwendung auf unserem maßgeschneiderten robotischen Bildaufnahmesystem starten. Abschließend erläutere ich unseren Protokollablauf zur Bildanalyse. Beginnen wir: Sterilisieren Sie zunächst die Limabohnensamen oberflächlich nach Standardverfahren.

Platzieren Sie die sterilisierten Samen in Magenta-GA7-Behältern zwischen Schichten feuchter Papiertücher und inkubieren Sie sie vier Tage bei 25 Grad Celsius. Hier verwenden wir einen Expressionsvektor mit hoher Kopienzahl, der für Promotor- und Promotorelementanalysen geeignet ist. Dieser Vektor enthält das GFP-Gen, das verwendet wird, um die Funktion von Promotoren oder Promotorelementen in transformierten Geweben etwa ein bis zwei Stunden vor der Beschuss-Transformation sichtbar zu machen.

Entfernen Sie die CU-Leadin von Limabohnen aus den Samenschalen. Die für die Beschussung geeignete CU-Leadin sollte gelb bis hellgrün, flach und frei von jeglichen Schäden sein, die eine anschließende Bildanalyse beeinträchtigen könnten. Unmittelbar nach der Entnahme werden 12 CU-Leadin in eine Petrischale mit OMS-Kulturmedium, das MS-Salze, B5-Vitamine, 3 % Saccharose und 0,2 % Gelrite bei pH 5,7 enthält, gegeben. Danach präzipitieren Sie das DNA-Konstrukt auf M-10-Wolframpartikel. Richten Sie die Partikel kurz vor der Anwendung in sterilem Wasser auf eine Konzentration von 100 Milligramm pro Milliliter ein.

Dann in einem 0,6-Milliliter-Fugegefäß 25 Mikroliter Partikel, 5 Mikroliter DNA bei 1 Mikrogramm pro Mikroliter, 25 Mikroliter 2,5-molarer Calciumchloridlösung und 10 Mikroliter 100-millimolarer Sperminlösung hinzufügen. Die DNA-Präparation fünf Minuten auf Eis inkubieren, dann 50 Mikroliter der über den Partikeln stehenden Lösung entfernen und verwerfen. Die am Boden des Gefäßes verbliebenen, mit DNA beschichteten Partikel durch Vortexen resuspendieren.

Unmittelbar nach dem Wirbeln entnehmen Sie zwei Mikroliter Eloqua. Wiederholen Sie diesen Wirbelvorgang. Jedes Mal, wenn Eloqua entnommen wird, sollten die beschichteten Partikel auf Eis gehalten und innerhalb von 15 Minuten verwendet werden.

Nun, da die DNA auf die Partikel aufgebracht ist, geben Sie zwei Mikroliter der Partikellösung durch die Oberseite eines Spritzfilters in der Mitte eines Filtersiebs. Danach setzen Sie den Spritzfilter in die Filterhalteeinheit innerhalb der Partikeleinsprühkammer, auch PIG-Kammer genannt. Stellen Sie eine Limabohne mit der Keimwurzel axial nach oben auf ein Baffle, das aus einem am Boden eines Bechers angebrachten Sieb besteht.

Platzieren Sie die Leitschaufel, die als Plattform zur Unterstützung der Gewebe während der Bestrahlung in der Partikelkanonenkammer dient. Um das Gewebe zu bestrahlen, öffnen Sie zunächst das Ventil zur Evakuierung der Kammer. Wenn das Vakuum 760 Millimeter Quecksilber erreicht hat, aktivieren Sie das Magnetventil und geben Sie das Helium frei, um die Teilchen voranzutreiben.

Der zum Beschleunigen der Teilchen verwendete Heliumdruck beträgt 50 bis 60 PSI. Nach der Teilchenbestrahlung schließen Sie das Vakuumventil und lassen Sie das Vakuum über das Entlüftungsventil ab. Sobald das Vakuum abgelassen ist, öffnen Sie die Kammertür, um die bestrahlte Co-Lead-In abzuholen, und bringen Sie die Co-Lead-In wieder auf die Dal-Seite zurück.

Bis zur OMS-Kulturmedium für die Quantifizierung und Expressionsprofilierung. Bombardieren Sie mindestens drei co-leitende Proben für jeden DNA-Konstrukt. Ein positiver Kontrollversuch, der ein gut untersuchtes Genexpressionsprofil liefert, wird ebenfalls einbezogen.

Die Proben sind nun bereit für die Bildaufnahme. Schalten Sie die Quecksilberlampe ein und warten Sie 30 Minuten, bis die Lampe auf Betriebstemperatur ist. Schalten Sie die Stromquellen für die SPOT R-T-C-C-D-Kamera und den Motorregler ein, der die Bewegung der speziell konstruierten Robotikplattform steuert, auf der acht Platten befestigt sind.

Stellen Sie den Filter für die GFP-Detektion ein, indem Sie am MZ L drei Stereomikroskop den GFP-Zwei-Filter mit 480 Nanometer Anregung und 510 Nanometer Emission auswählen. Anschließend desinfizieren Sie die verdickten Polycarbonat-Petri-Schalen-Deckel durch Besprühen mit 70 % Ethanol. Die speziellen Deckel, die verwendet werden, um die Petri-Schalen-Böden abzudecken, verhindern Kondensation während der Bildaufnahme.

Platzieren Sie die Platten mit den beschossenen Cuan auf der Robotikplattform und ziehen Sie die seitliche Feststellschraube an, um sie zu fixieren. Öffnen Sie nun die benutzerdefinierte Softwareanwendung, die sowohl die Robotikplattform als auch die Bildaufnahme steuert. Öffnen Sie außerdem mithilfe der Software den Weißlicht-Controller-Schalter und drehen Sie die Plattform in die Ausgangsposition.

Dies erfolgt vor dem Eingeben der Positionen. Wählen Sie für jedes Coddle-Leadin in der Motor-Registerkarte die erste Platte aus. Die Plattform positioniert das Zentrum der Petrischale unter dem Objektiv des Mikroskops.

Positionieren Sie mithilfe der Bewegungstasten für die Distanz genau das erste CU LEADIN zur Bildaufnahme. Nutzen Sie die Live-Modus-Funktion, um das Cuddle Leaden in den geeigneten Sichtbereich zu bewegen. Für das erste Cuddle Leaden stellen Sie mithilfe der manuellen Knöpfe am Stereomikroskop den Fokus ein und stellen die Vergrößerung auf 1,6× ein. Sobald der interessierende Bereich festgelegt ist, klicken Sie auf die Schaltfläche „Diese Position hinzufügen“.

Die Software fügt die Koordinaten dieses Bereichs einer Positionsserien-Datei hinzu, und die Plattform kehrt zur Zentrumsposition der Platte zurück, um alle verbleibenden Coens auf den Platten zu bearbeiten. Verwenden Sie mithilfe der Bewegungstasten die drei manuellen Nivellierschrauben unter jeder Platte auf der Robotikplattform, um den Fokus für die verbleibenden Coens derselben Platte einzustellen. Nachdem alle Koordinaten aller Coens eingegeben wurden, speichern Sie die Positionsserien-Koordinaten.

Geben Sie die Parameter für die Bildaufnahme an, wie beispielsweise die Art des Lichts, das für GFP blau ist, sowie die Belichtungseinstellung, und legen Sie fest, wo die Bilder gespeichert werden sollen, wie in der begleitenden schriftlichen Anleitung beschrieben. Wechseln Sie zum Reiter „Zeitsteuerung der Aufnahme“ und stellen Sie das Zeitintervall für die Bildaufnahme sowie die Gesamtanzahl der Aufnahmeyklen ein. Üblicherweise werden alle Stunde Bilder über einen Zeitraum von 100 Stunden aufgenommen.

Erzeugung gut definierter Genexpressionsprofile. Beginnen Sie die Bildaufnahme, indem Sie den Registerkarten „Positionsschema“ öffnen und dann auf die Schaltfläche „Schema ausführen“ klicken. Isolieren Sie das Bildaufnahmesystem am Ende der 100-stündigen Bildaufnahme von störendem Licht.

Die hochauflösenden Bilder mit jeweils etwa fünf Megabyte sind bereit für die Bildanalyse. Verwenden Sie Image Ready, um die 100 sequenziellen Bilder aus jedem Ordner zusammenzufügen. Importieren Sie alle sequenziellen Bilder als Einzelbilder und skalieren Sie sie auf 800 mal 600 Pixel, um die Bildverarbeitung zu beschleunigen.

Verwenden Sie anschließend Markierungen auf einer neu hinzugefügten Ebene, die in allen Bildern sichtbar ist, und nutzen Sie ausgewählte GFP-Punkte im Bild als Referenz. Richten Sie jedes Bild manuell aus. Sobald die Ausrichtung abgeschlossen ist, löschen Sie die Referenzebene und speichern Sie die Datei als einzelne PSD-Datei. Exportieren Sie außerdem alle Bilder als einzelne MOV-Datei mit der höchsten Auflösung.

Die Dateien sind nun bereit, um die GFP-Quantifizierung zu starten. Öffnen Sie die MOV-Datei mit ImageJ und beschneiden Sie einen Bereich von 400 mal 300 Pixeln. Anschließend trennen Sie die sequenziellen Bilder mithilfe des RGB-Split-Tools in die roten, blauen und grünen Kanäle für die roten und grünen Kanäle.

Subtrahieren Sie die Hintergrundfluoreszenz mithilfe des Plugin-Tools „Subtrahiere gemessene ROI“ für jeden Schnitt. Berechnen Sie die GFP-Expression, indem Sie die Schwellenwerte anpassen und ein Plugin verwenden, das den mittleren Grauwert pro Pixel sowie die Gesamtanzahl der GFP-exprimierenden Pixel misst. Kopieren Sie die Ausgabewerte in ImageJ. Fügen Sie die Ausgabewerte für die grünen und roten Kanäle abschließend in Microsoft Office ein.

Excel zur weiteren Datenmanipulation, um Ihnen einen Eindruck von den Ergebnissen der Bildregistrierung zu vermitteln. Diese erste Animation zeigt die Ungenauigkeit der Neupositionierung der Robotikplattform während des 100-Stunden-Experiments. Die Bewegung der Flecken ist ein Artefakt, das durch die Unfähigkeit der Robotikplattform verursacht wird, nach jeder manuellen Bildregistrierung exakt zur selben Position zurückzukehren. Die Zellen mit GFP-Expression können leicht beobachtet werden, und die einzigartigen Merkmale dieses Verfolgungssystems sind deutlich sichtbar.

Wenn Sie die sich wiederholende Animation betrachten, beachten Sie die umkreisten Zellen mit GFP-Expression: Die in Rot umkreiste Zelle zeigt einen sehr schnellen Abfall der Expression zwischen 18 und 20 Stunden nach der Beschussung, während die in Weiß umkreiste Zelle einen verzögerten Beginn der GFP-Expression aufweist. Abgesehen von den Animationen ermöglicht dieses Verfahren eine schnelle quantitativen Erfassung der GFP-Expression über die Zeit in dem Zielgewebe der Buschbohne. Diese repräsentativen Ergebnisse zeigen die vergleichende Quantifizierung der Promotoraktivität unter Verwendung des CAMV 35S-Promotors und vier verschiedener Sojapromotoren.

Wir haben Ihnen gerade gezeigt, wie man DNA in das Katalin von keimenden Samen einführt. Die Samen mit Lima-Venen werden auf dem Roboter platziert, Bilder für die Bildanalyse aufgenommen und diese Bilder analysiert. Wir verwenden dieses Verfahren routinemäßig in unserem Labor zur Validierung von Pflanzen-Promotoren in Klonen.

Man kann eine große Menge an Daten durch die Einführung verschiedener pflanzlicher Promotoren erzeugen. Dieses Verfahren ist jedoch kompliziert und umfasst viele Schritte, die fehlschlagen können. Es ist wichtig, mit frischen Bohnensamen zu beginnen oder zumindest hochwertige Samen zu verwenden, die ordnungsgemäß gelagert wurden. Ebenso wichtig ist es, den Bombardierungsdeckel schnell zu präparieren und am Roboter einzurichten sowie den dicken Petrischalen-Deckel zu verwenden, um Kondensationsprobleme zu minimieren.

Und schließlich beachten Sie bitte, dass das GFP, das wir verwenden, eine andere Version namens SGFP ist, von Gen HIN Lab an der Harvard University. Dieses GFP ist nicht sehr stabil und eignet sich möglicherweise besser zur Verfolgung schneller Veränderungen in der Genexpression. Und das war’s von uns für heute.

Viel Erfolg bei Ihren Experimenten.