Umfassende Analyse der Zusammensetzung von pflanzlichen Zellwänden (Lignozellulose) Teil I: Lignin

Die Bestimmung des Ligningehalts und der Zusammensetzung der pflanzlichen Zellwände beginnt mit getrocknetem Pflanzenmaterial, das verschiedenen Extraktionen unterzogen wird. Das resultierende Material besteht nur aus Zellwänden und wird dann aufgespalten, um den Ligningehalt zu bestimmen. Das Wandmaterial wird einer Hydrolyse durch Acetylbromid unterzogen und die löslichen Mono als werden mittels UV-Spektrometrie zur Bestimmung der Ligninzusammensetzung quantifiziert.

Das Wandmaterial wird durch Zytolyse hydrolysiert. Die löslichen Ligninkomponenten werden dann von ihren flüchtigen Trimethylsalzderivaten abgeleitet, die mittels Gaschromatographie in Verbindung mit Massenspektrometrie getrennt und quantifiziert werden können. Die Bestimmung der Zusammensetzung der Matrixpolysaccharide und des Zellulosegehalts wird in einem weiteren Video mit dem Titel "Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls, part Two Carbohydrates" demonstriert.

Hallo, ich bin Marcus Pauley, Leiter der Wall Analytical Facility am Great Lakes Bioenergy Research Center hier an der Michigan State University. Ich bin Cliff Foster, Manager der analytischen Zellwandeinrichtung. Wir zeigen Ihnen, wie Sie den Gehalt und die Zusammensetzung von pflanzlichen Biomasseproben bestimmen können.

Pflanzen wandeln die Lichtenergie der Sonne in chemische Energie wie Biomasse um. Pflanzliche Biomasse besteht hauptsächlich aus Zellwänden, einem komplexen Netzwerk aus einer Vielzahl von Polymeren, die alle Pflanzenzellen umhüllen. In dieser Arbeit bestimmen wir die Zusammensetzung von pflanzlichen Zellwandmaterialien, um das Potenzial für die Umwandlung dieses Lignins Cellose X, das eine sehr häufig vorkommende erneuerbare Ressource ist, in Biokraftstoffe zu bewerten.

Heute konzentrieren wir uns auf das Polyphenol Lignin in einem weiteren Video mit dem Titel Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls, part two Kohlenhydrate. Wir konzentrieren uns auf die Polysaccharid-Analyse. Um diesen Vorgang zu starten, geben Sie drei 5,5 Millimeter große Edelstahlkugeln in ein zwei Milliliter Sared-Schraubverschlussröhrchen und etwa 60 bis 70 Milligramm Luft oder gefriergetrocknetes Pflanzenmaterial.

Das Material kann mit Hilfe von eyewall, einem Schleif- und Dosierroboter, zu einem feinen Pulver vermahlen werden. Die Augenwand nimmt das Röhrchen auf und schüttelt es 30 Sekunden lang, wobei das Material durch die Metallkugeln zu einem feinen Pulver gemahlen wird, dann wird das gemahlene, aber kompakte Pflanzenpulver in einem alternativen nicht-robotischen Verfahren mit niedrigem Durchsatz gelöst. Um eine Retro zu erleichtern, wird im zweiten Teil vorgestellt, geben Sie 1,5 M 70%iges wässriges Ethanol gründlich in den Mahlgutwirbel und zentrifugieren Sie bei Raumtemperatur.

Bei dieser Behandlung lösen sich die meisten Proteine und Zellorganellen auf, aspirieren den Überstand und fügen ein Eins-zu-Eins-Volumen hinzu. Chloroform-Methanol-Lösung auf das alkoholunlösliche Pellet gründlich schütteln, um das Pellet erneut zu drehen und zu zentrifugieren. Das Chloroform-Methanol extrahiert nach der Zentrifugation die hydrophoben Verbindungen wie Lipide, aspiriert den Überstand und resuspendiert das Pellet sowie 500 Mikroliter Aceton.

Um die Probe zu trocknen, verdampfen Sie das Lösungsmittel mit einem Luftstrom bei 35 Grad Celsius bis zur Trocknung, die getrockneten Proben können bis zur Weiterverarbeitung bei Raumtemperatur gelagert werden. Um die Entfernung von Stärke aus dem Probenreus einzuleiten, suspendieren Sie das Pellet und 1,5 mil 0,1 molare Natriumacetat pH fünf die Röhrchen und erhitzen Sie sie in einem Heizblock, um die Stärke zu verkleistern. Nachdem Sie die Suspension auf Eis abgekühlt haben, fügen Sie die stärkeabbauende Enzymmischung hinzu, verschließen Sie das Röhrchen und inkubieren Sie die Suspension über Nacht gründlich.

Im 37 Grad Celsius heißen Shaker sorgt ein Rotationsshaker für die richtige Durchmischung. Beenden Sie nach der Inkubation über Nacht den Aufschluss, indem Sie in einem Heizblock 10 Minuten lang bei 100 Grad Celsius erhitzen. Dann zentrifugieren und den Überstand, der eine lösliche Stärke enthält, verwerfen.

Waschen Sie das verbleibende Pellet dreimal mit jeweils 1,5 mil Wasser, indem Sie es wie zuvor gezeigt vortexen, zentrifugieren und dekantieren. Zum Schluss wird das Pellet in 500 Mikrolitern Aceton resuspendiert und das Lösungsmittel mit einem Luftstrom bei 35 Grad Celsius verdampft, bis es trocken ist. Die getrockneten Proben, die isolierte Zellwände oder Beine, keine Zellulose enthalten, sind bereit für die weitere Analyse und können bei Raumtemperatur gelagert werden.

Beginnen Sie mit dem Wiegen von einem bis 1,5 Milligramm vorbereitetem Zellwandmaterial. Das Material kann von Hand oder automatisiert mit der Augenwand gewogen werden, wie im zweiten Teil gezeigt. Spülen Sie die Röhrchenwände mit 250 Mikrolitern Aceton, um das Zellwandmaterial am Boden des Röhrchens zu sammeln, und verdampfen Sie das Aceton sehr vorsichtig unter Luftstrom.

Nachdem das Aceton verdampft ist, fügen Sie vorsichtig 100 Mikroliter frisch hergestelltes Acetylbromid mit 25 Vol.-% in Eisessig entlang der beiden Wände hinzu. Um Spritzer zu verhindern, zerlegt ein feines Bromid das Ligninpolymer in seine acetylierten Monos. Dann den Messkolben verschließen und zwei Stunden lang auf 50 Grad Celsius erhitzen.

Eine weitere Stunde mit vier Texten alle 15 Minuten erhitzen und schließlich auf Eis abkühlen Bei Raumtemperatur nach dem Abkühlen des Kolbens 400 Mikroliter zwei molare Natriumhydroxid und 70 Mikroliter frisch zubereiteten 0,5 molaren Hydroxyllaminhydrochlorid-Vortex, die Messkolben, hinzufügen. Als nächstes wird die Lösung neutralisiert, indem der Messkolben genau bis zur Zwei-Milliliter-Markierung mit einer Eisessigkappe gefüllt und mehrmals invertiert wird, um 200 Mikroliter der Lösung, die die hydrolysierten und solubilisierten Mono-Lals enthält, in eine UV-spezifische 96-Well-Platte zu mischen und die Platte in einem Well-Platten-Reader bei 280 Nanometern abzulesen. Lesen Sie die Platte mindestens dreimal ab und mitteln Sie die Absorption, da Partikel eine leichte Abweichung der Absorptionswerte verursachen können.

Bestimmen Sie den prozentualen Anteil eines feinstofflich löslichen Bromid-löslichen Lignins oder A BSL unter Verwendung des entsprechenden Pflanzenkoeffizienten mit der im schriftlichen Protokoll angegebenen Formel. Lignin ist ein Polyphenolnetzwerk, das hauptsächlich aus drei Untereinheiten besteht, P-Hydroxyphenol, Gua ACell und Frühlingsrolleneinheiten, die die Zusammensetzung von Lignin im Pflanzenmaterial bestimmen. Beginnen Sie damit, etwa zwei Milligramm Zellwandmaterial für die Zytolyse in ein Glasröhrchen mit Schraubverschluss zu überführen.

Machen Sie sich als Nächstes bereit, das 2,5%ige Bortrifluoridethylat und die 10%ige Ethanthiollösung in Dioxan zuzubereiten. Da Dioxan sehr gefährlich ist, nehmen Sie keine Proben oder Geräte aus der Haube. Denken Sie daran, sehr vorsichtig zu arbeiten und einen mit Stickstoffgas gefüllten Ballon zu verwenden, um das verlorene Volumen in der Dioxanflasche durch Stickstoff zu ersetzen.

Bereiten Sie die Lösung vor, indem Sie die folgenden Volumina pro Probe mischen: 175 Mikroliter Dioxan, 20 Mikroliter ETSH, fünf Mikroliter, BF drei. Geben Sie nach dem Mischen 200 Mikroliter der Lösung zu jeder Probe. Spülen Sie den Kopfraum des Fläschchens mit Stickstoffgas und Kappe.

Erhitzen Sie die Proben sofort vier Stunden lang auf 100 Grad Celsius und mischen Sie sie jeweils am Ende der Stunde. Theo ace Lysereaktion auf Eis für fünf Minuten. Fügen Sie dann 150 Mikroliter 0,4 molare Natriumbicarbonat hinzu, um zu neutralisieren und zu wirbeln.

Für die Reinigung der Lignin-Abbauprodukte fügen Sie eine mil Wasser und 0,5 mil Acetat-Wirbel hinzu und lassen Sie die Phasen trennen. Die Ethylacetatschicht befindet sich oben und Wasser unten. Übertragen Sie 150 Mikroliter der oberen Ethel-Acetat-Schicht, die die Ligninkomponenten enthält, in ein zwei mil Röhrchen und stellen Sie sicher, dass kein Wasser übertragen wird.

Nach dem Transfer von der oberen Ethelacetatschicht verdampfen Sie das Lösungsmittel mit einem Konzentrator mit Luft. 200 Mikroliter Aceton hinzufügen und verdampfen. Wiederholen Sie die Behandlung mit Aceton zweimal, um überschüssiges Wasser zu entfernen.

Als nächstes leiten wir die Ligninkomponenten zu ihren flüchtigen Trimethyl-Cy-Lane-Derivaten ab. Geben Sie 500 Mikroliter Ethylacetat, 20 Mikroliter Purin und 100 Mikroliter NO biss trimethylcyl acetamid in jedes Röhrchen. Zwei Stunden lang bei 25 Grad Celsius inkubieren.

Am Ende der zwei Stunden werden 100 Mikroliter der Reaktion in ein GC MS-Fläschchen überführt und 100 Mikroliter Aceton hinzugefügt. Analysieren Sie die Proben mit einem GC, der mit einem Vierfach-Massenspektrometer oder einem Flammenionisationsdetektor ausgestattet ist. Für die Rubrik und Details zum Lauf konsultieren Sie bitte das beigefügte schriftliche Protokoll.

Hier sind einige repräsentative Ergebnisse der Ligninanalyse mit Pappelholz als Pflanzenmaterial. Demnach bestehen 22% des Pappelmaterials aus dem Polyphenol Lignin. Die Zusammensetzung der Ligninkomponenten wurde mittels GCMS analysiert.

Die Peaks werden durch relative Retentionszeiten unter Verwendung des internen Tetra-Coan-Standards oder durch charakteristische Massenspektrumsymbole von 2 99 MZ, 2 69 MZ und 2 39 MZ für die sg- bzw. h-Monomere gekennzeichnet. Die Zusammensetzung der Ligninkomponenten wird quantifiziert, indem die Gesamtpeakfläche auf 100 % gesetzt wird. Die Analyse der Zusammensetzung zeigt, dass diese spezielle Probe hauptsächlich String- oder S-Einheiten enthält. Aber auch Goya-, aol- oder G-Einheiten sind reichlich vorhanden.

Es liegt auf der Hand, dass die Menge und die Zusammensetzung der Monolialeinheiten je nach Pflanzengewebe und Art variieren können. Wir haben Ihnen gerade gezeigt, wie Sie den Ligningehalt und die Zusammensetzung von Pflanzenmaterial für die Analyse von Polysacchariden bestimmen können. Verwandeln Sie sich in Teil zwei.

Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.