Name: Vorbereitung von Drosophila Polytäne Chromosome Kürbisse für Antikörpermarkierung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-02-09T17:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 37 s
Description: Lernen Sie die Squash-Technik zur Präparation von Drosophila Polytänchromosomen für Antikörpermarkierung. Diese Methode ermöglicht die Visualisierung epigenetischer Histonmodifikationen und Chromatinstrukturen.

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Wir danken Frau V. Lephart für die Erhaltung der Bestände zu fliegen Diese Arbeit wurde vom National Institute for Health Grant (GM62916) und der National Science Foundation Grant (MCB0817107) unterstützt.

Das folgende Protokoll für Polyäthylen-Chromosom Squash Vorbereitung ist von dem Verfahren in Johansen et al angepasst. (2009). 1. Kultur des dritten Stadiums Drosophila-Larven Um eine optimale Polytänchromosomen für hochwertige Squash-Präparate zu erhalten, sind nicht überfüllt Kultivierungsbedingungen wesentlichen (dh, statt rund 20 eierlegenden Weibchen fliegt in einem Standard-4 "fliegen Flaschen und wechseln Sie in eine neue Flasche pro Tag). Wählen Sie die dicksten Menschen aus dem ersten Jahrgang des Kletterns dritten Larvenstadium, während sie noch wandern, aber kurz vor der Verpuppung. Wir routinemäßig Kultur bei 21 ° C aber 18 ° C erbringt fetter Chromosomen, die besser geeignet für bestimmte Zwecke, wie zum Beispiel kann, wenn band / Interband Regionen müssen in hoher Auflösung dargestellt werden. 2. Polytäne Squash Materialien <ul><li> Drummond Dissektionszangen (2) </li><li> Petrischalen (60 x 15 mm) </li><li> Frosted Objektträger (Fisher Nr. 12-544-3) (poly-Lysin-beschichtete) </li><li> 22 x 22 mm Nr. 15 Deckgläser (Fisher Nr. 12-520B) (beschichtet mit Sigmacote; Sigma # SL2) </li><li> 22 x 40 mm Nr. 15 Deckgläser (Fisher Nr. 12-530B) </li><li> Kim-Tücher </li><li> Phasenkontrast-Mikroskop mit 20x-Objektiv </li><li> Kleine Dewar (zB Thermoskanne oder Thermosflasche) </li><li> Lange Pinzette </li><li> Rasierklingen </li><li> Coplin Jar </li><li> Gummi-Maid oder Tupperware-Fach (oder äquivalente verschließbaren Fach) </li><li> Parafilm (Schnitt in 22 mm Quadrate) </li><li> 175 g Gewicht </li></ul> 3. Fixative und Lösungen <ol><li> 5X Formaldehyd Lager. Bereiten Sie eine frische Lösung von 0,74 g. Paraformaldehyd in 4,0 ml dH 2 O und mit 28 ul 1N KOH. Warm bis 65 ° C, um die Paraformaldehyd zu lösen und dann auf Eis lagern. </li><li> Fixativ 1. Bereiten Sie eine frische Lösung von 0,5 ml 10X PBS, 50 ul Triton X-100, 3,45 ml dH 2 O und 1,0 ml von einem 5fach-Formaldehyd-Lager. Warm, die Triton X-100 verteilen und innerhalb von 1 Stunde. </li><li> Fixativ 2. Bereiten Sie eine frische Lösung von 1,5 ml dH 2 O, 2,5 ml Eisessig und 1,0 ml von einem 5fach-Formaldehyd-Lager und innerhalb von 1 Stunde. </li><li> Lactoacetic saurer Lösung. Bereiten Sie eine Lösung aus 1 ml Milchsäure, 2 ml dH 2 O und 3 ml Essigsäure. </li></ol> 4. Polytäne Chromosom Squash Zubereitung: <ol><li> Spülen Larven mit Wasser und Transfer zum PBS in einem Gewebe Kulturschale für die Präparation. </li><li> Fassen Sie die Spitze des Mundhaken mit einer Pinzette, halten den Körper zu 2 / 3 des Weges nach unten mit dem anderen Paar, und ziehen auf den Mund Haken, so dass die Speicheldrüsen ausgesetzt sind. Trennen Sie die Speicheldrüsen aus dem Gehirn und Auge-Fühlerglied Discs und sezieren das Fett Körper und alle anderen damit verbundenen Gewebe aus den Drüsen. </li><li> Add 200 Mikroliter Fixativ 1 mit dem ersten und einer zwei gut Depression schieben und 200-300 Mikroliter Fixativ 2 bis gut zwei. Transfer ein Paar Speicheldrüsen zu einer Zeit, zu Fixativ 1 in gut ein und inkubieren für die Menge an Zeit für die Ziel-Epitop erforderlich, in der Regel ca. 1-2 Minuten. (Hinweis: Einige Epitope, wie für die meisten der Histon-Modifikationen, kann 5 Minuten oder länger Fixierung erforderlich ist.) </li><li> Mit einer Pinzette Übertragung der Speicheldrüsen zu Fixativ 2 in gut 2 und inkubieren für zwei Minuten. </li><li> Übertragen Sie die Drüsen auf 10-30 ul Lactoacetic saurer Lösung auf eine saubere Sigmacoted Deckglas. Senken Sie einen Polylysin-beschichteten Objektträger auf das Deckglas und ohne Anwendung vertikaler Druck, nehmen Sie den Deckglas so die Drüsen zwischen dem Schieber und dem Deckglas werden. Sofort erleichtern Zelllyse und chromosomalen Ausbreitung durch vorsichtiges Greifen des Deckglas mit einer Pinzette an einer Kante und sanft bewegt es leicht hin und her und versucht, alle vertikalen Druck auf das Gewebe zu minimieren. Alternativ können Sie den Radiergummi Seite eines Bleistifts oder sogar eine Fingerspitze sanft bewegen das Deckglas hin und her. Beachten Sie, dass jede Verzögerung bei der Bewegung des Deckglas hin und her wahrscheinlich verschwinden Verbreitung der chromosomalen Arme, als sie dazu neigen wird, um sehr viel strenger bei der Belichtung mit der Lactoacetic saure Lösung. Trübung der Lösung ist oft ein guter Indikator für die Zellseparation. Leichtes Antippen des Deckglases schräg (zum vertikalen Druck zu vermeiden) mit dem Radiergummi Seite eines Bleistifts ein paar Mal kann auch helfen, in chromosomale verbreiten. </li><li> Unmittelbar untersuchen das Gewebe unter einem Phasenkontrast-Mikroskop mit einer 20 oder 40X-Objektiv, um festzustellen, ob die Chromosomen gut verteilt sind. </li><li> Wenn der chromosomalen Ausbreitung ausreichend ist, stellen Sie die Folie mit dem Deckglas nach unten auf einen Stapel von sauberen Kim-wischt. Legen Sie einen zweiten auf Kim-Wisch-und platt-Chromosomen, indem Sie Ihren Daumen über dem Deckglas positioniert ist und die Taste fest und vermeiden Sie jede horizontale Bewegung des Deckglases das würde Scherungder Chromosomen. </li><li> Untersuchen Sie die Folie wieder unter dem Mikroskop zu bestimmen, ob das Präparat eignet sich für den vorgesehenen Zweck. Wenn Chromosomen deutlich auf Quetschen verschoben haben, verbrauchen weniger Volumen von Lactoacetic-Lösung in Ihrem anschließenden Vorbereitungen. Wiederholen Sie die Schritte 4,1-4,8, bis eine ausreichende Anzahl von geeigneten Folien erhalten worden sind. Legen Sie 175 g Gewichte auf das Deckglas des Dias. </li><li> Füllen Sie einen kleinen Dewar (zB Thermoskanne) mit flüssigem Stickstoff. Mit einer langen Zange, dip Abgleiten in flüssigem N 2, bis das Kochen aufhört, entfernen Sie schieben und sofort nutzen Rande einer sauberen Rasierklinge an einer Ecke zu drehen, das Deckglas. Ist der Verschluss sofort verwendet werden soll, in einem Coplin Glas mit PBS bei 4 ° C. Ansonsten sammeln die Folie in eine Coplin-Gefäß mit 95% igem Ethanol gefüllt. Untersuchen Sie das Deckglas, sobald der Frost weg, um zu bestätigen, dass das Gewebe um die Folie aufgeklebt und nicht mit dem Deckglas bleiben sublimiert. Wiederholen Sie mit dem Rest der Folien bis alle Objektträger entweder in PBS (für den Einsatz innerhalb von wenigen Stunden) oder Ethanol (für längere Lagerung) gespeichert werden. </li></ol> Repräsentative Ergebnisse Der erste wichtige Schritt für den Erhalt von qualitativ hochwertigen polytänen Squash Vorbereitung ist, um Fett Larven mit großen Speicheldrüse Kerne wachsen. Die zweite ist eine gute Technik mit der Verbreitung Verfahren, das etwas Übung können. Ein Tipp für bessere Verbreitung Erfolges ist, den minimalen Volumen von lactoacetic saurer Lösung während der Quetschung Schritt zu finden. Dies fördert ausreichender Spreizung der Chromosomen, ohne dass übermäßige Streaming Kräfte, die Chromosom Arme reinigen können weg. Es ist auch erwähnenswert, dass jede Verzögerung bei der Bewegung des Deckglas hin und her verringert die Verbreitung der chromosomalen Arme, als sie eine höhere Steifigkeit werden, wenn die Lactoacetic saurer Lösung ausgesetzt. Wenn alles gut geht, sollte es zahlreiche gut verteilt Polytänchromosomen werden. Abbildung 1 zeigt ein Beispiel für eine solche Vorbereitung, Doppelzimmer mit einem Marker für Interband Regionen in grün und mit einem Farbstoff markiert, die Flecken der gebänderten Regionen in blau. Wenn nicht genügend verbreitet ist erhalten, werden die Chromosomen wie kleine Kugeln, wie in Abbildung 2 dargestellt aussehen. Auf der anderen Seite, wenn zu viel verbreitet aufgetreten ist, wird die chomosomes zu dünn und verlängert oder in einigen Fällen in kleine Stücke zersplittert wie in Abbildung 3 dargestellt. <img src="/files/ftp_upload/1748/1748fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Polytäne Squash Vorbereitung Doppelzimmer mit Antikörpern gegen die JIL-1 Histon H3S10-Kinase (in rot) und Hoechst (blau) markiert. <img src="/files/ftp_upload/1748/1748fig2.jpg" alt="Abbildung 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. Polytäne Squash mit unzureichender Verbreitung. <img src="/files/ftp_upload/1748/1748fig3.jpg" alt="Abbildung 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 3"> Abbildung 3. Polytäne Squash mit zu viel verbreitet.

<ol><li>Cai, W., Bao, X., Deng, H., Jin, Y., Girton, J., Johansen, J., Johansen, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+polymerase+II-mediated+transcription+at+active+loci+does+not+require+histone+H3S10+phosphorylation+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">RNA polymerase II-mediated transcription at active loci does not require histone H3S10 phosphorylation in Drosophila.</a> Development. 135, 2917-2925 (2008).</li>
<li>DiMario, P., Rosby, R., Cui, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+visualization+of+GFP-fusion+proteins+on+polytene+chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Dros.+Inf.+Serv%22%5BJournal%5D)">Direct visualization of GFP-fusion proteins on polytene chromosomes.</a> Dros. Inf. Serv. 89, 115-118 (2006).</li>
<li>Johansen, K. M., Cai, W., Deng, H., Bao, X., Zhang, W., Girton, J., Johansen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+studying+transcription+and+epigenetic+chromatin+modification+in+Drosophila+polytene+chromosome+squash+preparations+using+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Methods for studying transcription and epigenetic chromatin modification in Drosophila polytene chromosome squash preparations using antibodies.</a> Methods. 48, 387-397 (2009).</li>
</ol>

Die Aufnahme von Essig-und Milchsäure in konventionellen Squash Fixierung Protokolle erleichtert sowohl Interband Auflösung und chromosomalen Arm ausbreitet, aber leider auch einige Epitope nicht überleben diese Behandlung. Ein Beispiel für solch ein Epitop ist H3S10ph (Cai et al., 2008). Da Säurebehandlung hat auch den Nachteil, dass sie die Eigenfluoreszenz von GFP-markierten Proteine, DiMario et al stillt. (2006) kürzlich eine Formaldehyd-based &quot;säurefrei Squash-Technik&quot;, die für die direk...

vorbereitung von drosophila polytäne chromosome kürbisse für antikörpermarkierung

Preparation of Drosophila Polytene Chromosome Squashes for Antibody Labeling

Drosophila ist seit langem ein beliebtes Modellsystem für die Erforschung der Beziehung zwischen Chromatinstruktur und Genregulation durch die zytologische Vorteile durch die riesigen Speicheldrüse Polytänchromosomen des dritten Larvenstadium zur Verfügung gestellt worden. In diesem Gewebe die Chromosomen durchlaufen viele Runden der Replikation in Abwesenheit der Zellteilung, die zu etwa 1000 Exemplaren. Die DNA ausgerichtet bleibt nach jedem replikativen Zyklus resultierende stark vergrößert Chromosomen, die eine einzigartige Gelegenheit, Chromatin Morphologie mit der Lokalisierung von spezifischen Proteinen korreliert sind. Folglich hat es ein hohes Maß an Interesse an der Festlegung der epigenetischen Modifikationen derzeit an verschiedenen Genen und in den verschiedenen Phasen der Transkription Prozess. Ein wichtiges Instrument für solche Untersuchungen ist die Kennzeichnung von Polytänchromosomen mit Antikörpern gegen das Enzym, Transkriptionsfaktor, oder Histon-Modifikation von Interesse. Dieses Video-Protokoll zeigt die Squash-Technik in der Johansen Labor verwendet werden, um Drosophila Polytänchromosomen für Antikörpermarkierung vorzubereiten.

Dieses Video-Protokoll zeigt die Squash-Technik in der Johansen-Labor dient zur Vorbereitung<em&gt; Drosophila</em&gt; Polytänchromosomen für Antikörpermarkierung.

Vorbereitung von Drosophila Polytäne Chromosome Kürbisse für Antikörpermarkierung

Drosophila ist aufgrund der zytologischen ... seit langem ein bevorzugtes Modellsystem zur Untersuchung der Beziehung zwischen Chromatinstruktur und Genregulation.

Dieses Verfahren beginnt mit der Kultivierung von fett wandernden Drosophila-Larven dritter Instar in einer Fliegenflasche. Mit Hilfe von zwei Pinzettenpaaren werden die Speicheldrüsen von den Larven disseziert. Anschließend werden die Speicheldrüsen in zwei verschiedenen Fixierungslösungen auf einer Zweikammer-Objektträgermulde erfolgreich fixiert.Schließlich werden die Drüsen in einer lakto-azetischen Säurelösung zwischen einer Deckglas und einer Objektträgerplatte plattiert. Hallo, ich bin Dr. Kristen Johansen vom Fachbereich Biochemie, Biophysik und molekularer Biologie an der Iowa State University. Hallo, ich bin wissenschaftliche Hilfskraft und Doktorandin im Labor von Johansen.Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Herstellung von Drosophila-Polytenchromosomen-Präparaten, die für die Antikörperfärbung geeignet sind. In unserem Labor verwenden wir dieses Verfahren, um epigenetische Histonmodifikationen und deren Beziehung zur Chromatinstruktur und Genexpression zu untersuchen. Beginnen wir also.Um optimale Polytänchromosomen für hochwertige Präparationen im Ausdruck zu erhalten, sind ungehinderte Kultivierungsbedingungen unerlässlich. Stellen Sie etwa 20 eilegende weibliche Fliegen in eine standardmäßige vier Zoll große Flasche und wechseln Sie täglich in eine neue Flasche. Eine Kultivierung bei 21 Grad Celsius ist für die meisten Zwecke geeignet, aber die Inkubation bei 18 Grad Celsius ergibt dickere Chromosomen, die für bestimmte Experimente besser geeignet sein können, beispielsweise wenn verbannte Interbandregionen mit hoher Auflösung sichtbar gemacht werden müssen.Wählen Sie die dicksten Individuen aus der ersten Ernte von kriechenden Drittinstar-Larven aus. Während sie sich noch fortbewegen, aber kurz vor der Verpuppung, sind die Larven leicht an der Flaschenwand oberhalb des Nährbodens sichtbar. Platzieren Sie die Larven mit einer Pinzette auf einer Zellkulturschale.Spülen Sie für jede Quetschung zwei bis drei Larven gemeinsam mit Wasser ab, bevor Sie sie in eine saubere Schale mit PBS zur Dissektion überführen. Die Larven sollten mit PBS bedeckt sein, doch die Dauer ist nicht entscheidend. Da die Larven unter diesen Bedingungen mehrere Stunden überleben können, stellen Sie die Schale mit den Larven in PBS auf den Objektträger eines Stereomikroskops, zusammen mit einem Paar Pinzetten.Greifen Sie die Spitze der Mundhaken, während Sie den Körper halten. Zwei Drittel weiter unten mit einem zweiten Paar, ziehen Sie mit der Pinzette an den Mundhaken, um die Speicheldrüsen freizulegen. Lösen Sie die Speicheldrüsen vom Gehirn, von den Augen und tenalen Scheiben und dissezieren Sie den Fettkörper sowie alle anderen assoziierten Gewebe ab.Fügen Sie 200 Mikroliter Fixiermittel eins in die erste Vertiefung einer Zweier-Vertiefungsobjektträger hinzu und 200 bis 300 Mikroliter Fixiermittel zwei in Vertiefung zwei. Überführen Sie jeweils ein Paar Speicheldrüsen mit einer Pinzette in Fixiermittel eins in Vertiefung eins und inkubieren Sie für die für das Ziel-Epitop erforderliche Zeit, üblicherweise etwa eine bis zwei Minuten.Überführen Sie die Speicheldrüsen zur Fixierung in zwei, gut zwei, und inkubieren Sie zwei Minuten lang. Überführen Sie die Drüsen mit einer Pinzette auf eine saubere, mit Sigma beschichtete Deckglasunterlage mit 10 bis 30 Mikrolitern frisch zubereiteter Lacto-Essigsäure-Lösung. Senken Sie vorsichtig ein mit Polylysin beschichtetes Objektträgerplättchen auf das Deckglas.Heben Sie die Objektträger vorsichtig an, indem Sie die Adhäsion der Flüssigkeit zum Glas nutzen, um die Deckglasabdeckung aufzuheben, ohne vertikalen Druck auszuüben. Um die Chromosomen sofort zu verteilen, greifen Sie vorsichtig mit einer Pinzette an den Rand des Deckglases und bewegen es leicht hin und her. Wiederum ist es wichtig, den vertikalen Druck auf das Gewebe zu minimieren, da das Vorsichtiges Hin-und-her-Bewegen des Deckglases entscheidend dafür ist, die einzelnen Zellen der Speicheldrüse ausreichend zu trennen.Ein sanftes Antippen der Deckglasabdeckung schräg mit der Radiergummiseite eines Bleistifts kann ebenfalls helfen, die Zellverteilung zu verbessern. Eine trübe Lösung ist oft ein guter Hinweis auf eine erfolgreiche Zelltrennung. Untersuchen Sie das Gewebe unverzüglich unter einem Phasenkontrastmikroskop, um sicherzustellen, dass die Chromosomen gut ausgebreitet sind, was durch deutlich getrennte und gestreckte Chromosomenarme angezeigt wird. Falls die Chromosomen beim ersten Mal nicht gut ausgebreitet erscheinen,Es ist möglich, das vorsichtige Antippen des Deckgläschens so lange zu wiederholen, bis eine ausreichende Ausbreitung erreicht ist. Legen Sie den Objektträger mit der Deckglasseite nach unten auf einen Stapel sauberer Kim-Tücher. Legen Sie ein sauberes Tuch auf die Präparation. Decken Sie die Position des Deckgläschens mit dem Daumen ab und drücken Sie fest senkrecht nach unten. Vermeiden Sie horizontale Bewegungen, da diese die Chromosomen abscheren könnten. Überprüfen Sie den Objektträger erneut unter dem Mikroskop, um die Eignung für das vorliegende Experiment zu bestimmen.Wiederholen Sie die Dissektion und die Chromosomenpräparation, um eine ausreichende Anzahl von Objektträgern zu erhalten. Legen Sie mit einer langen Pinzette ein 175-Gramm-Gewicht auf die Deckgläser der Objektträger. Tauchen Sie einen vorbereiteten Objektträger in eine kleine Schale flüssigen Stickstoffs und halten Sie ihn dort, bis das Sieden stoppt.Entfernen Sie den Objektträger und verwenden Sie sofort die Kante einer sauberen Rasierklinge unter der Ecke der Deckglasabdeckung, um diese abzuheben. Sammeln Sie den Objektträger in einem Coplan-Gefäß, das mit kaltem PBS gefüllt ist, für die sofortige Verwendung oder mit 95 % Ethanol für eine längere Lagerung. Sobald der Frost sublimiert ist, untersuchen Sie das Deckglas, um sicherzustellen, dass das Gewebe am Objektträger verblieben ist.Der erste entscheidende Schritt für eine hochwertige INE-Präparation durch Quetschpräparation besteht darin, fette Larven mit großen Speicheldrüsenkernen heranzuziehen. Der zweite Schritt ist eine gute Technik beim Ausbreitungsverfahren, die etwas Übung erfordern kann. Ein Tipp zur Verbesserung des Ausbreitungserfolgs ist es, das minimale Volumen an Milchsäure-Essigsäure-Lösung während des Quetschschritts zu finden.Dies fördert eine ausreichende Ausbreitung der Chromosomen, ohne übermäßige Strömungskräfte zu erzeugen, die die Chromosomenarme wegspülen können. Es ist außerdem darauf hinzuweisen, dass jede Verzögerung beim Hin- und Herbewegen des Deckglases die Ausbreitung der Chromosomenarme verringert, da diese sich bei Kontakt mit der lakto-azetischen Säurelösung versteifen. Wenn alles auf jedem Objektträger gut verläuft, sollten zahlreiche gut ausgebreitete Polytänchromosomen vorhanden sein.Hier zeigen wir ein Beispiel einer solchen Präparation, die doppelt gefärbt ist: mit einem Marker für Interband-Bereiche in Rot und mit einem Farbstoff, der die Bandenbereiche in Blau anfärbt. Wenn eine unzureichende Ausbreitung erzielt wird, sehen die Chromosomen wie kleine Kugeln aus, wie hier dargestellt. Umgekehrt, wenn eine zu starke Ausbreitung aufgetreten ist, sind die Chromosomen zu dünn und überdehnt oder in manchen Fällen in kleine Stücke zerfallen, wie hier gezeigt.Wir haben Ihnen soeben gezeigt, wie man Drosophila-Polytenchromosomen-Präparate herstellt. Bei dieser Methode ist es wichtig, mit fetten Läusen zu beginnen. Das war's also.Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.

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Forschung

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Biology

Biologie

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