Ein verbessertes Verfahren zur RNA-Isolierung aus Loblolly Pine ( P. taeda L.) und andere Nadelbaumarten
22. Februar 2010
Viele pflanzliche Gewebe, einschließlich Phloem und Xylem von loblolly Kiefer ( Pinus taeda L.), einen hohen Gehalt an Phenolen und Polysaccharide, die mit RNA Aufreinigung stören. Diese Präsentation beschreibt Techniken für die Ernte im Freiland Gewebe und Isolierung von RNA in ausreichender Qualität für Microarrays und andere genomische Analysen.
Das Folgende wurde von Forschern der University of Georgia und der Warnell School of Forestry and Natural Resources erstellt. Dieses Demonstrationsvideo beschreibt die Gewinnung von Xylem- und Phloemgewebe sowie die anschließende RNA-Isolierung aus Pinus taeda, allgemein bekannt als Loblolly-Kiefer, die die einzige bedeutendste Nadelbaumart für die Forstproduktproduktion in den Vereinigten Staaten darstellt. Nachdem der Baum gefällt wurde – in diesem Fall ein 40 Jahre alter Baum – wird der Hauptstamm in etwa 50 Zentimeter lange Abschnitte zersägt.
Die Planke wird anschließend an mehreren Stellen längs mit der Kettensäge eingeschnitten, um das Entfernen der Rinde zu erleichtern. Mithilfe eines Hammers und eines Holzmeißels wird die Rinde angehoben, bis sie in Abschnitten abgezogen werden kann. Danach wird das darunterliegende Gewebe von Hand entfernt, von der Innenseite der Rindenabschnitte abgeschält und sofort in flüssigen Stickstoff eingetaucht.
Nachdem die Rinde entfernt wurde, kann die dünne Schicht des sekundären Xylems durch Abkratzen der Bolzenoberfläche mit einem einseitigen Rasiermesser gesammelt werden. Das wässrige Xylemgewebe wird sofort in flüssigen Stickstoff gegeben. Bei dieser Ernte sammelten wir außerdem Proben von Reaktionsholz, das üblicherweise als Druck- und Gegentragholz bezeichnet wird, bevor die Äste vom Hauptstamm abgeschnitten wurden.
Die Gliedmaßenorientierung wird zunächst mit Farbspray markiert, um die Bereiche zu bestimmen, die die beiden Gewebetypen enthalten: gegenüberliegendes Holz an der Oberseite des Astes und Druckholz an der Unterseite. Während der Entfernung der Rinde werden die Äste zunächst entlang von Linien, die Druck- und Gegentraumholz begrenzen, mit einer Kettensäge eingeritzt, und die Rinde wird wie bei den Hauptstammabschnitten entfernt, wobei jedoch nur die Rinde im Bereich entfernt wird, der dem Reaktionsholztyp entspricht.
Das geerntete Holz wird jederzeit entfernt. Es ist in der Regel schwieriger, große Rindenstücke von diesen kleineren Ästen zu entfernen. Proben des sekundären Xylems aus Reaktionsholz werden auf dieselbe Weise wie normales sekundäres Xylem gewonnen, indem mit dem Rasiermesser abgeschabt und unmittelbar in flüssigen Stickstoff getaucht wird.
Beachten Sie die rötlich braune Farbe, die charakteristisch für Druckholz ist. Es ist erwähnenswert, dass das Sammeln und Verarbeiten mehrerer Proben von einem großen Baum viele Hände erfordert, wobei jede beteiligte Person eine bestimmte Aufgabe übernimmt, sodass alle Gewebetypen gleichzeitig gesammelt werden, um die RNA-Degradation zu verringern; die gefrorenen Proben und flüssiger Stickstoff werden anschließend in gekennzeichnete Aufbewahrungsbeutel gegeben und zur Beförderung ins Labor auf Trockeneis platziert. Unser erster Schritt besteht darin, das Gewebe mithilfe einer Spezifikationsmodell-68-50-Tiefkühlmühle zu pulverisieren. Im Vergleich zum Mahlen mit einem Mörser und Stößel erhöht dieser Schritt die RNA-Extraktionsausbeute bei holzigen Gewebeproben erheblich, wobei die Proben mit flüssigem Stickstoff kalt gehalten werden.
Das Gewebe wird zunächst von Hand in kleinere Stücke zerlegt und in die Probenkammer gegeben. Die Kammer wird in den Träger eingeschoben und verriegelt, und die Probe wird zwei Minuten lang gemahlen. Das Endprodukt hat die Konsistenz eines groben Pulvers.
Das RNA-Extraktionsprotokoll ist ein zweitägiger Prozess. Am ersten Tag werden 2,5 Gramm gefrorenes Gewebe zu einem RNA-Extraktionspuffer hinzugefügt, der auf 65 Grad Celsius erwärmt wurde. Die Probe wird kräftig geschüttelt, um sie zu mischen, und eine gleiche Menge Chloroform wird zugegeben; anschließend wird die Probe erneut durch vorsichtiges Umstülpen gemischt.
Die Probe wird anschließend fünf Minuten lang auf ein rotierendes Rad gegeben. Danach wird die Probe in Hochgeschwindigkeits-Teflon-Oakridge-Röhrchen überführt und in einem SS-34-Rotor bei 12.000 U/min fünf Minuten lang zentrifugiert. Die obere wässrige Phase wird in ein frisches Röhrchen abgenommen, und eine halbe Volumenmenge Chloroform wird zugegeben.
Die Probe wird eine Minute lang vortexiert und anschließend erneut fünf Minuten lang auf das rotierende Rad gestellt. Nach einer zweiten Zentrifugation wird die wässrige Phase erneut in ein 50-ml-Hochgeschwindigkeits-Polypropylenröhrchen überführt und 20 Minuten bei 10.000 U/min zentrifugiert. Um eventuelle verbleibende Partikel zu entfernen, wird die Probe in ein 50-ml-Falcon-Röhrchen dekantiert und ein Viertelvolumen 10-molare Lithiumchloridlösung zur Probe gegeben.
Die Probe wird durch Schütteln gemischt und über Nacht bei vier Grad Celsius platziert. Am zweiten Tag wird die mit Lithiumchlorid gefällte Probe zunächst bei vier Grad Celsius 30 Minuten lang bei 11.000 U/min zentrifugiert.
Die Überstände werden abgegossen und entsorgt, und die Röhrchen werden für eine Minute auf Chemie-Tücher umgedreht. Um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen, wird das RNA-Pellet, das sichtbar sein sollte, in 800 Mikrolitern heißem SSTE-Puffer resuspendiert, der zuvor auf 65 Grad Celsius vorgewärmt wurde. Achten Sie darauf, mehrmals auf- und abzupipettieren und den gesamten Rand des Pellets zu erfassen, um sicherzustellen, dass alles in Lösung geht.
Überführen Sie danach die resuspendierte RNA in ein RNA-freies Mikrozentrifugenröhrchen mit einem Fassungsvermögen von zwei Millilitern oder mehr. Erhitzen Sie die Probe für ein bis zwei Minuten in einem Wasserbad bei 65 Grad Celsius und wirbeln Sie sie anschließend kräftig, um sicherzustellen, dass die Probe vollständig resuspendiert ist. Dieser Schritt kann bei Bedarf wiederholt werden.
Fügen Sie nun eine gleiche Menge gepuffertes Phenol-Chloroform hinzu. Vortexen Sie die Probe 15 bis 20 Sekunden und zentrifugieren Sie sie drei Minuten bei 14.000 U/min. Die wässrige Phase wird in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen überführt und eine gleiche Menge wird zugegeben.
Die Probe wird vortexiert und mikrofusiert wie bei der vorherigen Extraktion. Für die endgültige organische Extraktionsphase werden Lock-Gel-Röhrchen zunächst zwei Minuten lang bei 11.000 U/min mikrofusiert.
Anschließend wird die RNA-Probe aus der vorherigen Extraktion zum Phasensperre-Gel gegeben, gefolgt von der halben Menge Chloroform, und beides wird vorsichtig durch Pipettieren gemischt. Die Probe wird dann fünf Minuten lang bei 11.000 U/min zentrifugiert, und die wässrige RNA-Probe wird in ein neues RNA-freies Mikrozentrifugenröhrchen von Ambion überführt. Der nächste Schritt ist eine einfache RNA-Fällung durch Zugabe eines zehntel Volumens von drei Molar Natriumacetat pH 4,8 und zweier Volumina von 100 % Ethanol zur Probe.
Die Probe wird vortexiert, kurz für 30 Minuten in einen minus 80 Grad Celsius kalten Gefrierschrank gestellt und anschließend 30 Minuten bei vier Grad Celsius mikrozentrifugiert. Das Überstand wird vorsichtig abgesaugt und der kleine weiße Pellet mit einem Milliliter eiskaltem 70 %igen Ethanol gewaschen, abgesaugt und die Ethanolwäsche nach der endgültigen Absaugung wiederholt. Restliches Ethanol darf durch Offenstehen der Röhrchen auf dem Pult für fünf Minuten verdunsten.
RNA-Pellets werden in 100 Mikroliter DEPC-Wasser resuspendiert und durch Vortexen und Erhitzen auf 65 Grad resuspendiert. Dies kann bei Bedarf wiederholt werden. Die Probenkonzentration wird bestimmt.
Spektrophotometrisch werden die Verhältniszahlen 260/280 und 260/230 berechnet, um das Ausmaß der Protein- und Kohlenhydratkontamination in der Probe abzuschätzen. Mithilfe einer 1 %igen AGAROSE-Gelelektrophorese erfolgt eine qualitative Beurteilung der Probenqualität hinsichtlich genomischer DNA-Kontamination und RNA-Abbau. Die Integrität kritischer Proben wird zusätzlich mit einem Agilent 2100 Bioanalyzer überprüft, um die ribosomalen 28S/18S-Verhältnisse sowie eine RNA-Integritätszahl (RIN) zu bestimmen. Vielen Dank, dass Sie sich unser Video zum Thema Gewebeprobenentnahme und Isolierung von Gesamt-RNA aus Kiefern (LOB lolly pine) angesehen haben.
Folgende Personen sind für die Dreharbeiten und Produktion dieses Schulungsvideos verantwortlich.
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Übersicht
Diese Präsentation behandelt die Gewinnung von Xylem- und Phloemgeweben von Kiefern (Pinus taeda) und die anschließende Isolierung von RNA. Die beschriebenen Methoden zielen darauf ab, die durch hohe Gehalte an Phenolen und Polysacchariden verursachten Schwierigkeiten zu überwinden, die die RNA-Reinigung stören.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Pflanzenbiologie
- RNA-Reinigung
- Genomische Analyse
Hintergrund
- Kiefer ist eine Schlüsselart für Forstprodukte in den USA.
- Ein hoher Gehalt an Phenolen und Polysacchariden erschwert die RNA-Extraktion.
- Für im Freiland gewachsene Gewebe sind spezifische Erntetechniken erforderlich.
- Die RNA-Qualität ist entscheidend für Mikroarrays und genomische Studien.
Zweck der Studie
- Effektive Erntetechniken für Kiefern (Pinus taeda) demonstrieren.
- RNA von ausreichender Qualität für genomische Analysen isolieren.
- Eine praktische Anleitung für Forscher in der Pflanzenbiologie bereitstellen.
Verwendete Methoden
- Abschneiden des Hauptstamms einer 40 Jahre alten Kiefer in Stämme.
- Einkerben der Stämme mit einer Kettensäge, um die Entfernung der Rinde zu erleichtern.
- Heben und Abziehen der Rinde mithilfe eines Hammers und eines Meißels.
- Manuelles Entfernen des Phloemgewebes und Eintauchen in flüssigen Stickstoff.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Isolierung von RNA aus geernteten Geweben.
- Nachweis wirksamer Techniken zur Bewältigung von Reinigungsherausforderungen.
- Bereitstellung einer visuellen Anleitung für Forschende.
- Hervorhebung der Bedeutung der RNA-Qualität für nachgeschaltete Anwendungen.
Schlussfolgerungen
- Die Gewinnungstechniken sind entscheidend, um RNA von hoher Qualität zu erhalten.
- Feldmethoden können an verschiedene Pflanzengewebe angepasst werden.
- Eine effektive RNA-Isolierung ist entscheidend für die genomische Forschung.
Häufig gestellte Fragen
Ausführliche Bedeutung für die Industrie
Die Gewinnung von hochwertiger RNA aus Nadelholzgeweben, wie beispielsweise Kieferngewebe, ist entscheidend, um zuverlässige genomische und transkriptomische Analysen in der pflanzlichen Biotechnologie-Forschung und -Entwicklung zu ermöglichen. Die Überwindung der durch phenolische Substanzen und Polysaccharide verursachten Herausforderungen wirkt sich direkt auf die Vorhersagesicherheit nachgeschalteter molekularer Assays aus und unterstützt eine robuste Zielvalidierung in forstlichen und landwirtschaftlichen Biotechnologie-Pipelines. Dieses verbesserte Protokoll erhöht die Reproduzierbarkeit und Skalierbarkeit von RNA-basierten Entdeckungsworkflows für komplexe Pflanzensysteme.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Ermöglicht eine gründliche Untersuchung der Genexpression in Koniferenarten zur Aufklärung von Signalwegen.
- Unterstützt die funktionelle Validierung von Zielstrukturen, indem RNA mit hoher Integrität für molekularbiologische Analysen bereitgestellt wird.
- Verringert die biologische Mehrdeutigkeit in transkriptomischen Studien von holzigen Geweben.
Screening und Assay-Entwicklung
- Erleichtert die Herstellung validierter RNA-Proben für die Entwicklung von Microarray- und qPCR-Assays.
- Verbessert die Reproduzierbarkeit von Assays, indem störende Einflüsse von Kontaminationen in enzymatischen Reaktionen minimiert werden.
- Ermöglicht eine zuverlässige Untersuchung von Genexpressionsänderungen in verschiedenen Gewebetypen.
Translationale und präklinische Forschung
- Unterstützt die translationale Biomarker-Entdeckung, indem die RNA-Qualität für vergleichende Analysen über Arten hinweg sichergestellt wird.
- Gewährleistet Kontinuität von der Probensammlung im Feld bis zur molekularen Validierung im Labor.
- Reduziert Risiken in präklinischen Studien durch Standardisierung der RNA-Eingangsqualität für nachgeschaltete Anwendungen.
Pipeline- und Workflow-Integration
Dieses Protokoll zur RNA-Isolierung integriert sich an der Schnittstelle zwischen Probensammlung im Feld und der Entwicklung molekularer Assays und verbindet damit die frühe Entdeckung mit nachgeschalteten genomischen Analysen.
- Entdeckungsbiochemie: Ermöglicht die Hypothesenprüfung und Klärung von Signalwegen durch qualitativ hochwertige RNA-Extraktion aus anspruchsvollem Pflanzengewebe.
- Screening: Liefert analysenbereite RNA mit minimierten Kontaminationen für reproduzierbare molekulare Screenings.
- Analytik: Bietet quantitative Metriken zur Beurteilung der RNA-Integrität (z. B. spektrophotometrische Verhältnisse, Bioanalyzer-RIN) zur Qualitätsbewertung von Proben.
- Translationale Forschung: Ermöglicht Biomarker-Studien, die eine konsistente RNA-Qualität über Feld- und Laborumgebungen hinweg erfordern.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Etabliert ein standardisiertes, skalierbares Protokoll, das auf verschiedene Koniferen- und Pflanzenarten übertragbar ist.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit bei Genexpressions- und transkriptomischen Analysen.
- Operativer Wert: Verbessert die Standardisierung, Reproduzierbarkeit und Durchsatzleistung der RNA-Isolierung aus komplexen Geweben.
- Strategischer Wert: Verbessert die Entscheidungsfindung zwischen Fortführung und Abbruch von Versuchen, indem das Risiko eines Assay-Versagens aufgrund schlechter RNA-Qualität verringert wird.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht eine risikoadjustierte Priorisierung molekularer Zielstrukturen und Kandidatengene in biotechnologischen Pflanzenforschungs-Pipelines.
Umsetzungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse bei der Gewinnung von Feldproben und dem Umgang mit phenolreichen Proben.
- Benötigt Zugang zu spezieller Ausrüstung wie Gefriermühlen und Hochgeschwindigkeitszentrifugen.
- Erfordert strikte Standardisierung zwischen den Arbeitsgruppen für die Probenvorbereitung und Qualitätssicherung.
- Anpassbar an verschiedene Koniferen- und Holzpflanzenarten mit gegebenenfalls notwendigen Protokollanpassungen.
- Mögliche Einschränkungen sind der hohe Arbeitsaufwand und die Notwendigkeit einer schnellen Probeneinfrierung, um eine RNA-Degradation zu verhindern.
Biopharma-Häufige Fragen
Chapters in this video
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Title
0:23
Tissue Harvest
0:45
Collection of Phloem
1:07
Collection of Secondary Xylem
1:26
Collection of Reaction Wood: Compression and Opposite Secondary Xylem
2:21
Liquid Nitrogen Storage
3:20
RNA Isolation Day 1
2:46
RNA Isolation: Tissue Preparation
4:41
RNA Isolation Day 2
6:35
RNA Precipitation
7:16
Final Resuspension and Quantification
8:02
Credits
