Name: Die Bestimmung der Reaktivität und Titre von Serum mit einem Hämagglutinations Assay (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-01-29T00:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 59 s
Description: Lernen Sie die Hämagglutination zur Bestimmung von Antikörper-Reaktivität und Titer in Serumproben. Diese serologische Methode ermöglicht Immunologen eine schnelle visuelle Analyse.

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Der Autor bedankt sich bei Frau Lora Matthews für die Durchführung der Technik und Herr Paul Shepherd für Kinematographie danken. Dieses Projekt wurde von der University of South Australia, Laboratoriumsmedizin Programm gefördert.

Vorbereitung von 5x Veronal Buffered Saline (VBS) <ol><li> Zur Vorbereitung der Veronal-gepufferte Kochsalzlösung (VBS), müssen drei separate Lösungen vorbereitet werden. </li><li> Bereiten Sie die Lösung 1 durch Auflösen 21.25gm von NaCl und 0.94gm von Sodium barbiturathaltiges Mittel in 350ml destilliertem Wasser. Die Endkonzentrationen der NaCl und Natrium barbiturathaltiges Mittel sind 1,02 M und 13mm bzw.. </li><li> Bereiten Sie die Lösung 2 durch Lösen 1.44gm von barbiturathaltiges Mittel in 125ml destilliertem Wasser heiß. Die Endkonzentration der barbiturathaltiges Mittel ist 62.5mm. </li><li> Bereiten Lösung 3 durch Auflösen 20.33gm von MgCl 2 und 4.41gm von CaCl 2 in 100 ml destilliertem Wasser. Die Endkonzentration von MgCl 2 und CaCl 2 ist 2,18 m und 440 jeweils. </li><li> Mix-Lösungen 1 und 2 und auf Raumtemperatur abkühlen. </li><li> Sobald die kombinierte Lösung abgekühlt ist, fügen Sie 1,25 ml Lösung 3 und pH-Wert auf 7,3-7,5 mit 1 M HCl. </li><li> Passen Sie das endgültige Volumen auf 500 ml mit destilliertem Wasser auf einem 5-fach Stammlösung. </li><li> So bereiten Sie eine 1x funktionierende Lösung, verdünnte die Aktie im Verhältnis 1:5 mit destilliertem Wasser. </li></ol> Eine Verwässerung des Revercells <ol><li> Vorsichtig resuspendieren Stammlösung Revercells durch Inversion, und entfernen Sie dann 1 ml Zellen und zentrifugieren Sie für 5 min bei 600g bei 4 ° C. </li><li> Nach der Zentrifugation vorsichtig den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in 3 ml 1x Veronal Kochsalzlösung. </li><li> Die Zellen können nun bei 4 ° C bis zur Verwendung gelagert werden. </li></ol> Verfahren <ol><li> Transfer 50ml 1x VBS in Zeilen A1-A12 von einer 96-well U Bodenplatte. </li><li> Um Well A1, fügen Sie 50 ul Anti-A Serum und gründlich mit Hilfe einer Pipette. </li><li> Mit einer frischen Pipettenspitze entfernen 50 ul von Flüssigkeit aus gut A1 und überträgt es auf gut A2. Gründlich mischen und wiederholen Sie diesen Vorgang, bis Sie auch A11 und erreichen dann verwerfen Sie die letzten 50 ul aus dieser Quelle. </li><li> Die Serumprobe wurde nun seriell 2-fach von 1:2 bis 1:2048 verdünnt. Kein Serum ist Well A12 aufgenommen, da dies die VBS negative Kontrolle. </li><li> Wenn mehr als eine Serumprobe zu beurteilen ist, wiederholen Sie die Schritte 4,1-4,4 für Zeile B etc. </li><li> Sobald alle Verdünnungen gemacht worden sind, fügen Sie 50 ul 1% Revercells in alle Vertiefungen. Hinweis: Die Revercells wird zufrieden über die Zeit und sollte vorsichtig suspendiert werden, bevor in die Vertiefungen verteilt. </li><li> Mischen Sie die Proben durch leichtes Antippen auf der Seite der Mikrotiterplatte Tray, Deckel und lassen Sie die Hämagglutination Reaktion für 1 Stunde bei 37 ° C. Ein Inkubator oder entsprechend beheizten Raum genutzt werden kann. </li><li> Nach der Inkubation vorsichtig das Tablett aus dem Inkubator und untersuchen Sie die Platte auf Hämagglutination. Die VBS-Steuerung und sollte die erste gut untersucht werden. Wenn die Reaktion negativ ist, dann sind die Ergebnisse gültig sind. Wenn das VBS Beispiel zeigt eine positive Hämagglutination Ergebnis, dann können die Ergebnisse nicht verwendet werden und der Prozess muss wiederholt werden. Eine positive Hämagglutination Reaktion wird ein breites Blatt, auf der Basis der gut erscheinen, während eine negative Reaktion wird als kleines konzentrierten Pellets von Zellen in der Mitte der gut erscheinen. Ein Zwischenergebnis wird eine Halo-positive Zellen mit einem zentralen Kern von pelletierten Zellen. Dieses Ergebnis kommt als das Serum hat einige Ab, dass reagiert werden kann, aber nicht hinreichende Mengen von Ab, eine vollständige Reaktion zu verursachen. </li><li> Die repräsentativen Ergebnisse Abschnitt hat zwei schematische Darstellungen von den erwarteten Ergebnissen. Ein Beispiel für eine ungültige und gültige Satz von Ergebnissen ist. Der Titer der Anti-Serum wird ebenfalls bestimmt werden. </li></ol> Repräsentative Ergebnisse: Das Video enthält ein Beispiel für repräsentative Ergebnisse. Unten (Abb. 1 und Abb. 2) sind zwei Beispiele in schematischer Weise dargestellt. Das erste Beispiel ist eine Reaktion, die nicht interpretiert werden können, wie das VBS Kontrolle positiv ist, während der zweite ist ein gültiger Test, der für die Titer bestimmt werden können. <img src="/files/ftp_upload/1752/1752fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Ein Beispiel für eine Hämagglutination, wo das positive Ergebnis ist fehlgeschlagen. In der schematischen Darstellung erwähnt, kann die heamagglutination Reaktion nicht akzeptiert werden. Das VBS Serum negative Kontrolle zeigt eine positive Hämagglutination Reaktion, wie durch die Blattbildung auf der Basis der gut belegt. Dies deutet darauf hin, dass ein Fehler aufgetreten ist und die Ergebnisse können nicht akzeptiert werden. In diesem Fall sollte der Vorgang wiederholt werden. <img src="/files/ftp_upload/1752/1752fig2.jpg" alt="Abbildung 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. Ein Beispiel für eine Hämagglutination, wo das positive Ergebnis korrekt gearbeitet hat. In der schematischen Darstellung ist die heamagglutination Reaktion gültig. Das VBS negative Kontrolle zeigt eine negative Reaktion eine Hämagglutinations durch die Pellets, die auf der Basis der gut geformt hat nachgewiesen. Der letzte positive gut Zeile 7, was bedeutet, dass der Titer dieser Serumprobe 128 (dh der reziproke Wert 1 / 128) angibt. Dies wäre ein Beispiel für einen Antikörper, der in moderaten Mengen im Serum ist.

Die Hämagglutination-Assay ist eine sehr einfache Technik, die für eine große Anzahl von Serumproben, um innerhalb kurzer Zeit beurteilt werden können. Es hat auch den Vorteil, dass ohne die Notwendigkeit spezieller Ausrüstung zu lesen, mit dem Auge geeignet. Diese Technik kann auch für den Nachweis von humanem Chorion-Gonadotropin Hormon im Urin modifiziert werden, als Teil einer Hämaglutinationshemmungstest. In Bezug auf einen Standard Hämagglutinationstest, es gibt ein paar Bereiche, in denen darauf zu, um für den Te...

<table><tbody><tr><td>Revercells</td><td>CSL</td><td>02490201</td><td>1 % endgültige Konzentration verwenden</td></tr><tr><td>Anti-A-Serum</td><td>CSL</td><td>02611305</td><td></td></tr><tr><td>96-Well-U-Boden-Platte</td><td>TRP</td><td>92097</td><td>Muss U-förmigen Boden haben</td></tr><tr><td>Veronalsalzgepufferte Lösung</td><td></td><td></td><td>1x endgültige Konzentration verwenden</td></tr><tr><td>37&amp;#x00B0;C Raum/Inkubator</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Einweghandschuhe</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

die bestimmung der reaktivität und titre von serum mit einem hämagglutinations assay

Determining the Reactivity and Titre of Serum using a Haemagglutination Assay

Hämagglutinations ist eine spezifische Form der Agglutination und wird verwendet, wenn Antikörper gegen rote Blutkörperchen, die als Partikel Antigen wirken zu binden. Rote Blutkörperchen sind besonders nützlich, Ziele, da sie leicht verfügbar sind und die Agglutination zu beobachten ist mit dem bloßen Auge. Diese Technik wird häufig verwendet, um den Titer eines Antikörpers (Ab), für die Blutgruppenbestimmung und virale Quantifizierung zu bestimmen. In diesem Video werden die Schritte bei der Vorbereitung und Durchführung einer Hämagglutination Test beteiligten demonstriert mit spezifischen Antikörpern gegen Blutgruppe A-Antigene hinzugefügt, um rote Blutkörperchen (Revercells). Das Antiserum wird seriell in eine 96-Well U-Boden Mikrotiterplatten Tablett verdünnt, an dem eine Aussetzung der Revercells aufgenommen. Die Proben werden gemischt und dann bei 37 ° C für 60 Minuten. Nach dieser Zeit können die Proben dann leicht ve, + ve und Zwischenprodukte (-/+) Hämagglutination Reaktionen erzielt werden. Dieser Ansatz ermöglicht die Reaktivität und die Titer von einer Serumprobe zu beurteilen mit einem schnellen und einfachen Technik. Das Video nimmt die Theorie hinter der Test, wie die Ergebnisse gelesen und interpretiert, wie der Titer bestimmt wird, wie der Test geändert werden können und alle Probleme mit dem Einsatz dieser Technik verbunden sind.

Hämagglutinations ist eine Form der Agglutination, wo Antikörper binden an roten Blutkörperchen. Rote Blutkörperchen sind beide verfügbar und die Ergebnisse sind leicht beobachtbaren mit dem bloßen Auge. Dieses Video zeigt die Schritte in einer Hämagglutination Test beteiligt sind, die Interpretation der Ergebnisse und die Bestimmung der Titer.

Die Bestimmung der Reaktivität und Titre von Serum mit einem Hämagglutinations Assay

Hämagglutination ist eine spezifische Form der Agglutination und wird angewendet, wenn Antikörper an rote Blutkörperchen binden, die als partikuläres Antigen fungieren. Rote Blut...

Bestimmung der Reaktivität und des Titer von Serum mithilfe eines Hämagglutinationsassays. Eine Gleichgewichtsreaktion ist eine Reaktion, die zwischen löslichen Antikörpern und partikulären Antigenen stattfindet. Dazu können Zellen oder Trägermoleküle gehören.Epitope auf der Oberfläche des Trägers ermöglichen es einem Antikörper, sich anzubinden und den Träger zu vernetzen, was zur Bildung eines komplexen Gitters führt, das als Antigen-Antikörper-Komplex bezeichnet wird. Hämagglutination ist eine spezifische Form der Agglutination, bei der Antikörper an rote Blutkörperchen binden, die als partikuläres Antigen fungieren. Rote Blutkörperchen sind nützliche Zielstrukturen, da sie leicht verfügbar sind und die Ergebnisse einfach mit bloßem Auge sichtbar sind.Serumproben werden seriell verdünnt und anschließend in eine 96-Well-UBO-Platte gegeben. Dann wird eine Suspension von roten Blutkörperchen, Riva-Zellen, hinzugefügt. Wenn Antikörper in hoher Konzentration vorhanden sind, binden diese an die roten Blutkörperchen und bilden ein großes Gittergeflecht.Während dieses Gitter durch die Schwerkraft absetzt, passt es sich der Form der Ubo-Platte an. Von oben betrachtet ist ein ausgedehntes Feld aus roten Blutkörperchen zu sehen. Dies ist eine positive Hämagglutinationsreaktion.Wenn die Antikörperspiegel niedrig sind, kann sich kein Gitter bilden, und die roten Blutkörperchen nehmen die Form der UBO-Platte an und konzentrieren sich an der Basis, wodurch ein kleines Pellet entsteht. Dies ist eine negative Hämagglutinationsreaktion. Dieses Diagramm zeigt eine positive Reaktion.Die Zellen bilden ein Gitter, während sie sich absetzen, und passen sich der Form der U-förmigen Bodenplatte an. Links und rechts sehen wir die Draufsicht, bei der ein breites Feld roter Blutkörperchen sichtbar ist. Wenn eine mittlere Menge an Antikörpern vorhanden ist, wird die Bildung einiger Buchstaben beobachtet.Die Hämagglutination ermöglicht auch, die Reaktivität verschiedener Serumproben gegenüber dem bekannten Antigen zu testen. Außerdem kann die Titerhöhe der Serumprobe bestimmt werden. Der Titer ist die letzte Verdünnung, bei der eine positive Reaktion beobachtet wurde.Normalerweise gilt: Je höher die Antikörperkonzentration in der Serumprobe ist, desto höher ist der Titer. Dieses Diagramm zeigt eine negative Hämagglutinationsreaktion. Es sind nicht ausreichend Antikörper vorhanden, um die roten Blutkörperchen zu vernetzen.Während die Zellen durch die Schwerkraft absinken, rutschen sie an der Wand des Wells entlang und bilden am Boden ein dichtes Pellet. Das Diagramm rechts zeigt die roten Blutkörperchen, wie sie von oben betrachtet aussehen. Für dieses Experiment benötigen Sie eine 96-Well-U-Boden-Platte.Es ist unbedingt erforderlich, eine U-förmige Mikrotiterplatte zu verwenden, da Zellkulturplatten mit flachem Boden nicht ermöglichen, dass sich die Zellen zu einem Pellet absetzen, wodurch die Auswertung unmöglich wird. Ein Pipettierroboter, der 50 µL Serum, eine 1%-ige Suspension von Riva-Zellen und eine einmalige Lösung von Veronal-Puffer-Salzlösung in jede Vertiefung der Reihe A sowie 50 µL Ringer-Puffer-Salzlösung in die Vertiefungen 1 bis 12 abgeben kann.Dies dient als Ihr Verdünnungsmittel. Geben Sie nun 50 Mikroliter Serum in das Loch A1. Dies ist Ihre erste Verdünnung im Verhältnis 1:2.Unter Verwendung des Perpet sicherstellen, dass die Serumprobe gründlich gemischt wird. Nach dem Mischen 50 Mikroliter aus Vertiefung A1 entnehmen und in Vertiefung A2 überführen. Dies ist Ihre zweite Verdünnung im Verhältnis 1:2 und ergibt eine vierfache Verdünnung.Setzen Sie diese Verdünnungsreihe mit den Vertiefungen drei bis elf fort. Geben Sie kein Serum in Vertiefung 12, da dies Ihre negative Kontrolle mit Pufferl&ouml;sung ist. Nehmen Sie nun Ihre 1 %ige Suspension von Riva-Zellen, die gr&uuml;ndlich gemischt wurde, und &uuml;bertragen Sie 50 Mikroliter in Vertiefung A1 bis A12.Nachdem die Zellen hinzugefügt wurden, bedecken Sie die Platte und klopfen Sie vorsichtig darauf, um sicherzustellen, dass die Proben und die Zellen gut vermischt sind. Inkubieren Sie nun 60 Minuten bei 37 Grad. Ein befeuchteter Inkubator ist geeignet.Während der 60-minütigen Inkubationszeit finden Antigen-Antikörper-Wechselwirkungen statt, und die Zellen beginnen sich abzusetzen. Die angezeigte Videosequenz ist eine Zeitrafferaufnahme des gesamten 60-minütigen Zeitraums. Dies ist eine Vergrößerung der Vertiefungen fünf bis zehn.Wir haben bereits gut 12 untersucht, der Ihre VBS-Kontrolle in diesem Experiment war. Die Zellen hatten ein dichtes Pellet gebildet, was darauf hindeutet, dass der Test ordnungsgemäß funktioniert hat. Gutt 5 und 6 sind Beispiele für eine positive Hämagglutination.Nun, Brunnen sieben ist ein Beispiel für ein intermediäres Agglutinationsergebnis, während die Brunnen acht, neun und zehn negativ für Häm-Agglutination sind. Basierend auf diesem Ergebnis würde die Titerbestimmung anhand der Verdünnung des Brunnens sieben erfolgen, da dies der letzte Brunnen war, in dem eine positive Reaktion beobachtet wurde.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Ein einfaches Slot-Blot-Methode wurde für die Quantifizierung von Influenza Virus Hämagglutinin und Neuraminidase mit universellen Antikörper, die gegen ihre stärksten konservierten Sequenzen durch bioinformatische Analysen identifiziert entwickelt. Dieser innovative Ansatz kann eine sinnvolle Alternative zu quantitativen Bestimmung aller viralen Hämagglutinin und Neuraminidase.

Quantitative Analysen aller Influenza Typ A Viral Hämagglutininen und Neuraminidasen mit Universal Antikörper in Einfache Slot Blot Assays

Das Video zeigt einen Hämagglutinations-Inhibitions-Assay zum Nachweis von Serum-Antikörpern gegen spezifische Antigene. Die Bestätigung der Hämagglutinationshemmung in der Testvertiefung und der Hämagglutination in der Kontrollvertiefung wird durch unterschiedliche visuelle Muster erreicht. Dieser Assay spielt eine entscheidende Rolle bei der Bewertung der Immunantwort, der Wirksamkeit von Impfstoffen und der Untersuchung von Virusinfektionen in der Virologie und Immunologie.

Der Hämagglutinationshemmungsassay zum Nachweis von Serumantikörpern gegen ein Zielantigen

Dieses Video zeigt Mikroneutralisationsassays zur Messung neutralisierender Antikörper mit Hilfe von Madin-Darby Canine Kidney Zellen, die α2,6-verknüpfte Sialinsäure in menschlichen Seren überexprimieren. Dieser Assay wird häufig in der Influenza-Humanserologie...

Ein Mikroneutralisationsassay zur Messung neutralisierender Antikörpertiter im Humanserum

Dieses Video zeigt einen Assay, der die Influenza-Neuraminidase (NA) misst, die die Antikörpertiter in einer Serumprobe hemmt. Eine Serumprobe, die Antikörper gegen NA enthält, wird auf eine mit Fetuin beschichtete Mikrotiterplatte gegeben. Nach Zugabe des Virus verhindern die Antikörper, dass virale NA Fetuin spaltet und seine Galaktose-Einheit freilegt. Anschließend wird ein Peroxidase-konjugiertes Lektin zugegeben, das an die exponierte Galaktose bindet. Der NA-hemmende Antikörpertiter wird...

Ein Assay zur Messung von Antikörpertitern zur Influenza-Neuraminidase-Hemmung

Wir beschreiben den Enzyme-linked Lectin Assay (ELLA) zur Messung von Influenza-Neuraminidase (NA)-Inhibitions-Antikörpertitern in Seren. Der Assay verwendet Erdnuss-Agglutinin, um Galaktose-Rückstände zu quantifizieren, die zugänglich werden, wenn NA Sialinsäure von Fetuin-beschichteten 96-Well-Platten entfernt.

Messung von Influenza-Neuraminidase Inhibition Antikörpertiter durch Enzyme-Linked-Lectin-Assay

Die vorgestellten Protokolle wird beschrieben, wie einen Hämagglutination Inhibition Assay Quantifizierung des Influenza-spezifischen Antikörper-Titer von Serumproben von Grippe-Impfstoff Empfängern durchführen. Der erste Test bestimmt optimale virale Antigen-Konzentrationen durch Hämagglutination. Die zweite Probe quantifiziert Influenza-spezifischen Antikörper-Titer Hämagglutination Inhibition.

Eine optimierte Hämagglutination Inhibition (HI) Assay, Influenza-spezifischen Antikörper-Titer zu quantifizieren

Wir beschreiben eine Methode, um der Aktivierung des Fc-vermittelten Effektor-Funktionen durch Antikörper dieses Ziel der Influenza Virus Hämagglutinin messen. Dieser Test kann auch angepasst werden, um die Fähigkeit der monoklonale Antikörper oder polyklonalen Seren gezielt andere virale Oberfläche Glykoproteine induzieren Fc-vermittelten Immunität zu beurteilen.

Eine Methode zur Bewertung von Fc-vermittelten Effektor-Funktionen durch Influenza Hämagglutinin spezifische Antikörper induziert

Grippe neutralisierende Antikörper korrelieren mit dem Schutz der Influenza-Infektionen. Microneutralization Assays messen neutralisierende Antikörper im menschlichen Serum und dienen oft der menschlichen Grippe-Serologie. Wir beschreiben einen Microneutralization-Assay mit MDCK-SIAT1 Zellen um zu messen, neutralisierende Antikörpertiter zu zeitgenössischen 3C.2a und 3C.3a a/H3N2-Viren nach Influenza-Impfung oder Infektion.

Messung der Influenza neutralisierenden Antikörperantworten gegen a/H3N2-Viren im menschlichen Serum von Microneutralization Assays mit MDCK-SIAT1 Zellen

In diesem Artikel wird eine vereinfachte Methode zur Herstellung von 4 Hämagglutinationseinheiten Antigen für serologische Tests auf das Virus der Newcastle-Krankheit vorgestellt. Durch die genaue Bestimmung des Hämagglutinationstiters des Antigens, kombiniert mit einer strengeren Rücktitrationsmethode und einem genau definierten Anpassungsprozess, erhöht es die Testeffizienz, reduziert falsch positive Ergebnisse und verbessert die Krankheitsüberwachung bei Geflügel.

Optimierung der Antigenpräparation für den Hämagglutinationshemmungsassay der Newcastle-Disease-Virus-Serologie

Der klassische Weg wird durch Antikörper aktiviert und gipfelt in Ziel-Zell-Lyse. Die...

Die Messung der 50% Hämolytische Complement (CH 50) Aktivität von Serum

Lernen Sie die Hämagglutination zur Bestimmung von Antikörper-Reaktivität und Titer in Serumproben. Diese serologische Methode ermöglicht Immunologen eine schnelle visuelle Analyse.

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