Dissection und Kultur kommissuralen Nervenzellen aus embryonalen Rückenmark

Dieses Video demonstriert eine Methode zur Dissektion und Kultivierung von comm-chiralen Neuronen aus dem embryonalen Rückenmark. Das Verfahren beginnt mit der Gewinnung von E13-Rattenembryonen und anschließender Isolierung der Rückenmarkstränge. Während der Dissektion werden die Rückenmarkstränge entlang der Dachplatte eröffnet und in der offenen Buch-Konfiguration präpariert.

Dorsale Gewebestreifen werden präpariert und in einem Reagenzglas gesammelt. Das dorsale Gewebe wird durch Trypsin und mechanische Dissoziation in eine Einzelzell-Suspension aufgelöst. Anschließend werden kommissurale Neurone auf mit Polylysin beschichteten Glasdeckgläsern oder in Zellkulturschalen kultiviert.

Sie können dann verwendet werden, um die zellulären und molekularen Mechanismen des Axonwachstums und der Axonführung zu untersuchen. Hallo, ich bin Sebastian aus dem Labor für Molekularbiologie der neuronalen Entwicklung am klinischen Forschungsinstitut von Montreal. Hallo, ich bin Steve Moen, ebenfalls aus dem Labor für Molekularbiologie der neuronalen Entwicklung.

Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Dissektion und Kultivierung von Kommissuralkomponenten aus dem embryonalen Rückenmark. Wir verwenden dieses Verfahren in unserem Labor, um die zellulären und molekularen Mechanismen der Wachstumslenkung zu untersuchen. Beginnen wir also.

Heute werden Rückenmarke von frisch gewonnenen E13-Rattenembryonen unter Verwendung eines L15-Mediums in einer Petrischale während der Präparation isoliert. Es ist wichtig, die Embryonen und Lösungen auf Eis zu halten. Beachten Sie, dass bei allen Präparationsschritten vermieden werden muss, das Rückenmark mit einer Nickelzange zu dehnen, da dies die Isolierung eines vollständig intakten Rückenmarks beeinträchtigen kann.

Unter einem Stereomikroskop das Embryo von allen extraembryonalen Geweben und embryonalen Membranen trennen. Anschließend ein Embryo in die Präparationschale geben. Mit einer Feinschere den Kopf und die hinteren Teile der hier gezeigten Winkel abschneiden.

Dadurch entsteht eine ebene Oberfläche, die die Positionierung des Embryos für einen einfachen Zugang zum Rückenmark erleichtert. Positionieren Sie den Embryo mit der Bauchseite nach unten und dem Kopfende nach hinten. Verwenden Sie eine Pinzette, um den Embryo fest an einer Seite festzuklemmen.

Drücken Sie die Pinzette nicht zusammen oder lassen Sie sie los, da das Gewebe sonst mit dem zweiten Paar Pinzetten einreißt. Fassen Sie die Haut neben dem Rückenmark an. Bewegen Sie die Spitzen der Haltepinzette.

Entfernen Sie die Haut, die die Rückseite des Embryos bedeckt, um das Rückenmark, das noch von den Hirnhäuten umhüllt ist, freizulegen, und lösen Sie teilweise das Gewebe rechts vom Rückenmark ab. Benutzen Sie geschlossene Pinzetten, um das Gewebe ausgehend von der Höhe der Haltepinzette anzustechen. Arbeiten Sie so nah wie möglich am Rückenmark, ohne es zu berühren.

Mehrfach entlang des Rückenmarks wiederholen. Dadurch werden einige dorsale Wurzelganglien angeheftet und ventrale Organe gestört. An vorderen und hinteren Enden jeweils etwas Gewebe anhängen lassen, beginnend am vorderen Ende.

Verwenden Sie eine hakenförmige Wolframnadel, um die Meningen zu durchtrennen und das Rückenmark entlang der Dachplatte zu öffnen. Drehen Sie das Embryo um 180 Grad und lösen Sie das Gewebe von der verbleibenden Seite auf. Verwenden Sie dabei dieselbe Methode.

Danach das Gewebe vollständig von der linken Seite des Rückenmarks ablösen, also der Seite, die ursprünglich rechts beschädigt wurde. Das Rückenmark seitlich ablegen und mit einer Pinzette den größten Teil des verbleibenden mesenchymalen Gewebes sowie der Spinalganglien entfernen. Mit der Pinzette eine kurze Klappe der Hirnhäute aufklappen. Zu diesem Zeitpunkt bestehen die Hirnhäute und das Rückenmark aus zwei Schichten, die wie eine Sandwichstruktur angeordnet sind.

Verwenden Sie die Pinzette, um den größeren Teil des Rückenmarks am vorderen Ende festzuklemmen. Greifen Sie die beiden getrennten Segmente mit der Pinzette an und lösen Sie die Hirnhäute ab. Führen Sie eine gleichmäßige, kontinuierliche Bewegung aus, da ungleichmäßiges Abziehen die Hirnhautschicht und/oder das Rückenmark beschädigen kann.

Wenn die Meningen während des Ziehens reißen, ist der Teil des Rückenmarks, der an den Meningen verbleibt, in der Regel nicht mehr zu retten. Obwohl dies manchmal möglich ist. Überführen Sie das isolierte Rückenmark vorsichtig mit einer Plastikpipette in eine Schale mit L-15-Medium mit 10 % hitzeinaktiviertem Pferdeserum auf Eis, bevor Sie weitere Embryonen bearbeiten.

Denken Sie daran, das Medium in der Präparierschale durch gekühltes L 15 zu ersetzen, um das Embryo kühl zu halten und die Gewebeintegrität zu bewahren. Gewinnen Sie die Rückenmarkstränge von allen Embryonen, bevor Sie mit den Präparationen des dorsalen Rückenmarks fortfahren. Um die Präparation des dorsalen Rückenmarks zu beginnen, legen Sie einen frisch isolierten Rückenmarkstrang in eine Petrischale, die L 15 mit 10 % erhitztem und aktiviertem Pferdeserum enthält.

Schneiden Sie den breiteren vorderen Teil, der einen Teil des Nachhirns umfasst, weg. Legen Sie dann das Rückenmark flach hin und spreizen Sie es wie ein aufgeschlagenes Buch auseinander. Das dorsale Gewebe befindet sich in den am stärksten lateralen Bereichen des aufgeschlagenen Rückenmarks, während das Rückenmark mit einer geraden Wolframeine fixiert wird; verwenden Sie eine L-förmige Wolframeine, um einen Streifen von etwa einem Fünftel der Breite einer Hälfte des Rückenmarks herauszuschneiden. Breitere Streifen erhöhen die Ausbeute, verringern jedoch die Reinheit der Kultur.

Überführen Sie mehrere dorsale Streifen in ein 15-Milliliter-Konischgefäß, das L-15-Medium mit 10 % Pferdeserum enthält, und stellen Sie das Gefäß auf Eis. Der Rest des Verfahrens erfolgt in der Nähe oder innerhalb der Zellkulturwerkbank. Für diese Kulturen ist es wichtig, Lösungen und Geräte im Voraus vorzubereiten, gewöhnlich vor der Dissektion.

Der Schritt der Übertragung verwendet feuerpolierte Glasröhrchen in zwei Größen, eines mit einem Durchmesser, der halb so groß wie der ursprüngliche ist, und ein anderes leicht kleineres. Bevor Sie beginnen, beschichten Sie die beiden feuerpolierten Röhrchen mit einem Medium, das Serum enthält, indem Sie das Medium in die Röhrchen ansaugen und 30 Sekunden lang ruhen lassen. Dies verringert die Anzahl der Zellen, die während der Übertragung an dem Glas haften bleiben.

Beginnen Sie damit zu überprüfen, ob die dorsalen Streifen am Boden des Reaktionsgefäßes abgesunken sind. Entfernen Sie unter einer laminaren Luftströmungshaube das meiste SUP-Überstandsmittel mit einer einfachen Pasteurpipette. Waschen Sie schnell mit drei Millilitern kalter, magnesium- und calciumfreier HBSS.

Lassen Sie den dorsalen Neuralrohrenstreifen zwei Minuten lang ruhen. Anschließend entfernen Sie das HBSS mit der Paste und stellen das Volumen auf 4,7 Milliliter ein.

Mit warmem HBSS 0,3 Milliliter 2,5 %iger Trypsinlösung hinzufügen, um eine Endkonzentration von 0,15 % Trypsin zu erreichen, vorsichtig mischen und sieben Minuten lang in einem Wasserbad bei 37 Grad Celsius inkubieren, wobei einmalig zur Hälfte der Inkubationszeit vorsichtig nachgemischt wird. Nach Ablauf der Inkubation DNase hinzufügen, um eine Endkonzentration von 150 Einheiten pro Milliliter zu erreichen, sowie Magnesiumsulfat für eine Endkonzentration von 0,15 %, und kurz anmischen.

Die dorsalen Abschnitte des Neuralrohrs sollten nun fragmentiert sein. Zentrifugieren Sie die Gewebefragmente bei 200 × g für vier Minuten. Entfernen Sie das Überstand-Sup mit einer Pasteurpipette, wobei etwa 50 bis 100 Mikroliter Flüssigkeit am Boden des Röhrchens verbleiben.

Bewegen Sie das Röhrchen vorsichtig, um das Pellet zu lösen. Waschen Sie die Zellen anschließend, indem Sie fünf Milliliter warmes HBSS hinzufügen. Lassen Sie die Zellen zwei Minuten bei Raumtemperatur sedimentieren.

Zentrifugieren und waschen Sie die Zellen erneut. Dieses Mal resuspendieren Sie sie in zwei Milliliter warmem HBSS. Verwenden Sie eine Pipette mit halbem Durchmesser und feuerpolierter Spitze, um die Zellen durch langsames Auf- und Abpipettieren vier bis sechs Mal zu trituriern. Leiten Sie die Flüssigkeit dabei gegen die Röhrenwand, um größere Zellklumpen aufzubrechen und den Zelltod zu verringern.

Vermeiden Sie die Bildung von Blasen und überpipettieren Sie nicht. Verwenden Sie die kleinste feuerpolierte Glas-Pasteurpipette, um die Zellen durch langsames mehrmaliges Auf- und Abpipettieren – drei bis vier Mal – weiter zu dissociieren. Es ist nicht notwendig, alle Zellklumpen vollständig zu dissociieren, da Aggregate oft aus toten Zellen und Zelltrümmern bestehen.

Lassen Sie Gewebefragmente eine Minute lang absinken. Anschließend entfernen Sie 20 Mikroliter des überstehenden Überstandes (SUP), der die suspendierten Zellen für die Zählung in einem Hämazählkammer enthält. Die Neuronen sollten durch Trypanblau-Auschluss mindestens zu 95 % vital sein. Geben Sie die Neuronen in Neurobasal-Plattierungsmedium ein, und zwar in einer für Ihre Anwendung geeigneten Konzentration.

16 bis 18 Stunden später wechseln Sie das Medium in neuronales Basalwachstumsmedium, um ein Lösen zu vermeiden. Die Neuronen entfernen das Medium vorsichtig mit einer Pipette, anstatt es mit einer Vakuumpumpe abzusaugen. Hier sind einige repräsentative Ergebnisse isolierter kommissuraler Neuronen, die vier Stunden nach der Aussaat auf PLL-beschichteten Glasdeckgläsern aufgebracht wurden; die Neuronen hatten sich 30 Stunden nach der Aussaat an der Oberfläche angeheftet.

Die meisten Neuronen verfügen über ausgedehnte Axone mit einem sichtbaren Wachstumskonus. Diese Neuronen können leicht in Immunfluoreszenzexperimenten verwendet werden. In diesem Beispiel sind Mikrotubuli grün markiert, F-Aktin rot und NA blau.

Wir haben Ihnen soeben gezeigt, wie man Kommissurale Neuronen aus embryonalen Rückenmarksgeweben isoliert und kultiviert. Bei diesem Verfahren ist es wichtig zu beachten, dass die Reinheit der kommissuralen Neuronen von der Dicke des dorsalen Streifens abhängt, der herauspräpariert wird. Damit ist der Vorgang abgeschlossen.

Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.