Primären humanen bronchialen Epithelzellen aus Explantaten Grown

In diesem Artikel beschreiben wir ein Protokoll für das Wachstum und die Expansion von humanen Bronchialepithelzellen aus frisch isolierten humanen Bronchialsegmenten. Dieses Protokoll besteht aus fünf Abschnitten, Codierung und Kratzen, Hundert-Millimeter-Kulturplatten, Reparatur von Bronchialgewebe, Explan-Transplantationen von Bronchialepithelzellen, Passage von menschlichen Bronchialepithelzellen, die Flimmerzellen züchten, menschliche Bronchialepithelzellen auf Transwells. Bevor Sie beginnen, beachten Sie, dass alle Schritte in der biologischen Sicherheitswerkbank durchgeführt werden.

Sofern nicht anders angegeben, lesen Sie bitte den Abschnitt Materialien, Reagenzien und Zubereitung und stellen Sie sicher, dass Sie sich gründlich vorbereitet haben. Die folgende Codierung, Stammlösungskultur, mittlere Dissoziationslösungen, Beschichtung und Kratzen. Hundert-Millimeter-Kulturplatten sollten in der BST gemacht werden.

Halten Sie alles steril. Sterile Hundert-Millimeter-Kulturplatten und die Beschichtungslösung aufsetzen. In der BST-Pipette wirbeln zwei Mühlen mit Beschichtungslösung und eine Hundert-Millimeter-Platte herum, um den Boden der Platte zu beschichten.

Stellen Sie sicher, dass die Beschichtungslösung den Boden der Platte gleichmäßig bedeckt. Pipettieren Sie die übrig gebliebene Lösung heraus und beschichten Sie damit eine zweite Hundert-Millimeter-Platte. Wiederholen Sie den Vorgang für so viele Teller wie nötig.

Die Anzahl der benötigten Platten variiert mit der Anzahl der Gewebeexplantate. Stellen Sie sicher, dass die Beschichtungslösung den Boden der Platten gleichmäßig bedeckt. Wie gezeigt.

Decken Sie die Teller mit ihren Abdeckungen ab. Lassen Sie die Platten ein bis zwei Stunden im Inkubator trocknen und aspirieren Sie vor Gebrauch die Zugangslösung. Für das Bronchialgewebe explanieren. Unbenutzte beschichtete Kulturplatten können in einen sterilen Beutel gelegt und bei vier Grad Celsius für später gelagert werden.

Verwenden Sie eine sprühsaubere, kleine, scharfe Schere, ein Skalpell und eine Pinzette mit 70% Ethanol und bringen Sie die kratzbeschichteten Platten in die BSC, indem Sie mit dem Skalpell fest auf das Skalpell drücken, um mindestens vier tiefe kleine XS pro Platte zu bilden. Wenn der Kratzer nicht tief genug ist, setzen sich die Gewebestücke nicht in den Spritzen ab und schwimmen nach außen. Die BSC legen das Gewebe in eine P drei Schale. Spülen Sie das isolierte menschliche Bronchialgewebe gründlich in Bss aus.

Öffne die Bronchialstücke. Bringen Sie das Gewebe in den BS und überführen Sie es in eine sterile Hundert-Millimeter-Gewebekulturplatte mit dem Namen DM EM Schinken F 12 plus 1% Antibiotikum, Antimykotikum. Schneide das Taschentuch mit der scharfen kleinen Schere in zwei bis drei Millimeter große Würfelstücke.

Legen Sie mit einer Pinzette und einem Druck ein Stück geschnittenes Gewebe in die Mitte jedes X. Lassen Sie die Gewebestücke oder X-Explantate einige Sekunden lang vorsichtig an der Platte haften. Und dann fügen Sie vorsichtig 10 mil vollständiges Medium hinzu Wenn das Gewebe schwimmt Nach dem Hinzufügen von Medien drücken Sie das Gewebe mit einer Pinzette in die Rillen des X oder machen Sie ein neues X.It kann erforderlich sein, um neue Xs zu machen, wenn die Rillen nicht tief genug sind.

Legen Sie die Platten in den Inkubator und wechseln Sie das Medium alle drei bis vier Tage, bis das Gewebe für die Transplantation bereit ist. Wenn genügend Epithelzellen um das Gewebe herum gewachsen sind, um ein bis zwei Zentimeter große Bereiche abzudecken, dauert dies etwa vier Wochen. Verwenden Sie hundert Millimeter beschichtete und zerkratzte Platten.

Da einige Gewebeexplan möglicherweise nicht erfolgreich sind. Die Anzahl der Platten hängt davon ab, wie viele Gewebestücke Sie transplantieren. Wenn Sie Platten verwenden, die zuvor beschichtet und bei vier Grad Celsius gelagert wurden, bringen Sie sie vor dem Gebrauch auf Raumtemperatur. Nehmen Sie mit einer Pinzette vorsichtig Gewebe von der ursprünglichen Platte auf und legen Sie es in die Mitte der Achse in die neue Platte und drücken Sie es vorsichtig Tücher ohne Auswuchs sollten entsorgt werden.

Lassen Sie das Gewebe an der Platte haften. Fügen Sie einige Sekunden lang Medien hinzu, und inkubieren Sie. Fügen Sie das oben beschriebene für X explan hinzu.

Also zwei Mil Trips Und EDTA-Stammlösung für jede Hundert-Millimeter-Gewebekulturplatte. Verdünnen Sie das Material mit sechs mil Steryl 0,01 molar PBS und zwei mil Stammlösung auf sechs mil PBS für eine Endkonzentration von Trypsin bei zwei 50 Mikrogramm pro mil und für EDTA bei hundert Mikrogramm pro mil. Nach dem Verschieben der Explantate auf eine neue Platte aspirieren Sie Medien aus Platten mit ein bis zwei Zentimeter langen Zellringen.

Fügen Sie acht mil warme, verdünnte Tropfen hinzu und geben Sie eine Lösung auf jede Hundert-Millimeter-Platte. Und stellen Sie einen Inkubator drei bis 15 Minuten lang bei 37 Grad Celsius auf. Überprüfen Sie regelmäßig.

Wenn Sie Trypsin zu lange einwirken lassen, werden die Zellen geschädigt. Überprüfen Sie die Platten unter einem Mikroskop, um sicherzustellen, dass die meisten Zellen angehoben wurden, die Zellen runden sich auf und lösen sich, wie bei acht Mil Wärme gezeigt. 10% FBS in Medien pro Platte zur Inaktivierung der EDT eine Lösung.

Kombinieren Sie das Volumen aller Platten in einem Röhrchen oder trennen Sie Röhrchen mit verschiedenen Geweben. Zählen Sie die Zellen mit einer Häma-Zytometer-Zentrifuge fünf Minuten lang bei hundert g. An der Basis des Röhrchens bildet sich ein Zellpellet, das das Zellpellet in einem vollständigen Medium auf die gewünschte Zellkonzentration resuspendiert.

Je zwei bis 3 Millionen Zellen pro Kolben T 75 werden platziert und je nach Bedarf vollständige Medien hinzugefügt. Inkubieren und Wechseln von Medien. Alle drei bis vier Wochen wachsen die Zellen in D 75-Kolben bis zur Subkonfluenz.

In etwa vier Wochen sollten die Zellen angehoben und expandiert oder an der Subkonfluenz verwendet werden, um Sene zu verhindern. Beginnen Sie mit der Vorbereitung der durchlässigen Membranen der Transwells. Verwenden Sie die 6,5-Millimeter-Einsätze, die in die 24-Well-Multiple-Well-Platten passen.

Geben Sie Medium auf beide Seiten der Membran. Spitze sechs mil auf der Unterseite und 0,1 mil auf der Oberseite. Eine Stunde im Zellkultur-Inkubator inkubieren.

Entfernen Sie das Medium vorsichtig von beiden Seiten der Membran. Wenn Sie zuerst vorsichtig mit dem Basalvolumen beginnen, kann die Membran leicht beschädigt werden. Pipettieren Sie also das Medium an der Seite des Kultureinsatzes entlang und verwenden Sie das empfohlene Volumen.

Andernfalls gelangt das Medium zu anderen Bohrlöchern zu den Samenzellen. Nach der Vorinkubation des permeablen Trägers pipettieren Sie Ihre Zellsuspension vorsichtig in die epische Seite der Membran für 6,5-Millimeter-Wells mit 0,1 mil Zellsuspension auf die epische Seite der Membran. Pipettieren Sie 0,6 M, Medium auf der basalen Seite der Membran.

Füttern Sie die Zellen von der epischen und basalen Seite für 10 Tage. Um einen gut differenzierten Kulturaustausch zu etablieren, veranstalten Sie zweimal pro Woche. Entfernen Sie mit der gezeigten Methode das Basalvolumen.

Ersetzen Sie zuerst das epische Volumen und fügen Sie 0,6 mil Medium auf die basale Seite der Membran hinzu. Diese Methode fördert die Adhäsion der Zellen an die Membran und verhindert, dass die Zellen über längere Zeiträume der Luft ausgesetzt sind. Tauschen Sie die Medien schnell aus und stellen Sie einen Inkubator zurück.

Schaffen Sie an Tag 10 eine Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche, indem Sie das AAL-Medium entfernen und die 0,6 mil Medium auf der basalen Seite der Membran ersetzen. Halten Sie die Zellen sechs Wochen lang in der Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche, wechseln Sie das Medium zweimal pro Woche. Flimmerzellen beginnen vier Wochen nach der Erstellung des Ohrs zu erscheinen.

Flüssige Grenzfläche. Die Zellen erreichen eine gleichmäßige Differenzierung in Flimmerzellen. Sechs Wochen nach der Erstellung der Ohrflüssigkeitsschnittstelle.

Humane Bronchialsegmente mit gesunden Epithelzellen aus Explan und Transplantationen. In unserer Studie traten in acht von neun Geweben erfolgreiche Kulturen aus dem Bronchialgewebe auf. Als eine der Explan-Kulturen infiziert wurde, erreichten die Ringe der Epithelzellen innerhalb von drei bis vier Wochen einen Radius von ein bis zwei Zentimetern.

Erfolgreiche X explan wurden bis zu sechsmal erneut kultiviert. Alle erfolgreichen Kulturen zeigen Hinweise auf eine Zellmigration innerhalb von 48 Stunden nach Beginn der Transplantationen, oder X explan, wie in B-Zellen gezeigt, haben ein Kopfsteinpflaster-Aussehen, das für diese Epithelzellen unterschiedlich ist, wie in B gezeigt. Und in den nachfolgenden Abbildungen zeigte die Immunfärbung von Cytosin-Präparaten von Zellen aus Explan und Zellen, die auf Deckgläsern ausgesät wurden, dass alle Zellen positiv für das epithelspezifische Cytokeratin waren. Hier sind humane Subkultur-Bronchialzellen, die zu Subkonfluenz- und T-75-Kolben gezüchtet wurden, dargestellt. Beachten Sie das Kopfsteinpflaster-Aussehen.

Humane Subkultur-Bronchialzellen zeigten eine einheitlich positive Immunfärbung für Kerin und E.Can him Immunfärbung mit spezifischen Antikörpern gegen andere Zelltypen zeigte keinen Hinweis auf eine Kontamination von Kulturen durch Fibroblasten, mesenchymale oder Endothelzellen. Für weitere Einzelheiten beziehen Sie sich bitte auf Abbildung fünf und ihre Legende im Text Zellen, die auf permeablen Polyestermembranen kultiviert wurden, oder Transwells mit oder flüssiger Grenzfläche, die in Flimmerepithel differenziert sind, wie hier gezeigt, verwerfen Zellen und ihre oder transplantiert, wenn Zellen mit einer anderen Morphologie, wie hier gezeigt, zu erscheinen beginnen. In diesem Protokoll haben wir detaillierte Methoden zur Kultivierung und Expansion von primären humanen Bronchialepithelzellen vorgestellt.

Studien auf der Grundlage humaner Zellen sind erforderlich, um wichtige Signalwege der Mechanismen menschlicher Lungenerkrankungen zu bestimmen und um die Toxizität und das pharmakologische Screening neuartiger Arzneimittel zu gewährleisten. Wir hoffen, dass die hier beschriebenen Methoden Sie dazu ermutigen, humane Bronchialepithelzellen aus Explantaten zu kultivieren und diese Zellen in Ihren Studiensystemen zu verwenden. Vielen Dank und viel Glück.