Umfassende Analyse der Zusammensetzung von pflanzlichen Zellwänden (Lignozellulose) Teil II: Kohlenhydrate

Die Bestimmung der Matrixpolysaccharidzusammensetzung und des kristallinen Cellulosegehalts von pflanzlichen Zellwänden beginnt mit getrocknetem Pflanzenmaterial, das verschiedenen Extraktionen unterzogen wird. Das resultierende Material besteht nur aus Zellwänden und wird dann aufgespalten, um die Zusammensetzung der Matrixpolysaccharide zu bestimmen. Das Wandmaterial wird mit einer schwachen Säure zur Hydrolyse von nichtkristallinen Polysacchariden, die hauptsächlich aus Hämocellulosen bestehen, in ihre Monosaccharide umgewandelt

Die Monosaccharide werden dann in ihre entsprechenden flüchtigen Aldolacetate abgeleitet, die dann durch Gaschromatographie in Verbindung mit einem Massenspektrometer zur Bestimmung von kristalliner Cellulose analysiert und quantifiziert werden. Die Inhaltswände werden mit dem Graphreagenz behandelt, einem Säuregemisch, das nichtkristalline Wandbestandteile entfernt. Die verbleibende kristalline Cellulose wird zu ihrem Monomer Glukose abgebaut, das metrisch bestimmt werden kann.

Die Bestimmung des Ligningehalts und der Zusammensetzung wird in einer weiteren J-Videoveröffentlichung mit dem Titel Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls, part One Lignin demonstriert. Hallo, ich bin Marcus Pauley, Leiter der Wall-Analyseeinrichtung am Great Lakes Bioenergy Research Center hier an der Michigan State University. Ich bin Cliff Foster, Manager der Cell Wall Analytical Facility.

Heute zeigen wir Ihnen, wie Sie die Zusammensetzung der Polysaccharide bestimmen können, die im pflanzlichen Zellwandmaterial enthalten sind, das Zellulose in verschiedenen Homo-Zellulose ist. Hier im Great Lakes Bioenergy Research Center entwickeln wir Technologien, um diesen Zucker in Biokraftstoffe umzuwandeln. Um einen optimalen pflanzlichen Rohstoff zu identifizieren, müssen wir zunächst die Art und Häufigkeit von Zuckern bewerten, die in dieser Biomasse enthalten sind.

In einem weiteren Video mit dem Titel Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls, part one Lignin konzentrieren wir uns auf die Polyphenolanalyse. Also lasst uns loslegen. Beginnen Sie diesen Vorgang, indem Sie Zellwände isolieren.

Mahlen Sie etwa 60 bis 70 Milligramm getrocknetes Pflanzenmaterial mit 5,5 Millimeter Edelstahlkugeln in einem zwei mil SAR TED-Schraubverschlussrohr. Verwenden Sie eine REM-Mühle als Alternative mit hohem Durchsatz und verwenden Sie einen Schleif- und Dosierroboter, der als Eyewall bezeichnet wird, wie im ersten Teil beschrieben. Wenn der Schleifvorgang abgeschlossen ist, entfernen Sie die Stahlkugeln.

Fahren Sie mit der Isolierung der Zellwände fort und entfernen Sie Reststärke, wie im ersten Teil gezeigt und im begleitenden schriftlichen Protokoll beschrieben. Wiegen Sie zwei Milligramm DS-Stärke-Zellwandmaterial in ein Rohr mit zwei Mahlwerken. Eine Methode mit hohem Durchsatz, um diese Aufgabe zu erfüllen, ist der Eyewall-Roboter.

Der Roboter nimmt ein Rohr mit gemahlenem Pflanzenmaterial und sticht ein Loch in den Boden des Rohrs. Das durchstochene Rohr wird dann auf eine VI-Zuführung gelegt. Ein leeres Rohr wird auf eine Waage gestellt und durch Vibration unter die VI-Zuführung geschoben, Material sickert durch das Loch im geladenen Oberrohr in das leere Unterrohr, bis sich die gewünschte Materialmenge angesammelt hat.

Fügen Sie 100 Mikrogramm Acetol als internen Standard hinzu. Spülen Sie die Röhrchenwände mit Aceton, um das Zellwandmaterial am Boden des Röhrchens zu sammeln, und verdampfen Sie das Aceton sehr vorsichtig unter Luftstrom. Führen Sie als nächstes eine schwache Säurehydrolyse durch.

Geben Sie vorsichtig 250 Mikroliter zwei molare Trichloressigsäure oder TFA zu jeder Probe und stellen Sie sicher, dass kein Material auf die Röhrchenwände spritzt. Verschließen Sie die Röhrchen fest und inkubieren Sie sie 90 Minuten lang bei 121 Grad Celsius in einem Heizblock. Kühlen Sie dann die Heizblöcke und Proben auf Eis ab und zentrifugieren Sie die Röhrchen 10 Minuten lang bei 10.000 U/min.

Übertragen Sie 100 Mikroliter des sauren Überstands, der die gelösten Zucker des Matrixpolysaccharids enthält, in Fläschchen mit Schraubverschluss, wobei Sie darauf achten, dass das Pelletmaterial nicht beschädigt wird. Das Pellet kann für den Crystalline Cellulose Assay verwendet werden. Verdampfen Sie die TFA in einem Glasrohr unter einem sanften Luftstrom in einer Verdampfungsvorrichtung.

Fügen Sie 300 Mikroliter von zwei Propanol hinzu, um überschüssige Säurewirbel zu entfernen, und verdampfen Sie bei 25 Grad Celsius. Wiederholen Sie dies insgesamt dreimal. Um die Identifizierung der Monosaccharide durch Gaschromatographie zu ermöglichen, wird eine Aldolacetat-Derivitisierung durchgeführt.

Zuerst werden die Monosaccharide auf die entsprechenden offenen Ringaldole reduziert, die dann acetyliert werden. Detaillierte Anweisungen finden Sie im beigefügten schriftlichen Protokoll. Jeder Schritt des Verfahrens folgt dem zuvor gezeigten Protokoll, Zugabe von Reagenzinkubationsverdampfung unter einem Luftstrom, gefolgt von Entfernung des überschüssigen Reagenzes durch verschiedene Waschschritte.

In den letzten Schritten werden die Aldolacetate extrahiert. Zuerst 500 Mikroliter Ethylacetat hinzufügen und leicht schwenken. Fügen Sie dann zwei mil Wasser hinzu, verschließen Sie die Röhrchen und wirbeln Sie sie vortexen, zentrifugieren Sie die Röhrchen fünf Minuten lang bei 2000 U/min, um klare separate Schichten mit Ethylacetat oben mit den Al-Dettol-Acetaten und Wasser auf der Unterseite zu erhalten, pipettieren Sie 50 Mikroliter Ethylacetatschicht in GCMS-Fläschchen mit Einsätzen, die durch Zugabe von 100 Mikrolitern Aceton in das GC-Fläschchen verdünnt werden, und das GC-Fläschchen kann bei vier Grad Celsius gelagert werden.

Wenn die GCMS-Analyse nicht sofort durchgeführt wird, injizieren Sie die Proben in einen Gas-Chroma-Fotografen, der mit einem Vierfach-Massenspektrometer ausgestattet ist. Für die Rubrik und Details zum Lauf konsultieren Sie bitte das beigefügte schriftliche Protokoll. Ausgangsmaterial für die Bestimmung des kristallinen Cellulosegehalts kann isoliertes Zellwandmaterial oder bereits mit der schwachen Säure TFA behandeltes Wandmaterial sein, entweder unmittelbar nach der sauren Behandlung oder in lagerfähiger getrockneter Form.

Nach dem Entfernen von überschüssigem TFA mit Iso-Propanol, wie zuvor gezeigt, fügen Sie dem TFA-Pellet in den beiden M sars to tube ein M des aus Essigsäure, Salpetersäure und Wasser bestehenden Hochgradreagenzes hinzu und fügen Sie ein Volumen-Volumen-Verhältnis von acht zu eins zu zwei hinzu. Verschließen Sie das Rohr fest und erhitzen Sie es auf einem Heizblock bei 100 Grad Celsius für 30 Minuten. Als Ergebnis dieser Behandlung verbleibt nur kristalline Cellulose im Pellet.

Alle anderen Polysaccharide sind hydrolysierte kühle Proben im Block auf Eis auf Raumtemperatur oder kühler. Zentrifugieren Sie dann die Proben nach der Zentrifugation 15 Minuten lang bei 10.000 U/min, entsorgen Sie den Überstand und stellen Sie sicher, dass das Pellet nicht gestört wird und kein Material aus dem Pellet entfernt wird. Lassen Sie dazu ca. 150 Mikroliter des Überstands in der Tube, waschen Sie das Pellet mehrmals mit Wasser.

Führen Sie anschließend eine Hydrolyse mit der konzentrierten Schwefelsäure durch, um den Kristall und das Zellulosepellet vollständig zu Glukose zu hydrolysieren. Beginnen Sie damit, 175 Mikroliter 72%ige Schwefelsäure in das Sarta-Röhrchen zu geben und 30 Minuten bei Raumtemperatur zu inkubieren. Nach der ersten Inkubation die Probe vortexen und weitere 15 Minuten inkubieren.

Fügen Sie dann 825 Mikroliter Wasser und Vortex hinzu und zentrifugieren Sie die Proben fünf Minuten lang bei 10.000 U/min. Es könnte etwas braunes und lösliches Material vorhanden sein, hauptsächlich Lignin, das im Röhrchen verbleibt, während sich die Glukose im Überstand befindet. Der Glukosegehalt des Überstands wird mit dem Colormetric Anthon-Assay bestimmt.

Dieser Assay wird in einer 96-Well-Polystyrol-Mikrotiterplatte durchgeführt. Reparieren Sie eine Glukose-Standardkurve in zweifacher Ausführung gemäß den Anweisungen im beigefügten schriftlichen Protokoll. Bereiten Sie die Proben vor, indem Sie 10 Mikroliter jeder Probe, Supernat und 90 Mikroliter Wasser in separate Vertiefungen mit derselben Mikrotiterplatte wie bei der Standardbehandlung kombinieren, indem Sie 200 Mikroliter frisch vorbereitetes und geworfenes Reagenz hinzufügen.

Als nächstes erhitzen Sie die Platte 30 Minuten lang bei 80 Grad Celsius in einem Ofen mit einem Aluminium-Heatspreader. Es ist zu beobachten, dass sich die glukosehaltigen Proben nach Beendigung des Erhitzens von gelb auf blaugrün verfärben. Den Teller auf Zimmertemperatur abkühlen lassen und gründlich schütteln.

Lesen Sie die Absorption bei 625 Nanometern mit einem Mikrotiterplatten-Reader ab. Der Gehalt an Glukose, dem Baustein der Zellulose, wird auf der Grundlage der Absorption im Vergleich zur Standardkurve berechnet, die auf derselben Platte festgelegt ist. Hier sind einige repräsentative Ergebnisse der Polysaccharid-Analyse eines Stücks Pappelholz.

Die Peaks des Gaschromatogramms werden durch Massenprofile und/oder Retentionszeiten von Standards identifiziert. Die Quantifizierung der Monosaccharide erfolgt auf Basis von Standardkurven. Die Zuckeranalyse der Matrixpolysaccharide zeigt eine hohe Häufigkeit von Xylose, die Hemicellulose xam repräsentiert, aber auch andere Zucker sind vorhanden.

Der Analyse zufolge bestehen 40% des Pappelmaterials aus Kristall und Zellulose. Bitte beachten Sie, dass diese Inhaltsstoffe und Zusammensetzungen von Pflanze zu Pflanze oder zwischen verschiedenen Pflanzenanatomien variieren können. Wir haben Ihnen gerade gezeigt, wie Sie den Polysaccharidgehalt und die Zusammensetzungsanalyse von Lignano-Zellulose-Biomasse für die Analyse von Polyphenol-Lignin bestimmen können.

Hören Sie sich den ersten Teil an. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.