Name: Die Reinigung des M. magneticum Stamm AMB-1 Magnetosom assoziierten Protein MamAΔ41 (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-03-25T16:45:00.000+00:00
Duration: 11 min 7 s
Description: Erfahren Sie die Reinigung von MamAΔ41 aus Magnetospirillum magneticum AMB-1 mittels Affinitäts-, Ionenaustausch- und Größenausschlusschromatographie. Dieses Protokoll ermöglicht die Analyse magnetosom-assoziierter Proteine.

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Wir danken Dr. Amir Aharoni für seine Unterstützung und Geula Dawydow, Noam Grimberg und Chen Guttman für ihre Ratschläge und Kommentare.

1. Klonierung und Expression von Mama Gene in E. coli Das mutierte Gen mamAΔ41 wurde unter Verwendung der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) aus genomischer DNA von Magnetospirillum magneticum AMB-1 mit Primer: 5'-GCATTACGCATATGGACGACATCCGCCAGGTG-3 'und 5'-GCGCGGCAGCCATA-TGGCATACG-3'. In der amplifizierten DNA-Fragmente wurde eine NcoI-Stelle am ATG eingeführt und die Terminationscodon wurde mit einem ScoI Ort ersetzt. Die Fragmente wurden mit NcoI und SacI verdaut und kloniert in den jeweiligen Standorten der pET52b (+), was zu pET52bMamAΔ41-AMB1. In diesem Konstrukt wurde die mamAΔ41 Gen in-frame mit dem 10-His-Tag am C-Terminus fusioniert. Das Plasmid wurde in E. coli-Stamm BL21 elektroporiert. E.-coli-Stamm BL21 beherbergen pET52bMamAΔ41 in auto-Induktion wurde angebaut (15)-Medium mit Ampicillin (50 mg / ml) 310 ° K für 3 Stunden. Der Anbau Temperatur wurde dann von 310 ° bis 300 ° K verschoben und gewartet für weitere 48 h bei 300 ° K. Die Zellen wurden durch Zentrifugation bei 5465g für 10 min bei 277 ° K. geerntet 8 Liter Kultur produziert 60 Gramm feuchten Zellpellet. 2. Bioinformatics Berechnungen Berechnungen von Molekulargewicht (MW), nach Aminosäuren-Sequenz und die vorhergesagte Aufnahme von 1mg/1ml von Protein in 280nm, mit dem ProtParam Server (http://www.expasy.ch/tools/protparam.html). Für 10His-Tag-MamAΔ41 der MW ist 22529 Da (240 Aminosäuren) und für MamAΔ41 (mit 9 Aminosäuren nach His-tag Entfernung von Thrombin links) Mw ist 20596.5Da (187 Aminosäuren). Der vorhergesagte Aufnahme von 1mg/1ml von Protein in 280nm für 10His-Tag-MamAΔ41 ist 0,595 und für MamAΔ41 ist 0,579. Darüber hinaus bedeutet die Aminosäure-Sequenz enthalten keine Cysteinreste. Daher sind Reduktionsmittel nicht während der Reinigung benötigt. 3. Reinigung von MamAΔ41 <ol><li> Für Stammlösung Vorbereitung, abwiegen und vorbereiten (200 ml) in den folgenden Konzentrationen: Imidazol (MW 228,2 g / mol) 4M Lösung, NaCl (Mw 58,44 g / mol) 5M-Lösung, Tris-HCl (Mw 121,3 g / mol ) 1M-Lösung, pH-Wert einstellen = 8. Fügen Sie doppelt destilliertem Wasser (DDW) und mischen mit einem Vortex, bis die Lösung klar ist. Filter-Lösungen mit 0,22 &amp;mgr; m-Filter und halten bei Raumtemperatur. </li><li> Vorbereiten und Filter 6 frischen Puffer aus Stammlösungen (Tabelle 1). </li><li> Verdünnen und Suspend-Zellen in Puffer A im Verhältnis 1:2, Gramm Zellen Puffervolumen (ml). </li><li> Add 10 &amp;mgr; l für jede 10gr von Bakterien der DNase I (1 mg / ml), um DNA-Fragmente in der Probe zu brechen. 1ml für jede 20gr von Bakterien EDTA frei Protease-Inhibitor-Cocktail. Inkubieren für 20 min auf Eis. </li><li> Unter aufgeschlossenen Zellen in zwei Zyklen von Französisch Presse bei 25.000 psi. Im Gegensatz zu Ultraschall ist die Französisch drücken bei hoher Lautstärke (&gt; 10ml) Zelle Extrusion, indem sie den Zellen unter hohem Druck durch eine dünne Öffnung gerichtet. Der Kolben sollte auf Eis 10 Minuten vor ihrer Verwendung und Montage durch Temperatur Aufbau gekühlt werden. </li><li> Übertragen Sie die lysierten Zellen in 25ml Ultrazentrifuge Rohre und Balance ihnen genau (50mg) mit Puffer A, bis die Probe erreicht das Rohr s Ausschnitt. </li><li> Separate Zelltrümmer durch Ultra-Zentrifugation bei 270.000 g für 1 Stunde bei 277 ° K. </li><li> Bereiten Sie eine hausgemachte Schwerkraft Ni NTA-Säule (2,5 cm Durchmesser) durch Zugabe von 4 ml Ni NTA-Harz, das in 20% Ethanol konserviert sind, auf die Säule. Lassen Sie die Flüssigkeit fallen komplett, dann mit 40 ml DDW waschen und lassen Sie die Flüssigkeit fallen vollständig aus. Voräquilibriert das Harz in der Säule mit 40 ml Puffer A </li><li> Übernehmen der löslichen Fraktion von ultra-Zentrifugenröhrchen auf die Schwerkraft Ni NTA-Säule. Lassen Sie die Flüssigkeit fallen, sammeln Flow-Through-(ungebundene Proteine) und erhalten bei 277K. </li><li> Sammeln Sie Pellet Probe aus dem ultra-Zentrifugenröhrchen mit einem kleinen Tipp, um das Pellet Schrott. Mix der Spitze in 50 ul 5% β-Mercaptoethanol in 2X SDS-PAGE-Probenpuffer. </li><li> Die Säule wird mit 100 ml Puffer B Lassen Sie die Flüssigkeit fallen, sammeln Flow-Through und erhalten bei 277K. </li><li> Bereiten Sie 15 markierte Eppendorf-Röhrchen (1,5 ml). </li><li> Elution - in der Nähe Spalte Ventil und laden Sie dann 1 ml Puffer C auf die Säule; inkubieren 3 min von Öffnungs-und Flow-Through-Auflistung. Wiederholen Sie diesen Schritt dreimal. </li><li> Eluieren Rest der Suspension bei 1 ml Puffer C-Schritten und Schließen des Ventils. </li><li> Messen der OD bei 280 nm der Fraktionen und bewerten Ort der Protein-Peak, wenn die OD ist&gt; 0,3, zusätzliche Proben notwendig sind. </li><li> SDS-PAGE-Analyse der gesammelten Fraktionen. Eine solche Analyse sollte auch mit den folgenden Proben durchgeführt werden, ungebundenen Proteine ​​Flow-Through-, Wasch-Flow-Through-und uLTRA-Zentrifugationspellet Probe. Mix 10 &amp;mgr; l von jeder Probe mit 10 &amp;mgr; l 5% β-Mercaptoethanol in 2X SDS-PAGE-Probenpuffer. Laden Sie die Proben auf 15% SDS-PAGE und führen Sie für 45 min in 180 Volt. </li><li> Stain das Gel in 15 ml InstantBlue Lösung für 1 Stunde geschüttelt. Stellen Sie sicher, dass die Kunststoff-Box bedeckt ist und vor Licht geschützt. </li><li> Bewerten Gel, wenn Proteinexpression ist hoch und spezifische gemäß der indikativen Bands, zusammenführen ausgewählt eluierten Fraktionen. </li><li> Um 10-His-Tag zu entfernen, fügen Rinderthrombin (10 Einheiten / ul), 10 &amp;mgr; l Thrombin pro 1 mg Protein, entsprechend der Empfehlung des Herstellers der kombinierten Probe. </li><li> Die Dialyse ist für überschüssige Imidazol Entfernung verwendet und NaCl-Konzentrationen für die Stufen beim Ionenaustausch Bindung benötigt verringern. Für die Dialyse, schneiden die gewünschte Länge von 7 kD molecular weight cut off (MWCO) Dialyseschlauch. Waschen mit DDW und machen einen Knoten an einem Ende (oder Siegel mit Clips). Transfer fusionierte Protein-Lösung auf den Beutel während Verlassen etwas Platz am oberen und Klemmung. </li><li> Tauchen Sie die Dialyseschlauch in 4 Liter gekühltes Dialyse-Puffer (Buffer D). Rühren Sie die Lösung langsam über Nacht bei 277 ° K. </li><li> Nehmen Sie den Dialyseschlauch aus dem Becherglas, machen einen kleinen Schnitt und den Transfer des Proteins auf 50ml Tube. </li><li> Ionenaustausch-Chromatographie: Montage vorverpackten MonoQ 4.6/100 PE Spalte auf Fast Performance Liquid Chromatography (FPLC). Die Säule wird mit 5 Säulenvolumen (CV) von DDW gefiltertes Wasser. Equilibrated die Säule mit 5 SV Puffer D. </li><li> Waschen Sie die Probenschleife mit DDW (zwei Loop-Volumes) und wiederholen Sie mit Puffer D. Laden des Proteins in der Probenschleife. </li><li> Spritzen Sie die Proteinprobe (Durchfluss von 1 ml / min) und sammeln Fraktionen für SDS-PAGE Detektion von Proteinen unbegrenzt. </li><li> Wenn das erste Protein Volumen (Schritt 3,23) größer ist als Injektionsschleife, wiederholen Sie die Schritte 3,25-3,26, ohne Waschen der Schleife, bis die gesamte Probe auf der Säule geladen wird. </li><li> Die Säule wird mit 3 CV des Puffers C, um grenzenlose Proteine ​​zu entfernen. </li><li> Eluieren des Proteins mit einer 60 min linearer Gradient von 40 2000mm NaCl zwischen Puffer D &amp; E (bei 100% Puffer E das Ende der Steigung), Fließgeschwindigkeit 1 ml / min (obwohl höhere Strömungsgeschwindigkeiten in den Kosten genutzt werden können größere Volumina, aber weniger konzentriert, Protein-Peaks). Sammeln Proteine ​​Gipfel, wie sie in der 280nm-Chromatogramm erscheinen. </li><li> Reinigen Sie vor Füllkörperkolonne nach Empfehlung herzustellen. </li><li> SDS-PAGE-Analyse der gesammelten Fraktionen. Eine solche Analyse sollte mit den folgenden Proben durchgeführt werden, unbounded Proteine ​​Flow-Through-und Protein-Peaks Durchströmung. Führen Sie das SDS-PAGE und Färbung wie in den Schritten von 3,17 bis 3,18 zu nennen. </li><li> Bewerten Gel für Proteinbanden Existenz der vorhergesagten Mw nach dem Protein vor-gefärbten Marker. Merge ausgewählt Elutionsfraktionen, dass die entsprechenden Proteine ​​enthalten. </li><li> Dialysieren der fusionierten Proben, um NaCl-Konzentrationen für Größenausschlusschromatographie nötig zu senken. Führen Sie die Dialyse wie in den Schritten 3,21-3,23 gegen Puffer F. genannten </li><li> Konzentrieren Sie sich das Protein Probe mit einem Vivaspin-15 10.000 MWCO zu 8 mg / ml in einer Tischzentrifuge, 4000 Umdrehungen pro Minute. Validate Wunsch Konzentration durch Messung der OD bei 280 nm in Quarz-Küvette. Wenn das Protein zu konzentriert zu verdünnt ist, mit Puffer F und messen Sie erneut. </li><li> Montieren Größenausschlusschromatographie vorverpackten Spalte HiLoad 26/60 Superdex 200, auf FPLC; Die Säule wird mit 3 CV von DDW gefiltertes Wasser. Equilibrated die Säule mit 3 SV Puffer F. </li><li> Wash Injektionsschleife mit 5 ml DDW (zwei Loop-Volumes) durch das gleiche Volumen mit Puffer F. gefolgt Laden nicht mehr als 4 ml der Proteinprobe in die Probenschleife. </li><li> Spritzen Sie die Proteinprobe (Flussrate von 3,5 ml / min) und sammeln Proteine ​​Peak-Fraktionen, wie sie es dem 280nm-Chromatogramm erscheinen. Lassen Sie den Puffer fließen, bis es Säulenvolumen erreicht. </li><li> Wenn das erste Protein Volumen (Schritt 3,23) größer ist als Injektionsschleife, wiederholen Sie die Schritte 3,25-3,26, ohne Waschen der Schleife, bis die gesamte Probe auf der Säule geladen wird. </li><li> Reinigen Sie vor Füllkörperkolonne nach der Herstellung Empfehlung. </li><li> SDS-PAGE-Analyse der gesammelten Fraktionen. Eine solche Analyse sollte mit dem Protein-Peaks Proben durchgeführt werden. Führen Sie das SDS-PAGE und Färbung wie in den Schritten von 3,17 bis 3,18 zu nennen. </li><li> Bewerten Gel: Wenn Protein-Peaks spezifisch sind, in die richtige vorhergesagt Mw nach dem Protein vor-gefärbten Marker und nur eine Bande sichtbar ist verschmelzen ausgewählte eluierten Fraktionen des entsprechenden Proteins. </li><li> Konzentrieren Sie sich Proteinprobe mit einem Vivaspin-15 10.000 MWCO bis&gt; 20 mg / ml in einer Tischzentrifuge, 4000 Umdrehungen pro Minute. Validate Wunsch Konzentration durch Messung der OD bei 280nm. Das gereinigte MamAΔ41 wurde dann auf 26,5 mg / ml für die Kristallisation konzentriert. </li> &lt;li&gt; Bestätigen Probe Reinheit und Identifizierung von Proteinen mittels Matrix-Assisted Laser Desorption / Ionisation (MALDI-TOF). <li> Wenn das Protein nach dem Massenspektrometer und SDS-PAGE gereinigt wird, teilen Sie die konzentrierte MamAΔ41 vor, markierte Eppendorf-Röhrchen, 25-50 ul Protein in jeder. </li><li> Flash in flüssigem Stickstoff und lagern bei 193 ° K. eingefroren </li></ol> 4. Repräsentative Ergebnisse Wenn dieses Protokoll korrekt ausgeführt wird sollte man sich hochreine, Größe homogen und konzentrierte Protein-Proben. Diese Protein-Proben werden dann zur Kristallisation Studien sowie biochemische Untersuchungen, wie Enzymkinetik, Bindungsaffinität und mehr bereit. Hier beschriebenen repräsentativen Ergebnisse der wichtigsten Schritte bei der Reinigung Protokoll. SDS-PAGE-Analyse von Elutionsprofil Ni-NTA-Affinitätssäule sollte hoch offenbaren über exprimierten Proteins in der löslichen Fraktion an geeigneten MW ~ 22kDa (Abbildung 1). Das SDS-PAGE-Analyse sollte auch zeigen, Minimum, wenn jedes Protein in der grenzenlosen Proteine ​​Flow-Through-, Wasch-Flow-Through-und ultra-Zentrifugationspellet Probe. Wenn große Bands des entsprechenden Proteins in diesen Proben nicht erscheinen sollte man überlegen, falsch Puffer Vorbereitung, Probleme in Zellaufschluss oder Probleme in der Kultur-induzierenden Bedingungen und Wachstum. Die Ionenaustauschchromatographie ist vorgeformt, um zwischen unseren wünschenswert Protein zu anderen E. coli-Proteine, die an die Nickel-Harz (zB aufgrund elektrostatischer Wechselwirkungen oder Histidin / negative Aminosäuren reiches Protein-Schleifen) und uncut His-Tagged wünschenswert Protein gebunden waren getrennt. Diese Spalte trennt Proteine ​​nach ihrer Affinität zu positiv geladenen Harz unter zunehmendem NaCl-Konzentrationen. Stark negativ geladenen Proteine ​​werden in höheren NaCl-Konzentrationen eluiert appose zu negativ geladenen moderieren. Die Vorteile dieser Spalte sind hohe Strömungsgeschwindigkeit und Bindungsfähigkeit. Die Ionenaustausch-Chromatogramm (Abbildung 2) zeigt eine gute Trennung zwischen 3 Proteine ​​Populationen in zunehmenden NaCl-Konzentration. SDS-PAGE-Analyse ist notwendig, um MW jeder Population zu bestimmen, die Isolierung des wünschenswertes und Bewertung, ob weitere Reinigungsschritte notwendig sind. Die erste Bevölkerung MamAΔ41 (~ 20 kDa), während die zweite Population ist MamAΔ41 + His Tag (~ 22kDa), die nicht von bovinem Thrombin gespalten und die dritte Bevölkerung ist in SDS-PAGE aufgrund der geringen Konzentration nicht nachweisbar. Wenn die Proteine ​​Peaks nicht getrennt sind klar sollte man überlegen, falsch Puffer Vorbereitung oder Änderung der Steigung der NaCl-Gradienten. Größenausschlußchromatographie ist vorgeformt, um zwischen unseren wünschenswert Protein zu anderen E. coli-Zelle Proteine, die das Ni-NTA-Harz gebunden waren und nicht während der Ionenaustauschchromatographie getrennt zu trennen. Diese Spalte trennt Proteine ​​nach ihrer Größe. Große Proteine ​​werden in kleineren Elutionsvolumen im Gegensatz zu kleinen, die in größeren Mengen eluiert werden eluieren. Die Spalte Chromatogramm (Abbildung 3) zeigt eine gute Trennung der erwünschten Proteins als eine Haupt Bevölkerung. Die Bevölkerung scheint in geeigneten Monomer Größe mit einem Molekulargewicht von ~ 20 kDa eluieren. Die Anwesenheit von ~ 80 kDa-Bande (E.coli typische Protein, das Ni-NTA-Harz bindet) in SDS-PAGE vor Spalte Laden erkannt und verschwindet während dieses Laufes. Da die Konzentration dieser ~ 80 kDa-Protein ist niedrig zu beginnen, ist die Bevölkerung nicht in dem Chromatogramm durch ihre Verdünnung und SDS-PAGE-Analyse ist notwendig, um die Reinigungsleistung zu bestimmen scheinen. Wir empfehlen das Laden einer verdünnten und konzentrierten Probe der Hauptgipfel der SDS-PAGE so dass man sicher bestimmen konnte das Vorhandensein eines reinen Proteins in der entsprechenden MW. Zu diesem Zeitpunkt wird das Protein gereinigt und seine Homogenität sollte durch MALDI-TOF ausgewertet werden. Diese Analyse zeigte, ein Protein in MW 20347 Da und ein weiteres in Mw von 10176 Da (Abbildung 4). Die ~ 10 kDa-Protein ist die ~ 20 kDa Protein berechnet verdoppelt. Die prognostizierte MW MamAΔ41 mit den 9 Aminosäuren nach His-Tag Entfernung links war 20596,5 Da. Durch Vergleich mit den erhaltenen MALDI-TOF MW fanden wir, dass sie 248 Da voneinander entfernt sind. Diese Verschiedenheit kann von MALDI-TOF Messfehler und / oder durch gemeinsamen Abbau der ersten Methionin und Glycin die zweite Folge. Zum Schluss wird das Protein hoch gereinigt und kann für weitere Experimente verwendet werden. <img src="/files/ftp_upload/1844/1844table.jpg" alt="Tabelle 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Tabelle 1"> Tabelle 1. Buffer Formulierungen. <img src="/files/ftp_upload/1844/1844fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Vertreter SDS-PAGE-Analyse von Ni-NTA-Säule Reinigung Von rechts nach links;. P-Ultrazentrifuge Pellet (3,11 Protokoll Schritt), W-wash (3,12 Protokoll Schritt), U-unbounded Proteine ​​(3,10 Protokoll Schritt), E- fünf Bahnen der Elution samples (3,14 Protokoll Schritt), M - Protein-Marker (Zahlen geben MW). Der Pfeil zeigt MamAΔ41. <img src="/files/ftp_upload/1844/1844fig2.jpg" alt="Abbildung 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. Die Analyse der Ionenaustauschchromatographie Schritt (a) Ionenaustauscher (MonoQ Spalte) Chromatogramm; Blue - Absorption 280 nm, stellt Proteinkonzentration, Green-NaCl-Konzentration, Red - Anzeige der Fraktionen gesammelt. (B) Repräsentative SDS-PAGE-Analyse der Ionenaustausch Reinigungsschritt. Von links nach rechts; M - Protein-Marker (Zahlen geben Mw), A6 - erste Peakfraktion, A8-Sekunden-Peak-Fraktion. <img src="/files/ftp_upload/1844/1844fig3.jpg" alt="Abbildung 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 3"> Abbildung 3. Größenausschlußchromatographie Analyse (a) Größenausschlußchromatographie (Superdex 200-Säule) Chromatogramm; Blue - Absorption 280 nm, stellt Proteinkonzentration, Red Angabe der Fraktionen gesammelt. (B) Repräsentative SDS-PAGE-Analyse von Size Exclusion Reinigungsschritt. Von links nach rechts; M-Protein-Marker (Zahlen geben MW), Prei-pre-injizierten Probe, A4-6 kombiniert Fraktion aus der ersten Spitze gesammelt, A4-6D-verwässert-Fraktion aus der Spitze gesammelt. <img src="/files/ftp_upload/1844/1844fig4.jpg" alt="Abbildung 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 4"> Abbildung 4. Matrix-Assisted Laser Desorption / Ionisation (MALDI-TOF)-Massenspektrum des gereinigten MamAΔ41. Die Matrix ist Sinapinsäure (SA). MamAΔ41 bei 20347 Da gezeigt, auch gezeigt, ist das doppelt geladene Spezies von MamAΔ41 bei 10176 Da.

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Proteinreinigung ist der wichtigste Schritt in jedem Proteine ​​biochemische oder strukturelle Untersuchungen. Da jedes Protein ist einzigartig mit seinen eigenen Verhaltens, braucht man, um seine Eigenschaften zu definieren und ändern ihre Reinigung entsprechend. Zielprotein sollte als ein erster Schritt zur Reinigung mit bioinformatischen Methoden analysiert werden. Sie werden verwendet, um das Ziel iso-elektrischen Punkt zu berechnen, bewerten ihre Notwendigkeit für reduzierende / oxidierende Umwelt und ihrer Notwend...

<table><tbody><tr><td>Frühlingpresse</td><td>Ausstattung</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>FA-078A</td><td></td></tr><tr><td>Druckzelle</td><td>Ausstattung</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>FA-032</td><td></td></tr><tr><td>Ultrazentrifuge</td><td>Ausstattung</td><td>Sorvall, Thermo Scientific</td><td>Discovery 90SE</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifugenrotor</td><td>Ausstattung</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>Ti60</td><td></td></tr><tr><td>Ultrazentrifugenröhrchen; PC-Flasche+Verschluss-Assay 26,3 ml</td><td>Ausstattung</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>BC-355618</td><td></td></tr><tr><td>Glas-Säule für Chromatographie, 2,5 cm Durchmesser, Econo-Column</td><td>Ausstattung</td><td>Bio-Rad</td><td>737-2521</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA His-Bind-Harz</td><td>Ausstattung</td><td>Novagen, EMD Millipore</td><td>M0063428</td><td></td></tr><tr><td>Spektrophotometer</td><td>Ausstattung</td><td>Amersham</td><td>Ultraspec 2100 pro</td><td></td></tr><tr><td>Quarzküvette</td><td>Ausstattung</td><td>Hellma</td><td>104-QS</td><td></td></tr><tr><td>Schnelle Hochleistungsflüssigkeitschromatographie – AKTA purifier 10</td><td>Ausstattung</td><td>GE Healthcare</td><td>28-4062-64</td><td></td></tr><tr><td>Ionaustauschsäule &amp;#8211; MonoQ 4,6/100 PE</td><td>Ausstattung</td><td>GE Healthcare</td><td>10025543</td><td></td></tr><tr><td>Vorgepackte Größenausschluss-Säule – HiLoad 26/60 Superdex 200</td><td>Ausstattung</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1071-01</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifalkonzentrator – Vivaspin15 &amp;#8211; 10.000 MWCO</td><td>Ausstattung</td><td>Sartorius AG</td><td>VS1501</td><td></td></tr><tr><td>Tischzentrifuge</td><td>Ausstattung</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>IEC CL30R</td><td></td></tr><tr><td>MALDI-TOF</td><td>Ausstattung</td><td>Bruker Corporation</td><td>Reflex IV</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl (Hydroxymethyl)aminomethan</td><td>Reagenz</td><td>BioLab</td><td>20092391</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td>Reagenz</td><td>FRUTROM</td><td>235553470</td><td></td></tr><tr><td>Imidazol</td><td>Reagenz</td><td>Alfa Aesar</td><td>288-32-4</td><td></td></tr><tr><td>EDTA-freie Proteaseinhibitorcocktails</td><td>Reagenz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-8849</td><td></td></tr><tr><td>DNase I (Desoxyribonuclease I)</td><td>Reagenz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DN-25</td><td></td></tr><tr><td>Rinderthrombin</td><td>Reagenz</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP25432</td><td></td></tr><tr><td>Glycin</td><td>Reagenz</td><td>BioLab</td><td>07132391</td><td></td></tr><tr><td>Natriumlaurylsulfat (SDS)</td><td>Reagenz</td><td>BioLab</td><td>19822391</td><td></td></tr><tr><td>Beta-Mercapto&amp;#8211;ethanol</td><td>Reagenz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M-3148</td><td></td></tr><tr><td>InstantBlue</td><td>Reagenz</td><td>Expedeon</td><td>1SB01L</td><td></td></tr><tr><td>PageRuler vorgefärbte Proteinladder</td><td>Reagenz</td><td>Fermentas</td><td>SM0671</td><td></td></tr></tbody></table>

die reinigung des m. magneticum stamm amb-1 magnetosom assoziierten protein mamaΔ41

Purification of the M. magneticum Strain AMB-1 Magnetosome Associated Protein MamA&Delta;41

Magnetotaktische Bakterien umfassen eine heterogene Gruppe von aquatischen Mikroorganismen, die in der Lage, sich entlang geomagnetischen Feldern orientieren werden. Dieses Verhalten wird angenommen, dass die Suche nach geeigneten Umgebungen Hilfe<em&gt; (1)</em&gt;. Diese Fähigkeit der Magnetosomen verliehen wird, Bläschen eine subzelluläre Organelle, die aus einer linearen Kette Montage von Lipid besteht jeder in der Lage, biomineralize und legen Sie ein ~ 50-nm-Kristall von Magnetit oder Greigit. Eine Hauptkomponente der Magnetosomen, die nachweislich für die Bildung von funktionalen Vesikeln erforderlich war, ist Mama. Mama ist eine sehr reichliche Magnetosomen-assoziierten Protein, das eine der am besten charakterisierte Magnetosomen-assoziierten Proteinen ist<em&gt; In vivo</em&gt;<em&gt; (2-6)</em&gt;. Dieser Artikel konzentriert sich auf die Reinigung von Mama, die, obwohl sie studiert<em&gt; In vivo</em&gt;, Haben keine klaren funktionellen oder strukturellen Details für sie identifiziert worden. Bioinformatik Analyse ergab, dass Mama ein Tetra-tricopeptide wiederholen (TPR), die Protein ist. TPR ist ein Strukturmotiv als solches oder als Teil eines größeren fach in einer Vielzahl von Proteinen gefunden, es dient als Vorlage für die Protein-Protein Interaktionen und vermittelt Multi-Protein-Komplexe<em&gt; (7)</em&gt;. TPRs sind in vielen wichtigen Aufgaben in eukaryotischen Zellorganellen Prozesse und vieler bakterieller Signalwege beteiligt<em&gt; (8-14).</em&gt; Um Mama zu verstehen, ein einmaliges TPR enthält Eiweiß, ist hoch gereinigtes Protein in einem ersten Schritt erforderlich. In diesem Artikel präsentieren wir Ihnen die Reinigung Protokoll für eine stabile Mama Deletionsmutante (MamAΔ41) aus<em&gt; M. magneticum</em&gt; AMB-1.

Mama ist eine einzigartige Magnetosom assoziierten Protein, das nachweislich in Magnetosomen Aktivierung beteiligt sein sollte. Hier präsentieren wir die Aufreinigungsprotokolls von Mama Deletionsmutante (MamAΔ41) aus<em&gt; M. magneticum</em&gt; AMB-1.

Die Reinigung des M. magneticum Stamm AMB-1 Magnetosom assoziierten Protein MamAΔ41

Magnetotaktische Bakterien umfassen eine vielfältige Gruppe aquatischer Mikroorganismen, die in der Lage sind, sich entlang geomagnetischer Felder auszurichten. Dieses Verhalten ist ...

Der Reinigungsprozess beginnt mit Zellpellets, die das Mame exprimieren. Nach der Membranstörung der Delta-41-rekombinanten Proteinzellen erfolgt die Trennung der löslichen und unlöslichen Fraktion. Um das lösliche rekombinante Protein zu gewinnen, trennt die Affinitätschromatographie das markierte rekombinante Protein von anderen zellulären Proteinen.Die Ionenaustauschchromatographie trennt Mamma Delta 41 von anderen zellulären Proteinen, die nach der Affinitätschromatographie und Größenausschlusschromatographie verbleiben. Die Chromatographie trennt Mamma Delta 41 weiter auf und zeigt ihren oligomeren Zustand. Schließlich wird die Reinheit und Homogenität des rekombinanten Proteins analysiert.Hallo, ich bin Raza, Leiter des XVA-Labors in der Abteilung für Lebenswissenschaften an der Benon-Universität des Negativen. Ich bin Natalie, ebenfalls vom Z-Labor. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Reinigung rekombinanter Proteine.Wir verwenden dieses Verfahren in unserem Labor, um Proteine im Zusammenhang mit Magnetismus zu untersuchen. Beginnen wir also mit dem Protokoll. Das MAME Delta 41 Protein wird als 10 hiss-Fusionsprotein exprimiert.In BL 21 E. coli-Zellen die Zellen in Autoinduktionsmedium, das Epi-Brazilin enthält, bei 310 K drei Stunden lang kultivieren. Anschließend die Kultivierungstemperatur auf 300 K senken und die Zellen 48 Stunden inkubieren lassen. Nach der Inkubation die Zellen durch Zentrifugation gewinnen, den Überstand abgießen und das resultierende Zellpellet wiegen.Aus acht Litern Kultur sollten etwa 60 Gramm feuchter Zellpellet gewonnen werden. Vor der Proteinreinigung bereiten Sie 200 Milliliter Stammösungen von vier molarem Ile, fünf molarem Natriumchlorid und einmolarem Tris HCl, pH 8, vor.Wirbeln Sie die Lösungen unter Verwendung von doppelt destilliertem Wasser oder DDW, bis sie klar sind, und filtrieren Sie sie durch einen 0,22-Mikrometer-Filter. Filtern Sie frisch hergestellte Stammlösungen und Puffer A bis F gemäß dem schriftlichen Protokoll, das diesem Video beiliegt. Um die Proteinreinigung zu beginnen, resuspendieren Sie die Zellen in Puffer A im Verhältnis von 1:2 von Zellmasse zu Puffervolumen.Für jeweils 10 Gramm Bakterien 10 Mikroliter DNA hinzufügen, um eventuelle DNA-Fragmente in der Probe abzubauen. Anschließend ein Milliliter E dt, eine proteasehemmende Cocktailsorte, hinzufügen. Für jeweils 20 Gramm Bakterien die Lösung 20 Minuten auf Eis inkubieren.Nach der Inkubation lyse die Zellen mit zwei Zyklen einer French-Press bei 25.000 PSI. Aufgrund der Temperaturerhöhung sollte der Kolben vor der Verwendung 10 Minuten lang auf Eis gekühlt werden. Überführe die lysierten Zellen in 25-Milliliter-Ultrazentrifugenröhrchen.Füllen Sie die Röhrchen bis zur Halsmarkierung mit Puffer A auf und wägen Sie sie genau aus. Trennen Sie anschließend die Zelltrümmer durch Ultrazentrifugation. Bauen Sie in der Zwischenzeit eine Nickel-NTA-Säule für die Schwerkraftchromatographie auf, indem Sie vier Milliliter Nickel-NTA-Harz auf eine 2,5 cm breite Glas-Säule geben.Bereiten Sie das Harz zur Proteinreinigung gemäß den Anweisungen des Herstellers und der S-Anweisungen vor. Nachdem die Proben zentrifugiert wurden, gießen Sie die lösliche Fraktion aus den Ultrazentrifugenröhrchen über die Nickel-NTA-Säule. Sammeln Sie die nicht gebundenen Proteine in der Durchflussfraktion.Spülen Sie die Säule weiterhin mit 100 Milliliter Puffer B und sammeln Sie den Durchlauf. Bewahren Sie die Durchlauffraktionen bei 277 K auf. Eluieren Sie das Protein in 15 nummerierten 1,5-Milliliter-Einwegröhrchen. Schließen Sie das Säulenventil und geben Sie 1 Milliliter Puffer C auf die Säule.Nach einer Inkubationszeit von drei Minuten öffnen Sie das Ventil und sammeln Sie den Durchlauf. Wiederholen Sie diesen Schritt dreimal. Fahren Sie fort, das Protein in Schritten von einem Milliliter Puffer ohne die dreiminütige Inkubation zu eluieren.Suchen Sie mithilfe eines UV-Spektrophotometers den Proteinpeak in den Fraktionen, indem Sie die optische Dichte bei 280 Nanometern messen. Führen Sie abschließend eine SDS-Page-Analyse der gesammelten Fraktionen durch. Das nicht gebundene Protein fließt durch die Waschung, durchläuft den Durchlauf und wird in einer Ultrazentrifugationspelletprobe aus dem Gel nachgewiesen.Bestimmen Sie, welche Elutionsfraktionen hohe Proteinkonzentrationen aufweisen, und vereinigen Sie die ausgewählten Fraktionen. Um den 10-His-Tag zu entfernen, geben Sie 10 Mikroliter Rinderthrombin pro ein Milligramm Protein zur vereinigten Probe hinzu. Dialysieren Sie anschließend die Probe gegen Puffer D, um überschüssiges Imidazol zu entfernen und die Natriumchlorid-Konzentration zu senken.Zur Vorbereitung der Ionenaustauschchromatographie schneiden Sie ein Dialyse-Schlauchstück mit einer Molekulargewichts-Cutoff von sieben Kilodalton auf die gewünschte Länge zu. Waschen Sie den Schlauch mit DDW und knüpfen Sie an einem Ende einen Knoten, um eine Tasche zu bilden. Überführen Sie die thrombinverdaute Proteiniösung in die Tasche, wobei etwas Platz am oberen Ende verbleiben sollte. Verschließen Sie den Dialyse-Schlauch mit einer Klammer.Die Dialysehülle in vier Liter gekühlte Pufferlösung D eintauchen. Die Lösung langsam über Nacht bei 277 K rühren. Nach der über Nacht durchgeführten Dialyse die Hülle aus dem Becher nehmen. Eine kleine Öffnung schneiden und das Protein in ein 50-Milliliter-Falcon-Gefäß überführen. Die Ionenaustauschchromatographie dient der weiteren Reinigung des Memay-Delta-41-Proteins. Eine vorgefüllte Mono-Q4-0,6/100-PE-Säule an ein FPLC-ACTA-Reinigungssystem anschließen.Waschen Sie die Säule mit fünf Säulenvolumina (CVS) filtriertem DDW und equilibrieren Sie die Säule mit fünf CVS Puffer D. Waschen Sie die Injektionsschleife mit zwei Schleifenvolumina DDW, gefolgt von zwei Schleifenvolumina Puffer D. Geben Sie das Protein in die Injektionsschleife ein. Injizieren Sie die Proteinprobe bei einer Flussrate von einem Milliliter pro Minute und beginnen Sie mit der Sammlung der Fraktionen. Diese werden für die SDS-Page-Detektion ungebundener Proteine verwendet.Setzen Sie das Beladen und Injizieren des Proteins fort, bis die gesamte Probe auf die Säule aufgetragen ist. Waschen Sie die Säule mit drei Säulenvolumina Puffer D. Um nicht gebundene Proteine zu entfernen, eluieren Sie das Protein über einen Zeitraum von 60 Minuten mit einer Geschwindigkeit von einem Milliliter pro Minute unter Verwendung eines linearen Gradienten aus Natriumchlorid, der bei 40 Millimolar beginnt und bei zwei Molaren endet. Sammeln Sie die Proteinfraktionen, sobald sie im Chromatogramm bei 280 Nanometern erscheinen, nachdem 100 % Puffer E erreicht wurde.Reinigen Sie die PrePec-Säule gemäß den Herstellerempfehlungen. Führen Sie eine SDS-Page-Analyse der gesammelten FPLC-Fraktionen durch, einschließlich des ungebundenen Proteins und des Proteingipfels im Durchlauf, unter Verwendung prämarkierter Marker. Bewerten Sie die Proteinbanden, um die Fraktionen zu identifizieren, die das Protein bei dem vorhergesagten Molekulargewicht von Mame enthalten.Die ausgewählten Fraktionen werden zur Vorbereitung der Größenausschlusschromatographie vereinigt. Die Konzentration von Natriumchlorid in den vereinigten Proben wird durch Dialyse gegen Puffer f wie zuvor beschrieben verringert. Nach einer Übernachtdialyse.Verwenden Sie eine Tischzentrifuge, um die Proteinstichprobe mit einem Zentrifugal-Konzentrator mit einer Molekulargewichtsabscheidung von 10.000 zu konzentrieren. Konzentrieren Sie das Protein auf acht Milligramm pro Milliliter bei 4.000 U/min. Überprüfen Sie die gewünschte Konzentration, indem Sie den Extinktionswert bei 280 Nanometern in einer Quarzzelle messen.Bauen Sie die vorgefüllte Superdeck-200-Größe-Ausschluss-Säule mit hoher Belastung 26/60 auf einem FPLC-ACTO-Reinigungssystem auf. Spülen Sie die Säule mit drei Säulenvolumina gefiltertem Wasser und equilibrieren Sie die Säule mit drei Säulenvolumina Puffer F. Spülen Sie die Injektionsschleife mit zwei Schleifenvolumina DDW, gefolgt von demselben Volumen Puffer F. Sobald das FPLC-System gespült und equilibriert ist, geben Sie die Proteinstichprobe in die Injektionsschleife. Injizieren Sie die Proteinstichprobe und beginnen Sie mit der Sammlung der Proteinpeak-Fraktionen, sobald diese im Chromatogramm bei 280 Nanometern erscheinen.Lassen Sie die Pufferlösung fließen, bis das Kolonnenvolumen erreicht ist. Reinigen Sie die vorgepackte Säule gemäß den Empfehlungen des Herstellers. Führen Sie eine SDS-Page-Analyse der gesammelten Fraktionen durch und bewerten Sie das Gel.Das Protein sollte gemäß dem Protein-Prästain-Marker bei der korrekten vorhergesagten Molekularmasse erscheinen, und es sollte nur ein Band sichtbar sein. Vereinigen Sie die reinen Proteinfraktionen und konzentrieren Sie die Proteinprobe mittels eines Zentrifugal-Konzentrators mit einer Molekulargewichts-Cutoff von 10.000 und einem Tischzentrifugen auf über 20 Milligramm pro Milliliter. Überprüfen Sie die gewünschte Konzentration, indem Sie den Extinktionswert bei 280 Nanometern messen.Bestätigen Sie die Reinheit und Identität der MAME Delta 41-Probe mittels Matrix-unterstützter Laser-Desorptions-Ionisation in der Form von MALDI-TOF. Teilen Sie das konzentrierte, gereinigte MAME Delta 41-Protein abschließend in vorbeschriftete Eppendorf-Röhrchen mit einem Volumen von jeweils 25 bis 50 Mikrolitern auf. Die Probe kann in flüssigem Stickstoff schnell eingefroren und bei 193 K gelagert werden. Dieses Protokoll sollte eine hochreine, größenhomogene, konzentrierte MAME Delta 41-Probenprobe liefern. Die SDS-PAGE-Analyse des Nickel-NTA-Elutionsprofils zeigt hohe Konzentrationen des MAME Delta 41-10xHis-Proteins in den Elutionsfraktionen bei etwa 22 Kilodalton.Die SDS-Page-Analyse wird außerdem jegliches Memay-Delta-41-Protein im ungebundenen Protein im Durchlauf der Waschung, im Durchlauf und in der Ultrazentrifugationspelletprobe nachweisen. Falls große Banden um 22 Kilodalton in diesen Proben erscheinen, ist eine Fehlersuche erforderlich. Die Ionenaustauschchromatographie wird durchgeführt, um das MAME-Delta-41-Protein von anderen Proteinen in der Probe mittels Ionenaustausch zu trennen.Bei steigenden Natriumchlorid-Konzentrationen zeigt das Ionenaustausch-Chromatogramm eine gute Trennung zwischen zwei Proteinpopulationen unter zunehmender Natriumchlorid-Konzentration. Die Konzentrationsanalyse der Proben mittels SDS-Gelelektrophorese zeigt das molekulare Gewicht jeder Population. Der erste Peak ist MAME delta 41, während der zweite Peak das MAME delta 41 10 hiss Protein darstellt, das nicht durch Rinderthrombin gespalten wurde.Wenn die Ionenaustauschchromatographie nicht zu vollständig aufgelösten Proteinspitzen führt, überprüfen Sie die Pufferherstellung und die Steigung des Natriumchlorid-Gradienten. Der letzte Schritt der MAME delta 41-Reinigung ist die Größenausschlusschromatographie. Das Chromatogramm zeigt eine einzelne Spitze, die bei 20 Kilodalton eluiert.Die geeignete Monomergröße des MAME Delta 41 Proteins wird mittels MALDI-TOF überprüft, um das gereinigte MAME Delta 41 Protein zu verifizieren. Diese Analyse zeigt zwei Spezies, eine repräsentiert das einfach geladene Protein bei 20.347 Dalton und die andere das doppelt geladene Protein bei 10.176 Dalton. Das vorhergesagte molekulare Gewicht für das rekombinante MAME Delta 41 Protein nach Entfernung des His-Tags beträgt 20.597 Dalton.Der geringe Unterschied von 250 Dalton könnte auf den gemeinsamen Abbau der ersten Methionin-Gruppe in der zweiten Glycin-Gruppe zurückzuführen sein. Die Ergebnisse zeigen ein hochgereinigtes MAME delta 41 Protein. Es kann für weitere Experimente verwendet werden.Wir haben Ihnen soeben gezeigt, wie man ein rekombinantes Silbenprotein reinigt. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, die Puffer an Ihre spezifischen Proteine anzupassen und die Experimente so schnell wie möglich durchzuführen. Damit ist alles gesagt.Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Das Video erklärt eine Methode zur Reinigung von B-Zellen durch immunomagnetisches Targeting und Trennung von der Suspension der mononukleären Zellen des peripheren Blutes. Bei der Methode werden unerwünschte Zelltypen mit spezifischen Antikörpern oder Liganden (die an magnetische Partikel gebunden sind) markiert, die auf bestimmte Zelloberflächenproteine abzielen, die durch magnetische Trennung aus der heterogenen Zellsuspension entfernt werden sollen.

Negative immunomagnetische Selektion: Eine Methode zur Aufreinigung von B-Zellen aus mononukleären Zellen des peripheren Blutes

In diesem Video demonstrieren wir ein Verfahren zur Isolierung von Exosomen aus Ziel-Bioflüssigkeiten mit magnetischen Mikrokügelchen. Das Verfahren ermöglicht die schnelle Erfassung von Exosomen, die für die nachgelagerte Analyse verwendet werden können.

Magnetbead-basierte Exosomenextraktion: Eine Technik zur Isolierung spezifischer Exosomen aus Bioflüssigkeiten

In diesem Video beschreiben wir ein Protokoll zur Isolierung von CD11b-Zellen, einschließlich Mikroglia, aus Mäuse-Welpengehirnen mittels magnetisch aktivierter Zellsortierung. Das Hirngewebe wird homogenisiert, um Einzelzellsuspensionen zu erhalten, die mit Anti-CD11b-Antikörpern beschichteten Mikrokügelchen inkubiert werden, gefolgt von einer magnetischen Säulentrennung, um die CD11b+-Zellpopulation zu reinigen.

Magnetische Isolierung von Mikroglia aus dem Gehirn von Maus-Welpen

Wir demonstrieren eine Methode, um magnetotaktischen Bakterien (MTB), die natürlichen Gewässern angewendet werden können sammeln. MTB isoliert und angereichert werden von Sedimentproben mit einem relativ einfachen Setup, das zu Nutze macht die Bakterien die natürlichen Magnetismus. Isolated MTB können anschließend im Detail sowohl mit Licht-und Elektronenmikroskopie untersucht werden.

Collection, Isolierung und Anreicherung von natürlich vorkommenden Magnetotaktische Bakterien aus der Umwelt

Dieser Vorgang zeigt, wie aus dem erwachsenen Gehirn der Maus die Mitochondrien-assoziierte ER Membranen oder MAMs und den Glykosphingolipid angereicherten Mikrodomänen Fraktionen aus MAMs und mitochondrialen Vorbereitungen zu isolieren.

Mitochondrien-assoziierte ER Membranen (MAMs) und Glycosphingolipid Angereichert Mikrodomänen (GEM): Isolation aus Mäusehirn

Exosomen sind mikrovesikuläre Strukturen, die in Bioflüssigkeiten vorkommen und möglicherweise wichtige krankheitsdiskriminierende Biomarker tragen. Hier wird eine neuartige Methode verwendet, um Exosomen spezifisch zu extrahieren und die exosomale Fracht für beide RNA/Protein-Ziele nach dem Aufschluss von Exosomen mit ungleichmäßigen elektrischen zyklischen Rechteckwellen schnell zu testen.

Der Nachweis von exosomalen Biomarker von Electric Field-induzierte Freisetzung und Messung (Efirm)

Ein Protokoll für die Synthese und Kationisierung von Kobalt-dotiertem Magnetoferritin wird vorgestellt, sowie eine Methode zur schnellen Magnetisierung von Stammzellen mit kationisiertem Magnetoferritin.

Synthese von kationisiertem Magnetoferritin für ultraschnelle Magnetisierungs von Zellen

Dieses Manuskript beschreibt die effiziente, nicht-virale Abgabe von miR-Zellen durch einen PEI / MNP-Vektor und ihre Magnetisierung an Endothelzellen. Somit kann zusätzlich zu genetischer Veränderung, ermöglicht dieser Ansatz für die magnetische Zellführung und MRI Nachweisbarkeit. Die Technik kann verwendet werden, um die Eigenschaften von therapeutischen Zellprodukten zu verbessern.

Vorbereitung und<em&gt; In Vitro</em&gt; Charakterisierung von Magnetized miR-modifizierten Endothelzellen

Die hier beschriebene Methode ist eine neue Vesikel Isolierung Protokoll, das für die Reinigung von den zellulären Kompartimenten ermöglicht dem exogene Antigenen durch endoplasmatische Retikulum verbundenen Abbau in Kreuz-Präsentation verarbeitet werden.

Reinigung der Membran-Fach für endoplasmatische Retikulum-assoziierten Abbau von exogenen Antigenen in Kreuz-Präsentation

In dieser Arbeit beschreiben wir eine magnetische Separations-gestützte Hochgeschwindigkeits-Homogenisierungsmethode für die großtechnische Produktion von Endosomen-abgeleiteten Nanovesikeln als eine neue Art von Exosomen-Mimikern (EMs), die den gleichen biologischen Ursprung und die gleiche Struktur, Morphologie und Proteinzusammensetzung von nativen extrazellulären Vesikeln (EVs) aufweisen.

Ein magnetabscheidungsunterstütztes Hochgeschwindigkeits-Homogenisierungsverfahren für die großtechnische Herstellung von Endosomen-abgeleiteten Vesikeln

Dieses Protokoll beschreibt eine magnetische perlenbasierte Sortiermethode, bei der phycoerythrin-(PE)-markierte Flusszytometrie-Antikörper und Anti-PE-Mikroperlen verwendet werden, um spezifische mesenchymale Stammzellsubpopulationen mit hoher Postsort-Zielmarker-Positivität und erhaltener CCK-8-basierter Proliferation/Stoffwechselaktivität unter den getesteten Bedingungen zu isolieren, ohne teure Zellsortierer oder zielspezifische individuelle Perlen zu benötigen.

Isolierung und Validierung von Podoplanin-positiven mesenchymalen Stammzellsubpopulationen mit einer indirekten magnetischen Perlenstrategie

Erfahren Sie die Reinigung von MamAΔ41 aus Magnetospirillum magneticum AMB-1 mittels Affinitäts-, Ionenaustausch- und Größenausschlusschromatographie. Dieses Protokoll ermöglicht die Analyse magnetosom-assoziierter Proteine.

Die Reinigung des M. magneticum Stamm AMB-1 Magnetosom assoziierten Protein MamAΔ41

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