Multielektroden Array Recordings der Vomeronasal Epithel

Planare Multi-Elektroden-Arrays werden für die Aufzeichnung aus dem UL-Nasenorgan verwendet. Das VNO wird aus der Maus entfernt, so dass das Neuroepithel intakt bleibt. Zuerst wird die VNO-Kapsel aus der Maus entfernt.

Dann wird das Neuroepithel aus der knöchernen Kapsel, dem Blutgefäß und der Basallamina isoliert. Das Gewebe wird mit der dendritischen Noppenseite nach oben in die MEA gelegt. Sobald dieser Aufbau abgeschlossen ist, verwenden wir einen Roboterarm, um dem Gewebe flüssige Reize zu verabreichen.

Hallo, ich bin Hannah Arnon aus dem Labor von Tim Wholly in der Abteilung für Anatomie und Neurobiologie an der Washington University School of Medicine. Ich bin Cheyenne Fu, auch aus dem Heiligen Labor. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Multi-Elektroden-Array-Aufnahme des V-Nasenorgans.

Wir verwenden dieses Verfahren in unserem Labor, um die sensorischen Eigenschaften oder Rezeptorneuronen im akzessorischen System zu untersuchen. Also lasst uns loslegen. Elektrische Aufzeichnungen werden mit einem planaren Multi-Elektroden-Array oder MEA mit 10 Mikrometer flachen Titannitrid-Elektroden erhalten, die mit Siliziumnitrid isoliert sind.

60 Elektroden sind in zwei Feldern angeordnet, die aus einem Fünf-mal-Sechs-Raster mit einem Mittenabstand von 30 Mikrometern bestehen. Mit Hilfe eines Verstärkers MEA 10 60 werden die elektrischen Signale verstärkt. Bei 10 Kilohertz sind 1000-fache Signale erforderlich.

Unter Verwendung einer Datenerfassungskarte und einer benutzerdefinierten Datenerfassungssoftware wird das Gewebe durch ein Nylonnetz auf dem MEA gehalten, das an einem speziellen Einsatz befestigt ist, der eng in die Kultur passt. Um die MEA zu bringen, jetzt, da wir die Messungen gesehen haben, sehen wir uns an, wie man die VNO-Dissektion durchführt. Füllen Sie die MEA-Vertiefung vor der Dissektion mit Rinderserumalbumin oder BSA, spülen Sie die MEA mit warmer, blasenförmiger Ringerlösung ab und legen Sie sie auf Eis.

Zur Vorbereitung der Dissektion werden zwei 60 x 15 Millimeter große Petrischalen mit Blasenklingellösung gefüllt und auf Eis gelegt. Füllen Sie außerdem zwei gleich große Petrischalen mit Schwellerschutz beschichteten Petrischalen mit Ringerlösung und legen Sie sie auf Eis. Kühlen Sie weitere 50 Milliliter Blasenringe, um sie während der Dissektion zu verwenden.

Beginnen Sie mit einer geopferten Maus, indem Sie beidseitige Schnitte von der Seite des Mundes machen, die parallel zur Kieferlinie zum Hinterkopf verlaufen. Verbinden Sie die beiden Schnitte entlang des Nackens und entfernen Sie den dorsalen Teil des Kopfes, wobei der Unterkiefer mit einer feinen Schere an der Maus befestigt bleibt. Schneiden Sie zwischen dem Gewebe und beiden Seiten des Oberkieferknochens, um das Gewebe vom Knochen zu trennen.

Als nächstes entfernst du mit einer Pinzette Nummer drei das Gaumengewebe und legst die Nasenhöhle mit einer kleinen Schere oder einem Skalpell frei, das zwischen und auf beiden Seiten der oberen beiden Vorderzähne geschnitten ist, um die verletzliche Nasenkapsel mit einer Pinzette Nummer drei vom Knochen zu befreien. Nehmen Sie die verletzliche Nasenkapsel am flachen Knochen auf und legen Sie sie in die Petrischale auf Eis. Die vorhergehenden Schritte durch Eintauchen des VNO in gekühlte Klingeltöne sollten in weniger als drei Minuten durchgeführt werden.

Um Gewebetod zu verhindern, stellen Sie die Schale unter ein Stereomikroskop, das mit reflektiertem Licht beleuchtet wird. Verwenden Sie die Pinzette Nummer drei, um die knöcherne Kapsel jeweils von einem VNO zu entfernen. Verwenden Sie eine Hand, um die knöcherne Kapsel zu stabilisieren, indem Sie sie vom Coddle-Ende greifen, und die andere Hand, um den Knochen vom VNO abzulösen, wobei Sie darauf achten, dass der VNO nicht beschädigt wird.

Sobald der Knochen entfernt ist, geben Sie das v und o in eine mit Zigarren überzogene Petrischale. Verwende die restliche Schale für den anderen VNO. Schalten Sie die Beleuchtung mit einer Mikroschere auf Durchlicht um.

Oder die Nummer fünf Pinzetten. Trennen Sie das VNO vom Blutgefäß, indem Sie entlang des Randes des VNO schneiden. Zu diesem Zeitpunkt haben Sie das neuronale Blatt vollständig vom Blutgefäß getrennt.

Platzieren Sie das VNO mit der Innenseite nach oben mit der Pinzette Nummer drei. Verankern Sie die VO mit einem kleinen Fragment einer teflonbeschichteten Rasierklinge, die mit einer Klemme gehalten wird, am S-Schutz an einer Ecke des Gewebes. Schälen Sie das Neuralepithel von der basalen Lamina und halten Sie die Klinge in einem flachen Winkel von weniger als 30 Grad zur Oberfläche der Schale.

Funktioniert am besten. Mit einer Glaspipette. Übertragen Sie das Stück Neuralepithel von der Schale auf die MEA, positionieren Sie das VNO mit der dendritischen Seite nach oben auf dem Elektrodenfeld.

Entfernen Sie überschüssige Ringerlösung mit einer Pipette und setzen Sie dann den Netzgewebehalter in die Vertiefung des Arrays ein, um das VNO an Ort und Stelle zu halten. Füllen Sie die Vertiefung mit gekühlter Ringerlösung, wobei die Dissektion abgeschlossen ist. Sehen wir uns an, wie man eine Um eine Aufnahmesitzung zu starten, platzieren Sie den MEA in einem MEA 10 60 Verstärker und positionieren Sie die Heizsonde direkt über dem Gewebe, um die richtige Heizung zu bestätigen.

Stimulieren Sie bei der Sondenplatzierung zwei Sekunden lang mit Ringerlösung mit 50 Millimolar Kalium. Passen Sie die Positionierung an, um die Latenz der neuronalen Reaktion auf die Kaliumlösung zu minimieren. Das Gewebe benötigt eine kontinuierliche Superfusion, die durch die Zufuhr von Ringerlösung aus einer HPLC-Pumpe erreicht wird.

Fixieren Sie das Gewebe vor der Aufzeichnung 45 Minuten bis eine Stunde lang mit erhitzter Ringerlösung, damit sich das Gewebe akklimatisieren kann. Die Stimuli werden mit dem Gilson Two 15 Liquid Handler Roboterarm abgegeben. Sie werden präsentiert, indem Injektionen in ein HPLC-Ventil durchgeführt und zwischen Durchfluss und Schleife umgeschaltet werden. Unter der Steuerung der Gilson-Software gibt der Roboterarm die Reize an die Profusionsleitung ab, während die Durchflussrate und der Druck konstant bleiben.

Der Zustand des HPLC-Ventils wird durch eine elektrische Spannung dargestellt, die vom Erfassungsrechner als zusätzlicher Kanal aufgezeichnet wird. Um die Synchronisation mit der neuronalen Aktivität zu gewährleisten, werden elektrische Signale mit einer speziellen Aufzeichnungssoftware auf der Disc gespeichert. Im Folgenden zeigen wir Ihnen einige repräsentative Ergebnisse des VNO-Multi-Elektroden-Arrays. Aufzeichnung.

Dieses Verfahren liefert aufgrund der großen Anzahl an Elektroden große Datenmengen, und die Präparation bleibt in der Regel etwa sechs Stunden stabil. Hier ist ein Beispiel für 400 Millisekunden Daten aus der Hälfte der MEA. Dieses Verfahren ist nützlich bei der Messung der Reaktion der sensorischen Neuronen auf Liganden, hier gezeigt, ist die Reaktion auf 100-fach verdünnten weiblichen Mausurin, der von einer einzigen Elektrode aufgezeichnet wurde.

Der Urin wurde 10 Sekunden lang abgegeben, wie durch den schwarzen Balken angezeigt. Beachten Sie die Zunahme des Feuerns nach der Stimuluspräsentation. Wir haben Ihnen gerade gezeigt, wie Sie Multi-Electro-Array-Aufnahmen auf dem Maus-VNO durchführen, wenn Sie dieses Verfahren durchführen.

Es ist wichtig, daran zu denken, geduldig zu sein. Das war's also. Vielen Dank für Ihr Zuschauen und viel Glück bei Ihren Experimenten.